一种1,3-丙二醇基因工程菌及转化生产1,3-丙二醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种1,3-丙二醇基因工程菌及其混合转化生产1,3-丙二醇的方法，属于生物【技术领域】。本发明通过PCR技术克隆来自短乳杆菌(LactobacillibrevisCICC6239)的1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT基因，构建能高效活性表达1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanedioldehydrogenase,PDOR)的基因工程菌株E.coli-pSE-dhaT，经验证，该重组菌表达的1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活性提高了16倍，利用该工程菌和短乳杆菌混合静止转化甘油，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率可达80.6%。
【专利说明】—种1 ’ 3-丙二醇基因工程菌及转化生产1 ’ 3-丙二醇的方法
[0001]发明【技术领域】
本发明涉及生物工程【技术领域】，涉及一种1，3-丙二醇基因工程菌的构建及其用于混合转化甘油生产1，3-丙二醇的方法。
【背景技术】
[0002]I, 3-丙二醇(1，3-propanediol, I, 3-PD)是一种重要的环保型化工原料，主要是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体，在化工、纺织、食品等领域具有广阔的应用，是国际上公认的六大石化新产品之一。鉴于，化学合成1，3-ro有众多的缺点，因此，以廉价的原材料为底物的生物法就受到了广泛的关注。甘油是1，3-PD生产菌生物转化的天然底物，近年来随着生物柴油产量的增加，预计到2020年，年产生物柴油将达到900万吨，副产物甘油也随之迅速增加(在生物柴油的生产过程中会生成10%的副产物甘油)，从而导致了甘油的价格迅速下滑，为生物法提供了价格低廉的原材料，进一步为生物法取代化学法来生产1，3-ro提供了强劲动力。
[0003]目前生物法生产1，3-PD主要通过生产菌发酵产生，微生物体内甘油代谢生产1，3-PD主要涉及2步酶反应:(1)甘油脱水酶(glycerol dehydratase,⑶Ht)转化甘油为中间产物 3-羟基丙醒(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA) ； (2) 1，3_ 丙二醇氧化还原酶(1，3-propanediol dehydrogenase, PD0R)在 NADH 的作用下催化 3-HPA 生成终产物1，3-PD。有研究显示，在1，3-PD工程菌的发酵过程中，3-HPA往往会大量积累，同时还会生成多种酸性物质，使I3DOR的催化活力受到严重影响，而H)0R活力的下降又会使3-HPA进一步积累，形成恶性循环，并使发酵菌株的生长产生不可逆停止；另外，由于发酵液中的1，3-ro浓度积累会反馈抑制ro0R的催化活力，影响终产物1，3-ro的积累浓度，最终严重影响1，3-PD的产量。因此，作为1，3-PD生产的关键酶和限速酶的I3DOR对1，3-PD的生成起着至关重要的作用。
[0004]本发明利用短乳杆菌将甘油氧化还原为1，3_丙二醇,短乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号=CICC 6239，该菌同时具有关键酶GDHt的编码基因dhaBCE和I3DOR的编码基因dhaT,研究中发现该菌在发酵过程中I3DOR的活力比较稳定，因此，利用基因工程法构建该菌的I3DOR工程菌，将有助于提高1，3-PD的生产。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株具有高1，3_丙二醇氧化还原酶活力的基因工程菌疋cW1-pSE-ofe^，工程菌所涉及的编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因序列已提交并保存于GenBank数据库，其编号为KF250355，序列如下:
I ATGGCTGAAC GTAGTTATGA CTTTCTGATG CCCAGCGTCA ATTTCTTTGG CCCTGGTGTC
61 ATTAGTAAGA TTGGTGATCG AGCAAAGATG TTAGGGATGA AAAAGCCCGT TATCGTCACG
121 GATAAGTTCC TTGAAGGTTT AAAGGACGGC GCCGTGGAAC AGACTTTGGA TTCTTTAAAG
【权利要求】
1.一种1，3-丙二醇基因工程菌E.C0l1-pSE-dhaT，其特征在于:构建工程菌所用的1，3_丙二醇氧化还原酶基因dhaT来源于短乳杆菌(Lactobacilli brevis CICC 6239),所用表达载体为PSE380，宿主菌为E.coli BL21。
2.权利要求1所述的1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于:所用的1，3-丙二醇氧化还原酶基因序列如下所示:
3.权利要求1所述的1，3-丙二醇基因工程菌的构建，按照下述步骤进行: 据短乳杆菌的1，3-丙二醇氧化还原酶基因序列和表达载体pSE380上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成引物:primerl:5^-AT TTCATGAAAATGCACCACCATCACCATCATGCTGAACGTAGTTATGAC-3'(含 Pag I 酶切位点)，primer2:5^ -CCGGAATTCTTATTCAGCGTCGTAGG-3^ (含 EcoR I 酶切位点)； 以短乳杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因； PCR反应参数:预变性，95 V 2min;变性，94 V 30sec ;退火，59 V 30sec ;延伸:，72 V 90sec ;循环:30个；终止延伸-J2 V IOmin ;最后16°C保温； 所得的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.2Kb的电泳条带，将PCR产物进行PCR纯化用于克隆表达； PCR产物用Pag I和EcoR I双酶切，载体pSE380用Nco I和EcoR I双酶切，凝胶回收酶切产物，16°C过夜连接，转化至E.coli BL21感受态细胞； 重组质粒通过PCR及测序验证。
4.权利要求1所述的1，3-丙二醇基因工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用，其特征在于:1，3-丙二醇基因工程菌E.col1-pSE-dhaT和短乳杆菌混合静止转化甘油高效生产I, 3-丙二醇的应用。
5.根据权利要求4所述的1，3-丙二醇基因工程菌在甘油生产1，3-丙二醇中的应用，其中1，3-丙二醇基因工程菌E.col1-pSE-dhaT和短乳杆菌混合静止转化甘油高效生产1，3-丙二醇的方法按照下述步骤进行: (1)挑取短乳杆菌(Lactobacillibrevis)斜面菌落于种子液培养基,37°C、160 rpm振荡培养16h，0D600为3.0 ; (2)将种子液以体积比2%的接种量接种到扩大培养基，370C、160 rpm振荡培养48h ； (3)将(2)中的发酵液8000rpm，4°C离心10 min，收集菌泥，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用细胞转化液重悬菌体，菌泥与细胞转化液质量体积比为1:1 g/ml ； (4)将上述基因工程菌E.col1-pSE-dhaT接种于LB-Amp (LB-氨苄青霉素)培养基中，37 1:振荡培养过夜，次日以2 %的接种量将0D600为3.0的种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37 °C培养至菌体光密度值约为0.6时，加入IPTG(异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度0.6mmol/L进行诱导表达IOh左右；取一定体积工程菌液8000 rpm, 4°C离心10 min，收集菌泥，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，并将菌泥与0.1 mol/L pH6.8的磷酸钾缓冲液按质量体积比1:lg/ml重悬； (5)将(3)和(4)按体积比1:1混合后进行转化，转化温度为37 0C，160rpm振荡转化48h，4h取样，转化液中得到1，3_丙二醇。
6.根据权利要求5所述的1，3-丙二醇基因工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用，其特征在于其中步骤(1)所述的种子液培养基组成如下:12g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，12g/L牛肉浸膏，16g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2.15g/L柠檬酸铵，1%。吐温80，0.58 g/LMgS04*7H20,0.05 g/L MnS04.4H20，2.0 g/L K2HP04 ;短乳杆菌斜面培养基:12g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，12g/L牛肉浸膏，16g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2.15g/L柠檬酸铵，0.58g/L MgS04*7H20,0.05 g/L MnS04.4H20，2.0 g/L K2HP04，琼脂 15 g/L，其余为水。
7.根据权利要求5所述的1，3-丙二醇基因工程菌在生产1，3_丙二醇中的应用，其特征在于其中步骤(2)所述的扩大培养基组成如下:12g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，12g/L牛肉浸膏，16g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2.15g/L柠檬酸铵，I %。吐温80，0.58 g/LMgS04*7H20,0.05 g/L MnS04.4H20，2.0 g/L K2HP04，甘油 20 g/L，辅酶 B12 25 mg/L，其余为水。
8.根据权利要求5所述的1，3-丙二醇基因工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用，其特征在于其中步骤(3)所述的细胞转化液组成如下:甘油40.0 g/L，辅酶B12 25mg/L，其余为水。
9.根据权利要求5所述的1，3-丙二醇基因工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用，其特征在于其中步骤(4)所述的LB-Amp培养基组成如下:胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L, Amp (氨苄青霉素)50 u g/L (终浓度)，其余为水。
【文档编号】C12R1/19GK103789248SQ201410051175
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】齐向辉, 王飞, 邓文颖, 林静, 王旭, 朱婧斐, 罗艳, 王亮, 孙文敬 申请人:江苏大学