一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一株过表达基因工程菌的构建方法及其应用，属于基因工程和微生物发酵【技术领域】。本发明利用PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因fusA,将基因片段连接到过表达载体pDXW-8，然后电转入谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WYOOl/pDXW-8-本发明构建的谷氨酸棒杆菌基因工程菌在摇瓶发酵或发酵罐发酵均可提高氨基酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低氨基酸生产成本。
【专利说明】一株过表达仏y基因工程菌的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株过表达Λ/M基因工程菌的构建方法及其提高氨基酸产量的应 用，属于基因工程和微生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是构建生物体的众多活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基本材料。 氣基酸能够为机体和大脑活动提供能源。构成蛋白质的基本氣基酸有21种，有8种氣基酸 人体不能自身合成，需从食物中获取，为人体的必需氨基酸；另外人体自身合成的精氨酸、 组氨酸不能满足机体的需要，也需要从食物中摄取。氨基酸的平衡和适量供应是人体健康 的基本前提，任何一种氨基酸的缺乏，都会影响免疫系统和其他正常功能的发挥。因此氨基 酸在食品、医药保健、饲料方面有很广泛的应用。
[0003] 目前氨基酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法和微生物发酵法。 蛋白质水解提取法是在酸性条件下，将动植物组织水解，得到各种氨基酸混合物，经分离、 纯化、精制等工序获得所需的氨基酸。但天然蛋白质的氨基酸组分复杂，提取分离难度较 大，故目前生产上较少采用该方法。化学合成法虽然纯度较高，但是反应需高温高压条件， 能耗大，成本高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到了有毒有害有机溶剂的使用，安全性 差，要得到具有营养价值的氨基酸，必须进行光学异构体的拆分。但是这种拆分工艺复杂， 收率又低，一般也不采用。微生物发酵法是利用微生物自身酶系的催化功能，生物合成并过 量积累氨基酸，具有原料成本低，生产周期短，环境污染小和产物纯度高等优点，是一种经 济实用的生产方法。此外，谷氨酸棒杆菌被认为是安全的食品级生产菌株，被广泛用来生产 谷氨酸，赖氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸等，谷氨酸棒杆菌以其生产氨基酸安全性佳，且 产生的氨基酸不被降解的特点，在生产食用和医用氨基酸中具有巨大潜力。国外主要采用 发酵法生产氨基酸，国内的菌种在产量方面还低于世界先进水平，因此通过基因工程技术 选育高产优良菌株，进一步提高氨基酸的产量，具有重要的经济价值和社会意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供过表达Zkd基因提高氨基酸产量的方法及其应用，与出发菌株相比 实例菌株的氨基酸产量得到了显著提高。
[0005] Λ/d基因编码延伸因子EF-G。延伸因子EF-G的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。 EF-G是一种GTP酶，蛋白质合成时，EF-G帮助核糖体在mRNA上易位。作为一种机动蛋白， 驱使着tRNA和mRNA在核糖体上的定向移动。EF-G与转位前复合物的相互作用能够加速转 位的进行，使速度提高1000倍，加速了核糖体的利用效率和蛋白合成速度，可以使编码氨 基酸合成的关键酶大量合成，从而提高氨基酸产量。
[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 一株过表达Λ/M基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(C SwAspecie1S WYOOl/ pDXW-8-/i/y，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO. 2014233。
[0007] 延伸因子EF-G基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/y的构建方法，利用PCR扩增克隆 延伸因子EF-G基因将基因片段连接到[xl] pDXW-8,然后利用电转化的方法转化到 谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d。
[0008] 所述表达载体为诱导型表达载体。所述表达载体中的启动子为tac# ;表达载体的 出发载体为PDXW-8。
[0009] 延伸因子EF-G基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的构建方法，步骤如下： (1) 设计引物扩增/i/y 上游引物:5, -CTAGCTAGCA GAAGGAGTAA ATCGGTGGCT CAAGAAGTGC TTAAG-3'，下划线为 MeI酶切位点； 下游引物：5' -AACCCTCGAG TTAGGAAGCG GTGCCGTTGC-3'，下划线为 ZAoI 酶切位点； (2) 将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用Mel/ZAol双酶切，回收后，将Λ/d和 pDXW-8以6 : 1?3 : 1的摩尔比例，用Τ4连接酶在16°C连接2h，构建重组表达载体 pDXW-8-Λ/·^ (如图 1); (3) 然后将重组质粒pDXW-8-/i/d导入谷氨酸棒杆菌WY001中，在含有卡那霉素 (50 μ g/mL)的LBHIS固体培养基30°C培养48h，筛选转化子； (4) 提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达Λ/d基因的基因工 程菌 WY001 / pDXW-8-Λλ^。
[0010] 本发明中所用到的LBHIS培养基（g/L):胰蛋白胨5，NaCl 5,酵母提取物2. 5,脑 心浸液18. 5,山梨醇91。
[0011] 本发明中的LBHIS固体培养基是：在LBHIS培养基基础上添加I. 5%-2. 0%琼脂。
[0012] 构建的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的应用，在摇瓶培养生产氨基酸。
[0013] 构建的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的应用，在发酵罐生产氨基酸。
[0014] 其生产的氨基酸为L-异亮氨酸及赖氨酸。
[0015] 生物材料样品保藏：一株过表达Λ/d基因工程菌，保藏单位：中国典型培养 物保藏中心，简称CCTCC;地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年5月28日；保 藏编号：CCTCC NO :M2014233 ;分类命名：谷氨酸棒杆菌属乳糖发酵短杆菌亚种WY001/ pDXff-8-fusA ( Corynebacterium glutamicum subspecies lactofermentum ) WY001/ pDXW-8-fusA。
[0016] 本发明的有益效果：本发明提供了能提高氨基酸产量的基因工程菌的构建方法， 属于基因重组技术。该方法包括以下过程：克隆延伸因子EF-G基因Λ/y，利用大肠杆 菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，卡 那霉素抗性筛选转化子，通过PCR进一步确认。本发明构建的谷氨酸棒杆菌基因工程菌摇 瓶发酵及发酵罐发酵均可提高氨基酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率， 从而显著降低氨基酸生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1过表达重组载体构建流程。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1延伸因子EF-G基因工程菌的构建 步骤如下： (1) 设计引物扩增/i/y 上游引物:5, -CTAGCTAGCA GAAGGAGTAA ATCGGTGGCT CAAGAAGTGC TTAAG-3'，下划线为 MeI酶切位点； 下游引物：5' -AACCCTCGAG TTAGGAAGCG GTGCCGTTGC-3'，下划线为 ZAoI 酶切位点； (2) 将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用Mel/ZAol双酶切，回收后，将Λ/d和 pDXW-8以6 : 1?3 : 1的摩尔比例，用Τ4连接酶在16°C连接2h，构建重组表达载体 pDXW-8-Λ/·^ (如图 1); (3) 然后将重组质粒pDXW-8-/i/d导入谷氨酸棒杆菌WYOOl中，在含有卡那霉素 (50 μ g/mL)的LBHIS固体培养基30°C培养48h，筛选转化子； (4) 提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达Λ/d基因的基因工 程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d (所用验证引物同上)。
[0019] 实施例2过量表达EF-G基因工程菌在摇瓶培养生产氨基酸 从保藏菌株WYOOl/ pDXW-8-/i/d的甘油管中划取一环菌液在固态活化培养基上划线， 30°C、培养36 h。利用接种环从活化好的平板上刮取一接种环菌苔转接到装有25mL种子培 养基的250 mL三角瓶中，30°C、200 rpm培养18 h。从培养好的种子液中吸取2. 4 mL菌液 转接至装有23mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30°C、培养6 h时，加入终浓度为I mM异 丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导蛋白表达直至发酵结束（t=72h)。
[0020] 发酵结束发酵液采用HPLC测定氨基酸含量，利用HPLC OPA (邻苯二甲醛）柱前 衍生化法。发酵液12000 rpm离心30 min，上清液转移至一干净EP管中，用5%三氯乙酸稀 释20倍（摇瓶）或40倍（发酵罐），室温放置411，12000印111离心30 1^11，0.22以111水相 针式滤器过滤，此时样品可直接上机检测。色谱柱：Agilent Hypersil ODS 4. 0*250mm (5 μ m)，柱温：40°C。流动相：水相A:无水乙酸钠3.01 g，先溶于水，然后加三乙胺200 μ L， 四氢呋喃5 mL，ddH20定容I L，醋酸调节至pH 7. 2;有机相B :无水乙酸钠3. Olg，ddH20定 容为200 mL，5%乙酸调节至pH 7. 2,然后再加400 mL甲醇（色谱纯）和400 mL乙腈（色 谱纯），流速为I mL/min。样品跑柱子前需进行柱前衍生，衍生完成的样品进入色谱柱进行 梯度洗脱，洗脱程序如下：
【权利要求】
1. 一株过表达Λ/M基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌 /acio/knwitt?) WY001/pDXW-8-/i/5^，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏编号为 CCTCC NO. 2014233。
2. -株过表达Zkd基因的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的构建方法，其特征在于 PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因Λλ^，将基因片段连接到表达载体pDXW-8,然后电转入谷 氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/y ;步 骤如下： (1) 设计引物扩增/i/y 上游引物:5, -CTAGCTAGCA GAAGGAGTAA ATCGGTGGCT CAAGAAGTGC TTAAG-3'，下划线为 MeI酶切位点； 下游引物：5' -AACCCTCGAG TTAGGAAGCG GTGCCGTTGC-3'，下划线为 ZAoI 酶切位点； (2) 将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用Mel/ZAol双酶切，回收后，将Λ/d和 pDXW-8以6 : 1?3 : 1的摩尔比例，用Τ4连接酶在16°C连接2h，构建重组表达载体 pDXff-8-Λ/^ ； (3) 然后将重组质粒？011-8-/^4导入谷氨酸棒杆菌1￥001中，在含有卡那霉素5(^8/ mL的LBHIS固体培养基30°C培养48h，筛选转化子； (4) 提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达Λ/d基因的基因工 程菌 WY001 / pDXW-8-Λλ^。
3. 用权利要求2所述方法构建的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的应用，其特征在于 在摇瓶培养生产氨基酸。
4. 用权利要求2所述方法构建的基因工程菌WYOOl/ pDXW-8-/i/d的应用，其特征在于 在发酵罐生产氨基酸。
5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于生产的氨基酸为L-异亮氨酸及赖氨 酸。
【文档编号】C12N15/77GK104212756SQ201410241622
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】王小元, 赵建勋, 胡晓清, 李颜颜, 尹良鸿 申请人:江南大学