植物抗热基因htt2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物抗热基因HTT2及其应用。本发明公开了能够明显提高植株抗热能力的抗热基因，这些抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。
【专利说明】植物抗热基因 HTT2及其应用
[0001] 本发明是申请号为CN 201110443047. 1的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗热基因 及其应用。
【背景技术】
[0003] 温度逆境是影响蔬菜生产和限制其地域分布的主要因子之一。由于"温室效应"日 益加剧，高温天气出现越来越频繁，尤其是近年来我国长江流域夏季的持续高温，严重制约 粮食作物和果蔬类植物的生长和发育，农业生产面临严峻挑战。近50年中国长江流域共发 生重大水稻热害事件6次。最近一次发生在2003年，保守估计全流域受害面积达3 X IO7公 顷，损失稻谷达5. 18X 107吨[1]。20世纪80年代末，我国南方柑桔产区曾遭受3次大范围 的高温热潮，给果蔬生产造成了巨大的损失。逆境胁迫可以引起植物体内一系列的生理生 化反应：细胞膜透性增大，胞质外渗量增加；膜脂过氧化程度加剧，MDA积累；活性氧含量增 力口。植物体内启动抗氧化酶和非酶抗氧化物质发生应答性反应，以阻止、降低或修复由高温 造成的损伤 [2'3]。由此可见，逆境下的植物并不是被动承受伤害，而是主动的调节适应。正 是对这种逆境的不断适应过程，使植物在长期的进化过程中形成了完善的和复杂抗逆系统 以适应不良环境。因此，对植物抗热机理进行更深入的研究，是认识植物与环境关系和培育 新的抗性品种的重要途径之一，在理论和应用方面都有重要意义。
[0004] 对植物抗热性的研究已成为目前一项重要的研究课题。受到种质资源的限制，传 统育种方法很难在短期内显著改良非耐热作物的抗热性，所以通过重组耐热物种的抗热基 因来实现提高非耐热作物的抗热性是现在研究的重要方向。植物体受到高温等不良环境 胁迫时，体内自身的免疫系统会及时作出应急反应，产生一系列的应急反应，其中热激因子 (Heat Shock factor，HsF)是胁迫诱导过程中的主要转录因子，通过转录激活其下游靶基 因的表达，产生各种各样的酶类，增加了膜脂饱和度，提高了可溶性蛋白和一些保护性细胞 组分的含量，保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受损伤的蛋白质，对植物起保护作用，从而 使植物获得耐热性，提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率 [2'3'4'5]。由于热激因子与 植物抗热性紧密联系在一起，因此热激蛋白及其下游基因的表达调控是当今分子生物学、 蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容。很遗憾的是，对于其靶基因在植物 体内是如何启动并进行抗热生理响应的机制研究尚不清楚。
[0005] 近年来分子生物学研究发展迅速，尤其是基因芯片技术在作物分子育种上的应用 也越来越广泛 [6'7]。其快速、敏感、高效、定量地分析基因的表达变化，满足了对植物抗热基 因进行大通量的筛选需求。因此，本领域有必要以基因技术为平台，筛选在植物中具有抗热 能力的基因，进行植物品种改良，提高植物耐热性，为丰富和平衡我国农作物市场提供抗热 种质资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一类植物抗热基因及其应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种HTT多肽（Heat induced Ja_siR255 Jargets)或 编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。
[0008] 在一个优选例中，所述HTT多肽选自：
[0009] (a)具有SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的多肽；或
[0010] (b)将 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列经过一个或多个（如1-50 个；较佳地1-40个；较佳地1-30个；较佳地1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个）氨基 酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽；
[0011] (C)与 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列具有40% (较佳地50% ; 更佳地60% ;更佳地70 % ;更佳地80% ;更佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98% )以上相 同性，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽。
[0012] 在另一优选例中，所述的编码HTT多肽的多核苷酸选自：具有SEQ ID N0:1，或 SEQ ID NO: 2,或 SEQ ID NO: 3,或 SEQ ID NO: 6,或 SEQ ID NO: 7,或 SEQ ID NO: 9、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 14,或 SEQ ID NO: 16,或 SEQ ID NO: 18、或 SEQ ID NO: 20 所示核苷酸 序列的多核苷酸。
[0013] 在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠 耳芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，选自下组：
[0015] (a)具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
[0016] (b)将SEQ ID NO: 23所示的核苷酸序列中第11-14位核苷酸经过一个或多个（如 1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个）核苷酸的取代、缺失或添加而形成的， 且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或
[0017] (c)将SEQ ID NO: 24所示的核苷酸序列中第236-239位核苷酸经过一个或多个 (如1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个）核苷酸的取代、缺失或添加而形成 的，且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或
[0018] (d)与上述（a)、（b)、（C)中所述核苷酸互补的核苷酸序列。
[0019] 在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。
[0020] 在一个优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳 芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种提高植物耐热性的方法，所述方法包括：提高植物 中HTT多肽的表达或活性；或
[0022] 降低植物中ta_siR255的表达或活性；或
[0023] 提高植物中ta_siR255的靶基因的表达。
[0024] 在一个优选例中，所述的方法包括：将编码HTT多肽的多核苷酸转入植物中；或
[0025] 将所述的多核苷酸转入植物中。
[0026] 在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
[0027] (i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码HTT多肽的多核苷酸 或所述的多核苷酸；
[0028] (ii)将植物细胞、组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述编码HTT多 肽的多核苷酸或所述的多核苷酸转入植物。
[0029] 在另一优选例中，所述方法还包括：
[0030] (iii)选择出转入了所述编码HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸的植物细 胞、组织、器官；以及
[0031] (iv)将步骤（C)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。
[0032] 在另一优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳 芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0033] 在本发明的另一方面，提供一种耐热的植物，其是由前述方法制备获得的转基因 植物。
[0034] 在本发明的另一方面，提供一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作 鉴定植物的耐热性的分子标记物。
[0035] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图认-(：、！11'1'1、！111'2、！111'3、六七4629760 和六衍651670 的表达分析。其中，。1^表示 野生型植株。
[0037] 图ID、HTT1、HTT2、HTT3、At4G29760和AtlG51670以及其它候选基因的聚类关系 分析。
[0038] 图2、HTT1、HTT2和HTT3的序列特征分析。
[0039] A、HTT1、HTT2 和 HTT3 的 mRNA 上均存在 ta-siR255 的结合位点。
[0040] B、MM255过表达载体的构建示意图。
[0041] C、HTTL 1、HTT2 和 HTT3 启动子上均存在 nnGAAnnTTCnnGAAnn 和 AGGGG 基序。
[0042] 图3、HTT1、HTT2和HTT3过量表达的转基因株系热处理实验。
[0043] A-C过量表达的转基因株系热处理后的植株生长情况，各自的左图表示植物生长 情况，右图为左图中各分区所代表的植株的示意图。
[0044] D-G、定量RT-PCR分析mRNA在对照植株以及过表达植株中的积累量。
[0045] 图4A、Ta-siR255前体TASla、TASlb、TASlc在热处理前后的响应。
[0046] 图4B、Ta_siR255在热处理前后的响应。
[0047] 图5A、HTTl和HTT2过表达株系热处理后植株存活率。
[0048] 图5B、HTT3过表达株系热处理后植株存活率。
[0049] 图5C、MM255过表达株系热处理后三个株系存活率。
[0050] 图6、拟南芥中HTT多肽与白菜中相应多肽的同源性预测和分析。
【具体实施方式】
[0051] 本发明人致力于抗热基因的筛选，最终确定了一类能够明显提高植株抗热能力的 抗热基因。这些抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。
[0052] 本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转 化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双 子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括（但不限于）：小麦、大麦、 黑麦、7K稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、搜桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大 豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉 花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦舆、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝 卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡 萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
[0053] 作为一种优选方式，所述的"植物"包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科的植 物。比如，所述的"植物"包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳 芥属植物；禾本科的水稻、小麦、高粱、玉米；此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳 地，所述的"植物"是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。
[0054] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0055] 如本文所用，"HTT多肽"是指来源于拟南芥或其它植物的与序列SEQ ID NO:4、SEQ IDN0:5、SEQIDN0:8、SEQIDN0:11、SEQIDN0:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19*SEQ ID NO:21具有较高同源性（如同源性高于40% ;较佳地高于50% ;较佳地高于60% ;更佳 地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% )的 一类多肽的总称。
[0056] 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……构成"、 "基本上由……构成"、和"由……构成";"主要由……构成"、"基本上由……构成"和"由…… 构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0057] 本发明的多肽（蛋白）可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可 以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细 菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明 的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲 硫氨酸残基。
[0058] 本发明还包括HTT多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍 生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明 的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选 保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗 传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（iii)成熟多 肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来 纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似 物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0059] 任何一种HTT多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物 活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持相应的全长多肽的全部或部分功能。通 常情况下，所述的生物活性片段至少保持40 %的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述 活性片段能够保持全长多肽的50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
[0060] 在本发明中，所述的"HTT多肽"指具有提高植物耐热性功能活性的SEQ ID NO:4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:11序列的多肽。该术语还包括具有与所述多肽相 同功能的、上述序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个）氨基酸的缺 失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳 地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基 酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个 氨基酸通常也不会改变多肽的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。
[0061] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严谨度条件下能与上述蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所 述蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0062] 任何与所述的多肽同源性高的、且具有提高植物耐热性功能的多肽也包括在本发 明内。
[0063] 发明还提供所述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基 酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括 天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变 剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具 有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成 的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表 性的多肽。
[0064] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨 酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0065] 在本发明中，"本发明的多肽的保守性变异多肽"指与SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:5、 SEQIDN0:8、SEQIDN0:11、SEQIDN0:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19*SEQIDN0:21 的氨基酸序列相比，有至多50个，较佳地至多40个，更佳地至多30个，更佳地至多20个， 更佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所 替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0066] 表 1
[0067]
【权利要求】
1. 一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性，所述HTT多肽 选自： (a) SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；或 (b) 将SEQ ID N0:8所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽； (c) 与SEQ ID N0:8所示氨基酸序列具有40%以上相同性，且具有提高植物耐热性功 能的由（a)衍生的多肽。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的编码HTT多肽的多核苷酸选自：SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物是十字花科植物。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的植物选自芸苔属植物或鼠耳芥属植 物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
5. -种提高植物耐热性的方法，所述方法包括：提高植物中HTT多肽的表达或活性，所 述HTT多肽选自： (a) SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；或 (b) 将SEQ ID N0:8所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽； (c) 与SEQ ID N0:8所示氨基酸序列具有40%以上相同性，且具有提高植物耐热性功 能的由（a)衍生的多肽。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码HTT多肽的多核苷 酸转入植物中。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤： (i) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码HTT多肽的多核苷酸； (ii) 将植物细胞、组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述编码HTT多肽的 多核苷酸转入植物。
8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物是十字花科植物。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物选自芸苔属植物或鼠耳芥属植 物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
10. -种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的耐热性的分子标 记物；所述HTT多肽选自： (a) SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；或 (b) 将SEQ ID N0:8所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽； (c) 与SEQ ID N0:8所示氨基酸序列具有40%以上相同性，且具有提高植物耐热性功 能的由（a)衍生的多肽。
【文档编号】C12N15/84GK104497114SQ201410848770
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2011年12月26日 优先权日:2011年12月26日
【发明者】何玉科, 李晓荣 申请人:中国科学院上海生命科学研究院