一种非病毒基因载体的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种非病毒基因载体的制备方法，该方法是利用原生细胞模型protocell的技术与方法，用中性脂质囊泡包裹PCR组分液(pDNA模板、聚合酶、引物、dNTPs)，然后进行PCR扩增，得到内部包裹大量DNA片段的protocell液。本发明的在脂质囊泡中扩增DNA片段，使载体中包载的基因拷贝数大大增加，基因转染效率也显著提高；制备脂质载体采用中性磷脂，无正电荷成分，使其毒性明显降低。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种非病毒基因载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于非病毒基因载体的制备【技术领域】，涉及一种以脂质为材料的原生细胞(protocell)模型作为基因载体的制备方法。经配体修饰后，这种基因载体可用作靶向基因传递系统。
技术背景
[0002]随着分子生物学的发展，特别是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明，疾病的基因治疗应运而生，并已发展为当代医学和生物学的一个新的研究领域，被认为是治疗遗传性先天疾病、恶性肿瘤、传染病等最有希望的治疗方案之一。
[0003]转染载体可分为两类:病毒载体与非病毒载体。非病毒基因载体能够克服病毒基因载体的许多棘手问题，如无免疫原性、无遗传毒性、细胞毒性低、成本低等等，是治疗基因体内给药不可替代的传递系统，具有重要的临床实用潜力。目前，非病毒基因载体的研究主要集中在阳离子聚合物或阳性脂质体上，这些正电荷载体能够有效吸附负电性的基因物质。但是，正电荷载体进入体内后，很容易被血液中的吞噬细胞识别、吸附并迅速清除。同时，正电荷会导致血细胞膜去稳定化，造成严重毒性，这都限制了非病毒基因载体的发展。
[0004]磷脂分子能够在水中自发组装成闭合的圆形囊泡，双层膜厚度为4_5nm。磷脂囊泡已经被广泛用于制备protocell模型系统，其与细胞膜非常相似，在不同的pH值与温度下都相对稳定，并且将磷脂制备成细胞大小囊泡的技术很成熟。
[0005]Protocell就是用脂质制备一个闭合囊泡，在其内部包裹生物反应物质，在适合的条件下大量增殖，得到内部浓集核酸或蛋白等生物活性物质的protocell囊泡。并且原生细胞模型(protocell)使用中性磷脂制备，其理化性质与细胞接近，具有良好的生物相容性，将其作为纳米工厂，在内部大量扩增所需的基因物质，并用于靶向基因传递，能同时解决转染效率和毒性问题，实现非病毒载体的高效基因传递。此外，如果用配体对protocell进行修饰，使其具有靶向性，用于基因的靶向传递，在生物医学中将有更广泛运用。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种非病毒基因载体的制备方法，具体是指以原生细胞模型P1tocell作为基因载体的制备方法。先用脂质制备囊泡，将pDNA模板、聚合酶、引物、dNTPs等PCR(Polymerase Chain React1n,聚合酶链式反应)各组分包裹在囊泡中，然后进行PCR扩增，在囊泡内扩增目的DNA片段，使其浓集于脂质囊泡中，得到原生细胞模型protocell ο
[0007]一种以原生细胞模型protocell为基因传递载体的制备方法，通过以下步骤实现:
[0008](I)用薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质囊泡，将PCR组分液包裹在囊泡内。
[0009](2)对脂质囊泡包裹的DNA片段进行PCR扩增:用0.02U/ μ L的DNase I消化除去外水相的PDNA模板，对所得包裹PCR组分液的脂质囊泡进行20个PCR循环，得到protocell模型；在protocell液中加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室温消化脂质囊泡外的DNA片段5分钟。
[0010]步骤(I)中所述的薄膜分散法制备脂质囊泡可以采用以下步骤实现:将磷脂混合后溶于氯仿，氮气吹干，加入PCR组分液，包括PDNA模板、聚合酶、引物和dNTPs ;充分涡旋震荡制备脂质囊泡，冻融3次，聚碳酸酯膜过滤。
[0011]步骤(I)中所述的逆向蒸发法制备脂质囊泡可以采用以下步骤实现:以含有磷脂的氯仿为油相，PCR组分液为水相，按油相与水相的体积比为3:1，将水相加入油相中；充分涡旋震荡成乳状液，旋转蒸发缓慢除去氯仿，制备脂质囊泡液，冻融3次，聚碳酸酯膜过滤。
[0012]上述制备方法制备的非病毒基因载体，通过进一步配体修饰，使其具有特异靶向性，进一步提高转染效率。
[0013]目前的非病毒基因载体多采用阳离子材料，体内转运效率低，毒性明显，而中性电荷材料包载DNA效率低，不能用于基因传递。本发明借用protocell的思路和方法，在脂质囊泡中“生产”DNA片段，使载体中包载的基因拷贝数大大增加，基因转染效率也显著提高。所采用的脂质载体为中性磷脂，无正电荷成分，体内传递效率高而毒性降低。本发明的制备方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是透射电镜观察protocell形态的结果图。
[0015]图2是在protocell中PCR扩增DNA片段后，DNase I酶消化前、后的琼脂糖凝胶电泳对比图。
[0016]图3是在中性或阳性protocell中PCR扩增DNA片段后的琼脂糖凝胶电泳对比图。
[0017]图4(A)为protocell载体转染HEK293细胞的的荧光蛋白表达效率图。
[0018]图4(B)为阳离子DOTAP脂质体与质粒结合后转染细胞的荧光蛋白表达效率图。
[0019]图4(C)为protocell中进行DNA片段扩增后转染细胞的荧光蛋白表达效率图。
[0020]图5是protocell与阳离子脂质体的细胞毒性对比图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1:
[0022]图1为将protocell附着于TEM载样铜网上，经过2%乙酸铀染色3分钟后在TEM下观察，结果可见protecell为200nm左右的类圆形纳米粒。
[0023]实施例2:
[0024]图2中，A为制备protocell后，进行PCR扩增，用TE饱和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂质，水层中的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果可见，protocell中的DNA条带亮度非常高，说明PCR扩增后，目标DNA片段浓集于其中，具有较高浓度。图2中，B为protocell经PCR扩增后，再加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室温消化5分钟，用TE饱和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂质，结果可见，经过酶消化后，protocell中的DNA片段浓度依然较高，说明DNase I酶未能消化其中的DNA片段，protocell能够保护内部的基因物质，使其免受外界消化酶的影响。
[0025]图3中，A为用中性DOPC制备的中性protocell，进行PCR扩增后，经TE饱和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂质后，进行凝胶电泳鉴定表明，其中的DNA条带浓度较高，说明DOPC制备的protocell能够进行PCR扩增，并用作基因传递载体。图3中，B为DOTAP制备的阳性protocell,经PCR、提取电泳鉴定表明，其中没有DNA条带，说明阳性protocell中没有产生DNA片段，不适合用于PCR扩增，不能用作基因载体。
[0026]实施例3:protocell载体的细胞转染效率测定
[0027]将HEK293细胞(I X 15/孔)接种于24孔培养板，过夜培养至细胞贴壁，汇合度为60?80%。将制备好，并经PCR扩增的protocell溶液过滤除菌，稀释成系列浓度(以总脂质分别为10 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、500 μ Μ)，加入细胞中，再加入含10%血清的培养基，使每孔的总体积为500 μ L0以未包裹的PCR扩增液为阴性对照，以DOTAP脂质体为阳性对照。将DOTAP脂质体与pEGFP-Nl质粒按照不同质量比混合、孵育30min，得到复合物。将配好的复合物加入细胞中，每孔DNA的加入量为2 μ g。再加入10%血清的培养基，使每孔的总体积为500 μ L0 37°C CO2培养箱放置12小时，吸去转染液，每孔加入新鲜配置的500 μ L含10%小牛血清的培养基，继续培养48h。吸去培养基，用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。
[0028]图4.A为对DNA片段进行PCR扩增后，直接转染HEK293细胞，结果表明，其绿色荧光蛋白(EGFP)的表达不明显，说明DNA的PCR扩增液不能直接用于基因传递；图4.B为阳离子DOTAP脂质体与质粒结合后转染细胞，结果显示具有一定的EGFP表达；图4.C为在protocell中进行DNA片段扩增后转染细胞，结果表明EGFP表达效率最高，说明protocell能够保护DNA片段，增加DNA被细胞的摄取，提高转基因的表达效率。
[0029]实施例4:protocell与阳离子脂质体的细胞毒性对比图
[0030]将HEK293细胞(5 X 13/孔)接种于96孔培养板，过夜培养至细胞贴壁，汇合度为60?80%。PBS洗涤后加入不同浓度的protocell液，或阳离子DOTAP脂质体，再加入无血清培养基至200 μ L/孔，空白对照组加200 μ L无血清培养基。培养箱中培养12小时，然后移去培养基，加入180 μ L无血清培养基和20 μ L MTT (5mg/mL)溶液，继续培养4h后，加入10yL DMSO每孔，振摇lOmin，酶标仪上，于570nm测定A值。按以下公式计算细胞生存率。
[0031]细胞生存率(％ ) = (A样品/A空白)X 100%
[0032]图5的结果表明随着脂质浓度的增加，protocell的细胞成活率均高于DOTAP脂质体，说明protocell的细胞毒性明显小于DOTAP脂质体。
[0033]上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种非病毒基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)用薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质囊泡，将PCR组分液包裹在囊泡内； (2)对脂质囊泡包裹的DNA片段进行PCR扩增:用0.02U/ μ L的DNase I消化除去外水相的PDNA模板，对所得包裹PCR组分液的脂质囊泡进行20个PCR循环，得到protocell模型；在protocell液中加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室温消化5分钟，去除囊泡未包封的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的薄膜分散法制备脂质囊泡采用以下步骤实现:将磷脂混合后溶于氯仿，氮气吹干，加入PCR组分液，包括pDNA模板、聚合酶、引物和dNTPs ;充分涡旋震荡制备脂质囊泡，冻融3次，聚碳酸酯膜过滤。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的逆向蒸发法制备脂质囊泡采用以下步骤实现:以含有磷脂的氯仿为油相，PCR组分液为水相，按油相与水相的体积比为3:1，将水相加入油相中；充分涡旋震荡成乳状液，旋转蒸发缓慢除去氯仿，制备脂质囊泡液，冻融3次，聚碳酸酯膜过滤。
4.根据权利要求1或2所述制备方法制备的非病毒基因载体的应用，其特征在于，所述的载体通过进一步配体修饰，具有特异靶向性，进一步提高转染效率。
5.根据权利要求3所述制备方法制备的非病毒基因载体的应用，其特征在于，所述的载体通过进一步配体修饰，具有特异靶向性，进一步提高转染效率。
【文档编号】C12N15/10GK104263756SQ201410513142
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】马昆, 张嘉宁 申请人:大连理工大学