一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因在培育耐汞拟南芥中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因merT基因转入拟南芥中并使得这种转基因植物能够具备增加植物抗汞性的作用。所述merT基因序列如序列1所示，其编码的蛋白质序列如序列2所示，将该基因转化拟南芥，获得的转基因植物在含有高浓度Hg的平板上，其抗氧化酶表达量2倍至数十倍不等，根长比非转基因植物提高45％倍以上。本发明的基因可促使植物参与Hg的降解，从而提高了转基因植物的降解Hg的能力，为植物修复Hg污染提供有益的帮助。
【专利说明】-种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因在培育耐汞拟南芥 中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因merT基因转入植物拟南芥 中并使得这种转基因植物具备增加植物抗汞性的作用，属于植物转基因领域。所述汞转运 蛋白基因merT含357个碱基，编码的氨基酸残基118个；所述基因的核苷酸序列如序列1所 示，其编码的氨基酸序列如序列2所示。本发明中来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因merT 采用人工方法合成，转基因植物拟南芥具备较高的抗汞性。
【背景技术】
[0002] 土壤重金属污染是影响人类健康和环境质量的主要问题之一，其中土壤汞污染所 带来的问题已经对水体和农作物造成了严重威胁。汞在土壤中停留时间长，微生物和植物 不能直接对其进行降解，而且还会对作物、农产品及地下水产生二次污染。进入土壤中的无 机汞，在硫酸盐还原菌作用下，转化为甲基汞，通过食物链产生生物放大效应而直接危害到 人类健康。在20世纪80年代，一种以植物忍耐、分解或超量积累某些化学元素的生理功能 为基础，利用植物及而提高修复潜能的植物修复技术受到广泛关注，为重金属污染土壤的 治理提供了较大的发展空间。
[0003] 然而，许多植物具有生长缓慢、生物量低的特点，严重限制了在污染场地实际修复 中的应用。因此识别出对重金属耐性强或富集性高的生物，通过分子生物学等方法鉴别出 控制这些性状的基因，然后将这些基因按设计方案定向连接起来，并在特定的受体细胞中， 与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性，从而提高修复潜能具有重要 应用价值。过表达与金属螯合物的生物合成有关的基因，通过螯合物的不同和螯合物所处 部位的不同，可以提高或降低金属的吸收，提高金属的转运和区室化。依靠基因在植物组织 (根、茎叶、维管束）和细胞内（细胞膜、液泡膜）中过表达金属转运体基因可能提高金属的 吸收、转运，或者区室化的效率。
[0004] 细菌抗汞特性是细菌在环境中汞的压力下形成的一种抗性机制，Mer操纵子是细 菌因环境中的汞达到一定的量时，为适应这种压力而产生的一种机制。MerT是微生物中 Mer操纵子的一部分，它与MerP编码的蛋白参与汞离子由细胞外向细胞内的转运。MerP编 码的蛋白为二聚体，位于细胞周质，MerT编码一个蛋白三聚体，位于细胞膜内，共同构成运 输汞离子由细胞周质到细胞内的通道。目前已有将其应用于烟草等植物的报道，但将其应 用于拟南芥以提高其对汞的耐受性的研究还未见报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供了一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因merT转入拟南 芥中并使得这种转基因拟南芥能够具备增加植物抗汞性的作用。
[0006] 本发明方法所述的假单胞菌汞转运蛋白基因由357个碱基组成，为序列表中的1 号序列，将此基因命名为PamerT。
[0007] 用上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸转化的拟南芥植株，以及该基因在培 育耐汞拟南芥中的应用方法均是本发明需要保护的内容。
【专利附图】
【附图说明】：
[0008] 图la为本发明以pYG8468质粒构建的DNA表达单元的结构示意图，b为对拟南芥 转基因植株进行半定量PCR验证的电泳图（WT为对照，M2、M5和M12分别为三组拟南芥转 基因植株）。
[0009] 图2为Hg处理不同时间后转基因拟南芥和非转基因拟南芥相关抗氧化酶表达量 的变化（CAT1 :过氧化氢酶1基因、CSD1 :Cu-Zn超氧化物歧化酶1基因、PER21 :过氧化物酶 21基因、PER27 :过氧化物酶27基因）。
[0010] 图3为Hg处理不同时间后转基因拟南芥和非转基因拟南芥生长状态和根系重量 的变化（其中a为经Hg胁迫处理的拟南芥根系长度变化，b为处理后拟南芥根系重量变化， c为处理后拟南芥植株生长状态的变化）。
[0011] 图4为Hg处理不同时间后拟南芥不同抗氧化酶活性的变化。
【具体实施方式】：
[0012] 以下结合实施例并附图，对本发明的【具体实施方式】作进一步的详述。
[0013] 实例ImerT基因在拟南芥中的遗传转化：
[0014] 1构建双向启动子CaMV 35S(D35S)，将细菌中获得的merT基因与真核表达双元载 体PYG8468相连转入农杆菌GV3101中。
[0015] 2用与拟南芥转基因相同的花序浸染法将merT基因转入拟南芥中：
[0016] a拟南芥的种植：将拟南芥种子于EP管中消毒后接种于1/2MS培养基上，4°C保湿 黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lu X、18°C、RH为70% 条件下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。每周烧一次1/2 PNS培养液。 当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。转化前将已经开花授粉 的花和种子去除干净。
[0017] b农杆菌菌液的制备：制备已转化好相关质粒的农杆菌菌液，在转化前一天摇瓶 过夜，在转化前将农杆菌菌液浓度在0D1. 2?1. 6之间。用配好的渗透培养基将农杆菌菌 液稀释至0D在0.8左右。
[0018] c拟南芥转化：将农杆菌菌液喷洒拟南芥后立即套袋，隔一周再喷一次。
[0019] d转基因阳性植株的筛选：将收获的转基因种子灭菌后用水将种子铺在含20mg/L Hygromycin的MS培养基上，经Hygromycin筛选后仍然长势良好，株高高者可初步确定为阳 性苗。
[0020] 3将筛选后得到的转基因植株进行PCR验证，再用同样的方法将merT基因转入得 到的转基因植株中。
[0021] 4将经过抗生素筛选得到的拟南芥转基因植株进行半定量PCR验证，设计引物P5 : 5，-TTGGTGGTACTTGGGTCGGTGC-3，和 P6 :
[0022] 5，-CCAGCCAAGGAACAGCCAGCAG-3，扩增，Actin2 作为内参，弓丨物 P3 : 5' -TCGCTGACCGTATGAGCAAAGAA-3'，筛选出包含merT (图1)的拟南芥并进行繁殖。
[0023] 实例2对筛选后得到的拟南芥转基因植株进行重金属耐受性试验：
[0024] 1荧光定量PCR检测转基因拟南芥在Hg胁迫下的抗氧化酶活性的变化
[0025] 选取经半定量验证转基因拟南芥及野生型拟南芥植株（对照）同时接种到 取强化培养基上，每隔0，12,24,36， &11(14811采样用于提取1?隱，设计引物？￡1?21(?15: 5'-TGCGAGAGACGGTATTGTCA-3' , P16 ：
[0026] 5'-TCTCCCAAGTAGCTCCCTC-3')扩增过氧化物酶 21 基因，PER27(P17 :
[0027] 5，-CGCAATGGTTGCACTTGA-3，，P18 :5，-TGAGCGAAAATCGCTGATAA-3，）扩增过氧 化物酶 27 基因，CSD1 (PI 1 :5 ' -TGATGGAACTGCCACCTTCACA-3'，P12 :
[0028] 5' -ATGGCCTCCCTTTCCGAGGT-3')扩增 Cu-Zn 超氧化物歧化酶 1 基因，CAT1 (P7 :
[0029] 5，-CGCCATGCCGAAAAATACCC-3，，P8 :5，-CTTGCCTGTCTGAATCCCAGGAC-3，）扩增 过氧化氢酶1基因，由图2可以看出，转基因拟南芥在处理24小时和48小时后上述抗氧化 酶活性都有显著的提高。
[0030] 2Hg胁迫下拟南芥转基因植株生长状态的变化
[0031] 将转基因拟南芥及野生型拟南芥植株（对照）同时接种到含有10 U mol PHgCh 的培养基中，处理5天后观察拟南芥根系生长状态的变化以及拟南芥植株鲜重的变化，由 图3可以看出，转基因拟南芥在Hg胁迫下的生长状态及根系长度、重量等明显优于对照组。
[0032] 3Hg胁迫下拟南芥转基因植株抗氧化酶活性的变化
[0033] 将转基因拟南芥和野生型拟南芥将冷冻后的拟南芥植株（对照）同时接种到含有 1011111〇117 1取(：12的培养基中，处理0，12,36,48,6011后收集拟南芥植株置于11111501111磷酸 钾缓冲液中（其中包含ImM EDTA and 1% PVP)植株粉碎研磨后用分光光度计测定其过氧 化物酶（P0D)，超氧化物歧化酶（S0D)以及过氧化氢酶（CAT)活性。由图4可以看出，随着 处理时间的加长，转基因拟南芥植株的抗氧化酶活性的变化明显优于对照组。
[0034] 序列表
[0035] 序列 1 :
【权利要求】
1. 一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白的编码基因在培育抗汞拟南芥中的应用，即符合 序列表中序列1的核苷酸序列的基因或编码序列表中序列2蛋白氨基酸序列的蛋白在培育 耐汞拟南芥中的应用。
2. 根据权利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞拟南芥中的应用，其特征在于构建了 双向启动子CaMV 35S(D35S)，将所述的PamerT基因与真核表达双元载体pYG8468相连，转 入农杆菌GV3101中，再采用花序浸染法转入拟南芥中。
3. 根据权利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞拟南芥中的应用，其特征在于将所述 的PamerT基因转入拟南芥中，对转基因拟南芥和未转基因的野生型拟南芥进行汞胁迫处 理，采用荧光定量PCR检测其抗氧化酶表达量的变化以测定其耐汞能力的提高。
4. 根据权利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞拟南芥中的应用，其特征在于对转基 因拟南芥和未转基因的野生型拟南芥进行汞胁迫处理，分析转基因拟南芥生长状态和根系 变化以检测其耐萊能力的提1?。
5. 根据权利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞拟南芥中的应用，其特征在于对转 基因拟南芥和未转基因的野生型拟南芥进行汞胁迫处理，分析转基因拟南芥的抗氧化酶 (CAT、SOD、POD)活性变化以检测其耐汞能力的提高。
【文档编号】C12R1/38GK104450780SQ201410782036
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】汪仁, 徐晟 , 贺佳, 夏冰, 江玉梅, 田开洋, 谈金忠, 徐成华, 严刚, 薛仁忠 申请人:江苏省中国科学院植物研究所