快速检测hla-b*27等位基因的引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，公开了一种快速检测HLA-B*27基因的引物、含有该引物的试剂盒以及采用该引物和试剂盒快速检测HLA-B*27基因的方法。本发明使用了HLA-B*27基因的特异性引物，且采用多重引物的组合设计，完全覆盖了HLA-B*27基因的SNP位点，增强了特异性的结合，更加有效地防止了假阳性的产生。此外，本发明将特异性引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，大大节省了操作时间和工作量，具有快速、简便、准确、直观的特点，在3小时内即可完成整个基因的筛查和分型实验，解决了HLA-B*27基因用于对强直性脊椎炎辅助诊断的问题。
【专利说明】快速检测HLA-B*27等位基因的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及快速检测HLA-B*27等位基因的引物、试 剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC)的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应， 具有调节免疫应答的功能。近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率 与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病人大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和 有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的 诊断、预防和预后判断都有重要意义。
[0003] HLA_B*27基因属于I型MHC基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤其 是淋巴细胞的表面具有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B*27抗原的表达 与强直性脊椎炎有高度相关性，超过90 %的强直性脊椎炎患者其HLA-B*27抗原表达为阳 性，普通人群中仅5-10%为阳性，而强直性脊椎炎由于症状与许多疾病相似而难以确诊，因 此HLA-B*27的检测在病中的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了 强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B*27抗原的表达有着或多或少的相关性， 因此HLA-B*27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。
[0004] 目前HLA-B*27等位基因的检测方法主要有血清学分型、直接测序和引物特异性 扩增等方法。血清学分型的方法由于抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应严重影 响了 HLA分型结果的可靠性。直接测序的方法可以直接得到精确的序列信息，但是检测的 步骤繁琐，费用昂贵，检测周期较长（大于1天），不适合用于疾病辅助快速诊断的需要。 PCR-SSP方法则是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩 增，具有成本低，时间短的特性。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的 方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测HLA-B*27的试剂盒，但目前市面 上的试剂盒涵盖的基因型别较少，许多新出现的HLA-B*27基因检测不出，远远不能满足对 用药安全性的快速、简便、高特异性检测HLA-B*27基因的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的HLA数据库，考虑不同引物 设计的位置、序列、涵盖的等位基因数量等因素，并应用单管多重PCR反应体系，通过一个 反应即实现了基因型别的检测，从而提供了一种快速，简便、高特异性、易标准化地定性检 测HLA-B*27基因的PCR-SSP方法。
[0006] 为此，本发明一方面提供了一种快速检测HLA-B*27基因的引物，其包含SEQ ID NO. 1-5 所示的检测引物 B27F01、B27R01、B27R02、B27R03 和 B27R04。
[0007] 在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 7所 示的内对照引物NCXF和NCXR。
[0008] 本发明另一方面提供了一种快速检测HLA_B*27基因的试剂盒，其包含PCR反应混 合液和Taq酶，所述PCR反应混合液包含如上所述的快速检测HLA_B*27基因的引物，所述 Taq酶的浓度优选为5U/yL
[0009] 在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中快速检测HLA_B*27基因的引物 B27F01、B27R01、B27R02、B27R03 和 B27R04 的浓度均为（λ 5μΜ。
[0010] 在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上 所述的内对照引物。
[0011] 在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均 为 0· 2 μ M。
[0012] 在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含 dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。
[0013] 在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中dNTPs浓度为0. 2mM，染料浓度为 0. 01 %，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1. 5mM，明胶 浓度 0. 001%。
[0014] 本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*27基因的方法，其包含以下步骤：
[0015] 1、提取待检测样品的DNA溶液；
[0016] 2、采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒，以步骤1中提取的DNA溶液作 为模板，进行PCR扩增；
[0017] 3、PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，当内对照条带和HLA_B*27基因条带 同时出现时，表明该基因为HLA-B*27基因阳性，而只出现内对照条带时，则表明该基因为 HLA-B*27基因阴性。
[0018] 本发明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的试剂盒在快速检测 HLA-B*27基因中的应用。
[0019] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明基于PCR-SSP技术开发的HLA-B*27基 因筛查试剂盒，由于使用了特异性引物，且采用多重引物的组合设计，完全覆盖了 HLA-B*27 基因的SNP位点，增强了特异性的结合，更加有效地防止了假阳性的产生，具有快速、简便、 准确、直观的特点，并且实验成本低，仅需微量检材即可完成实验检测所需。同时，本发明的 检测试剂盒可以很直观地根据PCR扩增后电泳条带的有无情况，即可判断HLA-B*27的等位 基因型，从而完成HLA-B*27的快速筛查。
[0020] 此外，本发明将引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，可大大节省实验者的操 作时间和工作量。并且，本发明将等位基因的多对引物混合，完成同时扩增，实现了一个PCR 反应即可完成等位基因的分型，满足了高通量的实验需求，直接得出分型和筛查结果，具有 灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合格DNA样品的情况下，本发明在3小时内即可完成 整个基因筛查和分型实验，解决了 HLA-B*27基因用于对强直性脊椎炎辅助诊断的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1 :HLA_B*27基因阳性样品凝胶电泳图。
[0022] 图2 :HLA_B*27基因随机样品凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0024] 实施例1 :快速检测HLA_B*27基因的引物设计
[0025] PCR引物设计所需要的所有HLA等位基因的数据来源于IMGT/HLA Database (Release 3. 15. 0, 2014-01-17)，具体网址为：http ://www. ebi. nc. uk/ipd/imgt/ hla/。引物设计采用人工方法，设计的引物在頂GT数据库中进行比对，确认该引物能特异 性结合HLA-B*27等位基因。在引物设计过程中，关键是使设计的引物在特定的PCR缓冲体 系环境下，能够特异地扩增HLA-B*27基因，即该引物为一种"具有序列特异性的SSP"。
[0026] 为了采用特异性的PCR-SSP对HLA-B*27基因进行筛查，在HLA-B*27基因 SNP位 点的上游，设计特异性上游引物B27F01 (SEQ ID NO. 1)，在覆盖HLA-B*27基因的所有SNP 位点设计 4 条引物 B27R01 (SEQ ID NO. 2)、B27R02 (SEQ ID NO. 3)、B27R03 (SEQ ID N0. 4)和 B27R04(SEQ ID NO. 5)，以防止 HLA-B*27 基因的漏检。
[0027] 同时，对下游引物的3'端引入了错配碱基的特异性设计，以增强引物扩增的特异 性。
[0028] 为了保证反应体系的正常进行，还设计了一对上下游引物NCXF(SEQ ID N0. 6)和 NCXR (SEQ ID NO. 7)，作为内对照引物。
[0029] 具体设计的引物情况如表1所示。
[0030] 表1.快速检测HLA-B*27基因的引物
[0031]
[0032]
【权利要求】
1. 一种快速检测HLA-B*27基因的引物，其包含SEQ IDNO. 1-5所示的检测引物B27F01、 B27R01、B27R02、B27R03 和 B27R04。
2. 根据权利要求1所述的引物，其进一步包含SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示的内对 照引物NCXF和NCXR。
3. -种快速检测HLA_B*27基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR 反应混合液包含权利要求1所述的快速检测HLA_B*27基因的引物，所述Taq酶的浓度优选 为 5U/μ L。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中快速检测HLA-B*27基因的引物B27F01、 B27R01、B27R02、B27R03 和 B27R04 的浓度均为 0· 5 μ M。
5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中PCR反应混合液中进一步包含权利要求2 所述的内对照引物。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0. 2 μ M。
7. 根据权利要求3至6任一项所述的试剂盒，其中PCR反应混合液中进一步包含 dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料优选为甲酚红。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0. 2mM，染料浓度为0. 01 %，PCR缓 冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1. 5mM，明胶浓度0. 001 %。
9. 一种快速检测HLA-B*27基因的方法，其包含以下步骤： (1) 提取待检测样品的DNA溶液， (2) 采用权利要求1或2所述的引物，或采用权利要求3至8中任一项所述的试剂盒， 以步骤（1)中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增； (3) PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，当内对照条带和HLA-B*27基因条带同 时出现时，表明该基因为HLA-B*27基因阳性，而只出现内对照条带时，则表明该基因为 HLA-B*27基因阴性。
10. 权利要求1或2所述的引物，或者权利要求3至8中任一项所述的试剂盒在快速检 测HLA-B*27基因中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104046695SQ201410292976
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】潘捷, 郑仲征, 孟伟 申请人:上海荻硕贝肯生物科技有限公司