专利名称：截短的生物活性更高的角质形成细胞生长因子的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及角质形成细胞生长因子(“KGF”)。更具体地说，涉及一个截短的比在昆虫细胞系统中表达的重组全长KGF具有更高的生物活性和较低细胞毒性的KGF片段及其类似物。该KGF片段在本文中称为KGFdesl-23，它缺失了成熟全长KGF N-末端头23个氨基酸残基，该N-末端含有Finch，P.W.et a1.Science245752-755(1989)指明的在N-末端第14到16位氨基酸残基上的一个糖基化位点，以前认为该N-末端使KGF具有上皮细胞专一性。
背景技术：
KGF属于成纤维细胞生长因子(“FGF”)族，本族的典型代表是碱性FGF(“bFGF”)。因此KGF也称为FGF-6。与其它FGF一样，KGF是一种肝素结合蛋白，但区别之处是它具有独特的靶细胞特异性。特别是，FGF通常能刺激从原中胚层或后成中胚层以及神经外胚层衍生而成的各种细胞的繁殖与分化。KGF类似于其它FGF，具有刺激上皮细胞繁殖的能力，但区别在于它不能刺激内皮细胞或成纤维细胞的繁殖，如Finch，P.W.等人所述(在上述引文中)。
已知包括酸生成纤维细胞生长因子(“aFGF”)和碱性成纤维细胞生长因子(“bFGF)在内的成纤维细胞生长因子具有结合肝素特性，并具有诱导早期囊胚中腹中胚层和背中胚层繁殖和分化的能力，如同Gospodarowicz et al.，Cell Biol.Rev.25307-314(1991)和Basilico et al.，Adv.Cancer Res.59115-165(1992)所讨论的。细胞对FGF的反应是通过FGF与细胞表面受体(“FGFR”)的结合而介导的，存在着三种相互联系类型的受体，参见Hou et al.，Science 251665-668(1991)。高亲和力的FGFR是酪氨酸激酶类，包括flg受体(“FGFR-1”)、bek受体(“FGFR-2”)和K Sam受体(“FGFR-3”)，参见Lee et al.，Science24557-60(1989)；Dionne et al.，EMBO92685-2692(1990)；Miki etal.，Science 25172-75(1991)；Miki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89246-250(1992)；Dell et al.，J.Biol.Chem.26721225-21229(1992)。
FGFR-1和FGFR-2在中胚层和神经内胚层组织中广泛表达，2者能以相似的亲和力结合aFGF和bFGF。FGFR-3是上皮细胞特有的一种KGF受体。它是FGFR-2的另一种转录本。FGFR-2对aFGF和bFGF都有很高的亲和力，但对KGF无亲和力，与此相反，FGFR-3对KGF和aFGF的亲和力约是对bFGF的20到1000倍，如同Miki等人和Dell等人(在上述引文中)所讨论的。
KGF的严格限制于上皮细胞的活力分布是合乎需要的，例如，在许多类型的伤口愈合应用中和在表皮过度增生疾病如牛皮癣和基细胞癌的治疗中。目前，除KGF外，还没有很合适的促细胞分裂因子能用于这些应用。因此，从治疗上考虑很有必要对KGF进行修饰以提高其效力和降低其细胞毒性。
近来，Ron等人(J.Biol.Chem.2682984-2988(1993年2月))发现，当KGF163在T7原核表达系统中表达时，可获得一个具有促细胞分裂活力的重组KGF(“rKGF”)多肽。当rKGF分子从成熟KGF163多肽的N-末端分别缺失3、8、27、38和48个氨基酸残基而被截短时，可获得生物活性不同的分子。当分别缺失3个和8个氨基酸残基时，所得分子的促细胞分裂活力不受影响，与全长rKGF(“rKGF163”)一样。然而，当缺失27个氨基酸残基时，促细胞分裂活性下降了10-20倍。当分别缺失38和48个氨基酸残基时，促细胞分裂活力和结合肝素的能力完全丧失。如此，Ron等人未得到任何具有比rKGF163分子更高的促细胞分裂活力的截短的KGF片段。
发明概述本发明的目的之一是提供一个含有成熟全长KGF(KGF163)氨基酸序列一部分的KGF片段，它具有比全长重组KGF(rKGF)增强了至少2倍的促细胞分裂活力。一个特别的目的是提供一个KGF片段，它缺少了包含rKGF163N-末端的头23个氨基酸残基的序列，这23个氨基酸残基是C-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-N-C-S-S-P-E-R-H-T-R-。
本发明的另一目的是提供一个比rKGF163降低了细胞毒性的KGF片段。另一目的是提供一种含有上述KGF片段和一个毒素分子的结合物。毒素分子可以是蓖麻蛋白A、白喉毒素和皂草素中的至少一种。
本发明的另一目的是提供一种治疗组合物，它含有上述的KGF片段和一种药学上可接受的载体，例如适合人皮肤局部使用的载体。
本发明的另一目的是提供一种含有编码上述KGF片段的核苷酸序列的DNA分子。
本发明的另一目的是提供一种含有编码上述KGF片段的DNA分子和该DNA分子表达调控序列的表达载体。该表达载体可以是例如杆状病毒。
本发明的另一目的是提供一种用上述表达载体转化的宿主细胞。该宿主细胞可以是例如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的另一目的是提供一种通过培养上述的转化宿主细胞和从培养液中分离KGF片段而生产KGF片段的方法。
本发明的另一目的是提供一种通过对上皮细胞需要生长的部位施以上述的KGF片段并使该细胞生长而刺激上皮细胞生长的方法。
本发明的另一目的是提供一种通过在需治疗的伤口部位施以上述的治疗组合物并使伤口愈合而治愈伤口的方法。
本发明的另一目的是提供一种在需治疗部位施以上述结合物而治疗表皮过度增生疾病的方法。
本发明的其它目的、特征和优点对本领域普通技术人员是显而易见的，这里就不一一列出。本发明也包括那些对本领域普通技术人员显而易见的上述内容的变化和修改，而这些变化和修改没有实质性地改变该片段、结合物、治疗组合物、载体、宿主的性质和活力以及使用方法。
附图概述
图1示出成熟全长人KGF多肽的氨基酸序列，该序列从N-末端开始，含有163个氨基酸残基，其中在14-16位氨基酸残基处含有一单个N-连接的糖基化信号。
图2示出插入了KGF的163个氨基酸序列的pAcC13表达载体。
图3说明从SF9细胞条件培养基经用1M NaCl在肝素琼脂糖(“HS”)柱中洗脱后进一步纯化本发明的KGF片段。合并从HS柱洗脱的具有生物活性的部分，用10mM Tris，pH7.3缓冲液稀释5倍，然后上Mono S HR5/5阳离子交换FPLC。
图4比较长的(即rKGF163)和短的(即KGFdesl-23)KGF相对于aFGF对Balb/Mk细胞系的生物活性。
图5比较长的(即rKGF163)和短的(即KGFdesl-23)KGF相对于bFGF对得自大血管的血管内皮细胞(AABAE细胞)或得自毛细血管的血管内皮细胞的生物活性。
优选实施方案的详细描述非常惊奇地发现，缺失了rKGF163N-末端的头23个氨基酸残基的截短的、未糖基化的KGF(在这里称为KGF片段或KGFdesl-23)，具有比rKGF163对上皮细胞更高的生物活性和降低了的细胞毒性。一般来说，本发明的KGF片段保留了KGF163刺激上皮细胞增生的专一性。
因此，本发明一个优选的实施方案是一种新的、截短的、未糖基化的KGF片段KGFdesl-23，该片段不伴有那些在体内常伴随天然分子一起产生的杂质。根据该片段在Na Dod SO4/PAGE中作为单峰时的迁移，其表观分子量为约18KDa。纯化的KGFdesl-23对Balb/Mk细胞的比活力大约是2.5×107单位/mg(ED50为40pg/ml)，比以细胞增生法测定的rKGF163或aFGF活力约高7-10倍，比在化学组成确定的培养基中观察Balb/Mk细胞DNA合成起始而进行生物测定时rKGF163的活力高100倍，参见PCT专利申请WO90/08771。
在本发明的另一个优选的实施方案中，KGFdesl-23是通过重组DNA技术生产的，特别是大规模工业生产。在另一优选的实施方案中，本发明的含有KGFdesl-23或其类似物的重组DNA分子和表达载体是按照标准基因表达技术和本领域中熟知的方法制得的。
在另一实施方案中，含有编码KGFdesl-23的DNA或含有该DNA的载体能在细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞表达系统中表达。在一个优选的实施方案中，细菌或酵母细胞表达系统最适于生产KGFdesl-23片段。在另一优选的实施方案中，DNA或载体是在昆虫细胞表达系统中表达的。
本发明的KGF片段可用来鉴别受体识别位点以及设计肽激动剂和拮抗剂。再者，鉴于KGF对角质形成细胞具有独特的专一性，不能诱导血管内皮细胞或成纤维细胞增生且无细胞毒性，在本发明另一实施方案中，KGFdesl-23被优选地用于伤口愈合，特别是需要促进皮肤上皮再生的应用。在一个优选的实施方案中，KGFdesl-23被用于角膜上皮的修复。基于KGFdesl-23对胃肠道上皮细胞的专一性，可以设想出KGFdesl-23的其它用途。
在诸多生长因子如表皮生长因子(“EGF”)、血小板衍生生长因子(“PDGF”)和其它FGF中选择KGF片段用于皮肤修复是本领域的普通技术。其它生长因子除直接或间接刺激角质形成细胞增生外还诱导纤维增生和血管形成。在皮肤修复中，这种附带的活性可导致如瘢痕等不良副作用。在受伤或手术后的角膜修复中，使用其它生长因子可引起血管侵入角膜，结果导致不期望的角膜混浊或水肿。另一方面，KGF对角质形成细胞具有独特的专一性，并且不能诱导血管内皮细胞或成纤维细胞的增生，因此将是一种适合于上述特殊伤口愈合应用的因子。
本发明的KGF片段也能以KGF片段/毒素结合物的形式在本发明的另一实施方案中使用。这种偶联物能减慢和终止因表皮基层角质形成细胞过度增生而引起的疾病如牛皮癣的病理过程。该结合物不影响该组织中另两种主要的细胞类群如血管内皮细胞和成纤维细胞。
在本发明的另一实施方案中，KGF片段/毒素结合物可用于根除肿瘤细胞增生，例如基细胞癌。
除特别指明外，本发明的实施都应用本领域中常规的分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这些技术在文献中有详尽描述，可参考Sambrook，et al.，分子克隆实验室手册，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；DNA克隆第I卷和第II卷，D.N.Glover ed.IRL Press(1985)；寡核苷酸的合成MJ.Gait ed.，IRL Press(1984)；核酸杂交，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.IRL Press(1984)；转录和翻译，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.IRL Press(1984)；动物细胞培养，R.L.Freshney ed.，IRL Press(1986)；B.Perbal，分子克隆实用方法，[出版商](1984)；“酶学方法”系列，Academic Press，Inc.，哺乳动物细胞的基因转移载体，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；酶学方法，Vol.154和Vol.155，Wu and Grossman，and Wu，eds.[Mayer and Walker，eds.[出版商](1987)；细胞和分子生物学中的免疫化学方法，Academic Press，London，Scopes[作者]，(1987)；蛋白质纯化原理和实践，2nd ed.(Springer-Verlag，N.Y.年度)；实验免疫学手册Vols.I-IV，D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.，(出版商)(1986)；Kitts et al.，Biotechniques 14810-817(1993)；Munemitsu et al.，Mol.and Cell Biol.105977-5982(1990)；等等。
氨基酸标准缩写将用于图1和本说明书其它地方。这里所有引用的出版物、专利和专利申请在此引入作为参考。为明确起见，本文所用的术语将更准确地定义如下。
定义本文所用的术语“角质形成细胞生长因子”或“KGF”是指一种属于结构上独特的蛋白族即成纤维细胞生长因子(FGF)的多肽，这些FGF显示了不同程度的序列同源性，表明它们是由一族相关的基因编码的。KGF具有在本说明书其它地方描述的特性，如它能结合FGFR-3并能够刺激表皮细胞特别是角质形成细胞的生长。全长KGF由163个氨基酸残基组成。
如同本文所用，本发明的KGF片段是由成熟的全长KGF中的一部分氨基酸序列组成的多肽。如同本文所用，KGF片段的类似物包括那些因微小的插入、缺失或置换产生的基本不影响KGF片段特性的KGF片段。例如、一些氨基酸间的保守性置换是预料中的。这种置换是(例如)发生在在侧链中相关的一族氨基酸中。这些氨基酸族包括(1)酸生氨基酸天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极生氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(4)不带电极性氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起列为芳香族氨基酸。特别是，一般认为由下列氨基酸间的孤立置换构成的氨基酸保守性置换不会对多肽性质有显著影响由异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸；由谷氨酸置换天冬氨酸；由丝氨酸置换苏氨酸；或者在多肽活性位点以外区域中结构上相关的氨基酸间的类似保守性置换。
KGF片段的特性包括(i)它的生物活性比成熟的全长天然KGF分子在刺激上皮细胞增生方面高2-10倍，优选2倍，最优选的是7-10倍；(ii)它能结合FGFR-3。
本文所用的术语“重组多核苷酸”意为一种半合成或全合成或由cDNA或基因组DNA(“gDNA”)编码的多核苷酸，这样，(1)它不与在天然情况下所结合的多核苷酸的全部或其部分结合(2)它连接在一个并非天然情况下所连接的多核苷酸上；或(3)它不是天然存在的。
“复制子”是指任何基因元件，诸如质粒、病毒、粘粒等等，它们在细胞中表现为一个自主多核苷酸复制单位，即它能在自我控制下进行复制。一个复制子可含有如选择性标记。
“重组载体”是一个复制子，其中连入了另一个多核苷酸片段，从而能复制和/或表达所连入的多核苷酸片段。
“调控序列”是指一个多核苷酸序列，它对与其并列连接的编码序列表达的调控是必需的。这种调控序列的本质因表达编码序列的宿主细胞的不同而不同。在原核细胞内，这种调控序列通常包括如启动子、核糖体结合位点、和/或转录终止序列。在真核细胞内，这种调控序列通常包括启动子和/或转录终止序列。术语“调控序列”也可包括另外一些成份，而这些成份的存在是有好处的，例如一个分泌先导序列可编码先导肽使被表达的多肽分泌。
“并列连接”是指一种并列连接状态，在此状态下各成份按一定的关系连接，使各成份按期望的方式起作用。例如，调控序列与编码序列并列连接意味着编码序列是以能在适合调控序列的条件下表达编码序列的方式连接。
“编码序列”是一个多核苷酸序列，在合适的调控序列控制下它能被翻译成一个多肽。编码序列的两端通常由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括如cDNA和重组多核苷酸序列。
“ PCR”是指聚合酶链反应技术，参见Saiki et al.，Nature 324163(1986)；Scharf et al.，Science 2331076-1078(1986)；美国专利4,683,195；美国专利4,683,202。
本文所用的术语“多肽”是指一个氨基酸聚合物，并不特指特定长度的聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白质都包含在这一术语中。该术语也包括多肽的翻译修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此定义还包括那些如天然存在或非天然存在的带有取代键的多肽以及本领域熟知的其他修饰。
本文所用的术语“终止子”是指一些调控序列，如位于编码序列终止密码子3’端或下游的聚腺苷酸化序列和转录终止序列。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞培养”和其它类似的术语是指能够或已被用作导入重组载体或其它转移DNA的受体的微生物、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，这些术语也包括已转化细胞的后代。这些后代包括那些其形态或基因组DNA或总cDNA不一定与原始亲代相同的细胞，这些细胞的产生可能是天然的、偶然的或人为突变的结果。哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(“CHO”)和猴肾细胞(“COS”)。
本文所用的术语“微生物”包括原核和真核微生物种群，例如细菌和真菌，后者包括酵母和丝状真菌。
本文所用的术语“转化”是指外源多核苷酸转移到宿主细胞内的过程而与所使用的转移方法无关，这些方法可以是如感染、直接吸收、转导、F-融合、微注射或电穿孔。外源多核苷酸可以非整合载体例如质粒的方式保持，也可被整合到宿主基因组中。
“纯化的”和“分离的”对于多肽或核苷酸序列来说是指给定分子以基本不含同种或同类型的其它生物大分子的形式存在。本文所用的术语“纯化的”是指同类型生物大分子的含量以重量计至少为75％，优选至少为85％，更为优选的是至少95％，最优选的是至少98％，也可含有水、缓冲剂以及其它小分子，特别是分子量小于1000的分子。
“药学上可接受的载体”是指本领域技术人员用于给人体给药的任何载体，该载体本身不会引起任何不良副作用如产生抗体、发热等等。适合的载体一般是大的、代谢慢的大分子，它可以是蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物或脱毒的病毒颗粒。基它载体是本领域普通技术人员熟知的。载体优选含有甲状腺球蛋白。
治疗组合物一般含有药学上可接受的载体如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，一些辅助物质，如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等也可包含在这种组合物中。
本文所用的“治疗有效量”是指能产生所需效果的用量。这种用量的不同取决于每个待治疗的个体的健康和身体状况、个体免疫系统合成抗体的能力、所期望的保护程度、制剂、主治医生对病症的判断，以及其它有关因素。预计这种用量将落在可通过常规试验确定的相对较宽的范围内。
现已意外地发现，当用含有编码KGF163的cDNA的重组苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)重组杆状病毒感染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(SF9)，从而在昆虫细胞中表达KGF时，产生了除KGF163以外的一个缺少含有单个糖基化位点的KGF163N末端区头23个氨基酸残基的KGF片段。这个截短的未糖基化的KGF片段称为KGFdesl-23或KGF140，相对于称为KGF163的天然全长形式而言对靶细胞的效力提高了7-10倍。KGFdesl-23的靶细胞专一性没有改变。此外，与KGF163相反，高浓度的KGF片段对角质形成细胞不产生任何毒性。与以前PCT专利申请WO90/08771提出的相反，这些研究表明KGF的靶细胞专一性不是由它的N-末端区域决定的。而且，本发明表明，N-末端截短的KGF事实上是一个改进的KGF，它具有在治疗应用上更高的生物活性和降低了的细胞毒性。
大量的KGF片段可通过重组DNA技术来生产，这种技术优于从天然来源中分离纯化KGF，再从N-末端切除头23个氨基酸残基的方法。由重组技术生产的KGF可使分离出的KGF产品中不含有细胞中常有的污染分子。完全不含有任何微量人类蛋白污染物的KGF成分确实易于在诸如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞中产生。使用重组DNA技术，也可产生在自然界不存在的KGF片段，如那些可通过定点突变产生的变异体。
任何在所需宿主体内允许表达KGF片段的启动子都可用在本发明中。例如，在大肠杆菌中可以使用Lac操纵子的调控启动子序列。另一例子是酵母乙醇脱氢酶(“ADH”)启动子，它具有一个上游激活序列(“UAS”)调节ADH启动子的活力。此外，一些病毒增强子也能在本发明中应用。这些增强子不但扩增而且调控在哺乳动物细胞中的表达。这些增强子可整合到哺乳动物启动子序列中，这些启动子只有当诱导物存在时才被激活，诱导物的例子有激素或酶底物，参见Sassone-Corsi和Borelli，Trends Genet.2215(1986)；Maniatis et al.，Science 2361237(1987)。本发明可使用的启动子也包括杆状病毒多角体杂交启动子和p10启动子。
本发明可使用的终止序列的例子有啤酒酵母α-因子终止子和杆状病毒终止子。此外，可在某些宿主细胞中起作用的终止子也可使用。例如，SV40终止子可在中国仓鼠卵巢细胞中起作用。
在本发明实施中，当设计截短蛋白质时，许多KGF是优选的。其中一个例子是未糖基化的截去了天然KGF头23个氨基酸的KGF。一个编码优选的截短KGF的cDNA如图1所示。其它类型的KGF片段也是存在的，或者可由常规方法构建。在所示的序列中，截短蛋白的切割位点由箭头(a)表示，结果产生一个分子量为18KDa的蛋白质。使用图1的序列数据，以及指明的截短KGF的特征，本领域技术人员能够获得其它的编码截短KGF的DNA序列。例如，结构基因可进行操作，从而改变单个核苷酸而保持原有的氨基酸，或改变数个核苷酸以修改氨基酸但却不丧失生物活性。许多核苷酸可借助已知的技术被置换、插入或缺失，例如用体外突变和引物修复技术。结构基因可在它的3’端和/或5’端截短而仍保持它的生物活性。
KGF片段编码序列的构建可通过合成编码KGF片段的DNA序列或者通过改变已存在的或天然的KGF编码序列来获得所需的序列。天然的KGF编码序列或多肽是指自然界存在着的。天然KGF的氨基酸序列如图1所示。合成的KGF片段可基于已知的KGF氨基酸序列，采用所选的宿主细胞偏爱的密码子来制备。参见Urdea et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 807461(1983)。或者，所需的KGF片段编码序列可利用基于附图所示核酸序列的探针由核酸文库来克隆。制备和探测核酸序列文库的技术已有人描述过，如Sambrook et al.，“分子克隆实验室手册”(New York，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。其它的重组技术，如定点突变、PCR、酶切和连接也可用于构建KGF片段编码序列的衍生物和类似物。天然KGF多肽编码序列易于进行修饰以构建其它类型的KGF多肽。
作为一个实例，KGF片段的类似物可由不影响KGF片段活性的保守性氨基酸置换来构建。本发明进一步考虑称为突变蛋白的KGF片段类似物的子集，其中KGF片段中未形成二硫键的半胱氨酸被置换，一般由丝氨酸置换。这些突变蛋白可能比未修饰的KGF片段的稳定温度范围要宽。这里所指的突变蛋白也包括那些比天然KGF片段缺少一些氨基酸的蛋白。突变蛋白将保持至少20％，优选至少50％，最好至少80％的天然KGF片段活性。突变蛋白的编码序列可通过天然KGF片段编码序列的体外突变来构建。
这些片段与天然KGF分子的不同在于氨基端和/或羧基端缺失氨基酸。所缺失氨基酸的多少是不重要的，只要KGF片段不含有N-末端糖基化位点并保持天然KGF分子至少20％的KGF活性。这些片段的编码序列可容易地通过从天然KGF编码序列或其变异体中切除不需要的核苷酸而构建。
本发明的表达载体含有一个可在宿主细胞内起作用的启动子，该启动子与KGF片段或类似物的编码序列并列连接。表达载体可任选含有用于分泌的信号序列、终止子、选择性标记、复制起点、以及与宿主细胞序列同源的序列。含有这些额外元件可优化表达。
非天然的功能性启动子也可使用，例如基于不同启动子共同序列的合成启动子。有效的启动子也可以是杂交启动子，即由调控区连接异源表达起始区组成的启动子，杂交启动子的实例有大肠杆菌的Lac操纵子连接到大肠杆菌tac转录激活区形成的启动子；酵母乙醇脱氢酶(“ADH”)调控区连接到酵母甘油醛3-磷酸脱氢酶(“GAPDH”)转录激活区形成的启动子，参见美国专利4,876,197和4,880,734，这两篇专利在此引入作为参考；以及细胞肥大病毒(“CMV”)增强子连接到猴病毒SV40启动子形成的启动子。
本发明的KGF片段或类似物的编码序列也可以在读码中与信号序列连接。信号序列一般编码一段起分泌作用、由能引导KGF片段或类似物到达细胞膜的疏水性氨基酸组成的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，有一个加工位点位于信号序列和KGF片段之间，以便在体内或体外在信号序列和KGF片段之间进行切割。适合的信号序列是从分泌的内源性宿主细胞蛋白的基因衍生而来的，例如酵母转化酶基因，参见欧洲专利12873和日本专利62,096,086；A因子基因，参见美国专利4,588,684；干扰素信号序列，参见EP60057。
本发明用于酵母表达的优选的一类分泌前导序列是截短的酵母α-因子前导序列，它含有“pre”信号序列的至少一部分和“pro”区域。可在本发明中使用的α-因子前导序列包括具有约83个氨基酸残基的全长pre-proα-因子前导肽，以及一般具有约25到50个氨基酸残基的截短α-因子前导肽，参见美国专利4,546,083和4,870,008[及美国专利申请]和欧洲专利EP324274，以上文献在此引入作为参考。可在本发明中使用的应用α-因子前导序列片段的另外一些前导序列包括pre序列来自第一个酵母信号序列，但pro区域来自第二个酵母α-因子的杂交α-因子前导序列。(参见如PCT WO89/02463)。
f表达系统当编码KGF片段或类似物的DNA序列以正确的读码和方向并列接入载体中时，就能用重组技术表达KGF片段和其类似物，这是本领域的技术人员所熟知的。当要产生含有KGF片段的基因构建体时，优选的起始材料是编码KGF片段的cDNA。虽然如需要的话KGF片段可以能被切割的杂交蛋白形式产生出来，但典型的方法是把截短的KGF基因插入在启动子的下游，截短的KGF基因后面是终止子序列。一般来说，将使用能提高截短KGF和截短KGF多肽衍生物产率的宿主细胞特异性序列，适合的控制序列可加入到表达载体中，这些控制序列如增强子序列、多腺苷酸化序列和核糖体结合位点。一旦分离出合适的编码序列，它就可在许多不同的表达系统中表达；例如那些在哺乳动物细胞、杆状病毒、细菌和酵母中使用的表达系统。这些将在下文中讨论。
i.哺乳动物系统哺乳动物表达系统在本领域是已知的。哺乳动物启动子是能够结合哺乳动物RNA聚合酶和起动编码序列(如结构基因)向下游(3’)转录为mRNA的任何DNA序列。启动子含有通常置于编码序列5’端附近的转录起始区，以及通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对(bp)处的TATA框。据认为，该TATA框引导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子也含有一个一般位于TATA框上游100-200bp内的上游启动子元件。上游启动子元件决定转录起始速度，并可在任一方向起作用[Sambrook等人(1989)“哺乳动物细胞内克降基因的表达”，分子克隆实验室手册，第二版]。
哺乳动物病毒基因常常是高度表达的，并具有广泛的宿主范围；因此编码哺乳动物病毒基因的序列提供特别有用的启动子序列，其实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子。此外，从非病毒基因得到的序列如鼠金属硫因基因也提供有用的启动子序列。表达可以是组成型的也可以是调控(诱导)型的，这取决于启动子在激素反应性细胞中是否能由糖皮质激素诱导。
如与上述的启动子元件一起存在着一个增强元件(增强子)，则一般会提高表达水平。增强子是一段调控DNA序列，当与同源或异源启动子连接并在正常RNA起始位点开始合成时，可刺激转录达1000倍。当被置于转录起始点的上游或下游，正常或翻转的取向，或在离启动子多于1000个核苷酸的位置时，增强子也是有效的[Maniatis et al.(1987)Science 2361237；Alberts et al.(1989)Mol.Biology ofthe Cell，2nd ed.]。从病毒中获得的增强子元件特别有用，因其一般有较宽的宿主范围。其实例包括SV40早期基因增强子[Dijkema et al.(1985)EMBOJ.4761]，和从劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)[Gorman et al.(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777]和从人细胞肥大病毒[Boshart etal.(1985)Cell 41521]衍生的增强子/启动子。另外，一些增强子是可调节的，只有在诱导物如激素或金属离子存在下才被激活[Sassone-Corsiand Borelli(1986)Trends Genet.2215；Maniatis et al.(1987)Science 2361237]。
DNA分子可在哺乳动物细胞内进行胞内表达。启动子序列可直接与DNA分子连接，在这种情况下重组蛋白N-末端第1个氨基酸总是蛋氨酸，它是由起始密码子ATG编码的。如需要的话，该N-末端可通过在体外与溴化氰一起保温而从蛋白质上切除。
或者，通过构建嵌合DNA分子使其编码由能在哺乳动物细胞内分泌外源蛋白的前导序列片段组成的融合蛋白，也可使外源蛋白从细胞内分泌到培养基中。优选的是在前导片段和外源基因之间编码若干加工位点以便在体内或在体外被切开。前导序列片段一般编码由能引导蛋白从细胞中分泌的疏水性氨基酸组成的信号肽。腺病毒三联前导序列是在哺乳动物细胞内指导外源蛋白分泌的前导序列的一个例子。
一般来说，由哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3’端的调控区，因此，它们与启动子元件一起邻接编码序列。成熟mRNA的3’端是由定点的转录后切割和聚腺苷酸化形成的[Bimstiel et al.(1985)Cell 41349，Proudfoot and Whitelaw(1988)“Termination and 3’end processing of eukaryotic RNA.InTranscription and splicing(ed.B.D.Hames and D.M.Glover)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105]。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA又可翻译成由DNA编码的多肽。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括从SV40衍生而来的此类信号[Sambrook et al.(1989)“在培养的哺乳动物细胞中表达克隆的基因”，分子克隆实验室手册]。
当含有内含子(也称为间插序列)时一些基因可更有效地表达。然而，一些cDNA曾在缺少剪接信号(也称为剪接供体和受体位点)的载体中有效地表达[参见如，Gothing and Sambrook(1981)Nature 293620]。内含子是位于含有剪接供体和受体位点的编码序列内的一段非编码间插序列。它们是在初级转录本聚腺苷酸化后由被称为“剪接”的过程切除的[Nevins(1983)Annu.Rev.Biochem.52441；Green(1986)Annu.Rev.Genet.20671；Padgett et al.(1986)Annu.Rev.Biochem.551119；Krainer and Maniatis(1988)“RNA剪接”，转录和剪接(ed.B.D.Hames and D.M.Glover)]。
上述的各种成份包括启动子、聚腺苷酸化信号、和转录终止序列一般一起被置于表达构建体中。如需要，增强子、含有有效剪接供体和受体位点的内含子和前导序列也可放入表达构建体中。表达构建体常保持在复制子中，如能稳定保持在宿主如哺乳动物细胞或细菌中的染色体外元件(如质粒)。哺乳动物复制系统包括那些从动物病毒衍生来的复制系统，它们需要有反式作用的因子才能复制。例如，含有乳头多瘤空泡病毒如SV40[Gluzman(1981)Cell23175]或多形瘤病毒复制系统的质粒在有合适的病毒T抗原存在时，能复制到极高的拷贝数。哺乳动物复制子另外的例子包括那些从牛乳头瘤病毒和EB病毒衍生而来的哺乳动物复制子。此外，复制子可含有两个复制系统，使其能保持在如哺乳动物细胞内进行表达和在原核宿主内进行克隆和扩增。这种哺乳动物-细菌穿梭载体的例子包括pMT2[Kaufman et al.(1989)Mol.Cell Biol.9946]和pHEBO[Shimizu et al.(1986)Mol.CellBiol.61074]。
所用的转化方法取决于所要转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体内多核苷酸的包入、以及DNA直接微注射到细胞核内。
本领域中已知的可作为宿主用于表达的哺乳动物细胞系包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多无限增殖化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、以及一些其它细胞系。
ii.杆状病毒系统编码KGF的多核苷酸可插入到合适的表达载体如昆虫细胞表达载体中，并可并列地连接到载体中的控制元件上。载体构建应用本领域中已知的技术。特别是，本发明使用的载体杆状病毒表达载体是基本按照Kitts et al.，Biotechniques 14810-817(1993)的方法构建的。
简言之，先构建KGF表达盒，方法是首先将KGF163C编码序列插入到含有与杆状病毒基因组部分序列(本文称为“杆状病毒序列”)同源并能够与其同源重组的多核苷酸序列的转移载体中。杆状病毒序列至少含有一段必需的多核苷酸序列，下面将详细描述。将KGF编码序列插入到转移载体中，使其两端都邻接杆状病毒序列。
将含有KGF编码序列的转移载体与缺少为产生功能性病毒所必需的多核苷酸序列的野生型杆状病毒的突变体一起转染到宿主昆虫细胞中。在这方面，当突变杆状病毒与KGF表达盒重组时，转染后可在宿主细胞中产生功能性病毒。
以这种方式产生的功能性杆状病毒掺入了KGF表达盒，适于转染到新的宿主细胞中以产生重组KGF和重组KGFdesl-23。或者，这一过程也可由KGFdesl-23编码序列代替KGF163编码序列来进行。
通常，表达系统的成份包括转移载体，通常是细菌质粒，它既含有杆状病毒基因组片段又含有一些便于插入异源基因或需表达基因的限制位点；野生型杆状病毒，它具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(这使异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。
在把截短的KGF DNA序列插入转移载体后，将该载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，使载体和病毒基因组进行重组。表达包装好的重组病毒，鉴定和纯化重组噬菌斑。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式从如Invitrogen，San DiegoCA(“MaxBac”Kit)买到。这些技术是本领域技术人员公知的，详细描述参见Summers and Smith，得克萨斯农业实验站公告No.1555(1987)(下文称“Summers and Smith”)，该文献在此引入作为参考。
在把截短KGF DNA序列插入杆状病毒基因组之前，上述的各种成份，包括启动子、前导序列(如需要的话)、目的编码序列、转录终止序列，通常组装成一个中间位移构建体(转移载体)。这个构建体可含有单个基因和并列连接的调控元件；多个基因，每个基因都有自己的一套并列连接的调控元件；或者受同一套调控元件调控的多个基因。中间位移构建体常保持在复制子中，如能稳定保持在宿主如细菌中的染色体外元件(如质粒)。该复制子将有一个复制系统，使它能保持在适合的宿主中以便进行克隆和扩增。
目前，最常用的把外源基因导入AcNPV的转移载体是pAc373。也设计了许多本领域技术人员已知的其它载体。这些载体包括如pVL985，它把多角体蛋白的起始密码子ATG改变为ATT，并在ATT的下游32个碱基对处导入一个BamHI克隆位点，参见Luckow andSummers，Virology(1989)1731。
该质粒通常还含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号[Miller et al.(1988)Ann.Rev.Microbiol.，42177]，以及可供在大肠杆菌中选择和繁殖的原核细胞氨苄青霉素抗性基因(amp)和复制起点。
杆状病毒转移载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(如结构基因)向下游转录(5’端向3’端)成mRNA的任何DNA序列。启动子具有通常位于编码序列5’端附近的转录起始区。该转录起始区一般包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒转移载体还可含有第二个称为增强子的区域，如果有的话，它通常距结构基因很远。表达可以是调控性的或是组成性的。
在病毒感染后期大量转录的结构基因提供特别有用的启动子序列，其实例包括从编码病毒多角体蛋白的基因(见Friesen等(1986)，“杆状病毒基因表达的调控”，杆状病毒分子生物学(ed.WalterDoerfler)；欧洲专利申请公开127,839和155,476)和编码p10蛋白的基因(Vlak et al.，(1988)，J.Gen.Virol.69765)衍生的序列。
编码合适信号序列的DNA可从分泌的昆虫或杆状病毒蛋白的基因中衍生，例如，杆状病毒多角体蛋白基因(Carbonell et al.(1988)Gene，73409)。此外，由于哺乳动物细胞翻译后修饰(如信号肽切除、蛋白酶酶切和磷酸化)的信号似乎可被昆虫细胞识别，分泌和细胞核积累所需的信号也似乎在无脊椎动物细胞和脊椎动物细胞间是保守的，所以非昆虫来源的前导序列，例如从编码人α-干扰素(Maeda et al.，(1985)，Nature 315592)、人胃泌素释放肽(Lebacq-Verheyden et al.，(1988)，Molec.Cell Biol.83129)、人白细胞介素-2(Smith et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，828404)、小鼠白细胞介素-3(Miyajima et al.，(1987)Gene 58273)、人葡糖脑苷脂酶(Martin et al.(1988)DNA，799)的基因中衍生的前导序列，也能在昆虫中起分泌作用。
重组多肽或聚蛋白可在胞内表达，如在有合适的调控序列时表达也可分泌出来。非融合外源蛋白的高效胞内表达通常需要异源基因，该异源基因最好有一个在ATG起始信号前含有合适的翻译起始信号的短前导序列。如果需要，N-末端的蛋氨酸可通过在体外与溴化氰一起保温而从成熟蛋白上切下。
此外，在天然状态下不分泌的重组聚蛋白或蛋白都可以通过构建嵌合DNA分子而从昆虫细胞中分泌出来，该嵌合DNA分子编码含有能在昆虫细胞中分泌外源蛋白的前导序列的融合蛋白。前导序列片段一般编码由能引导蛋白转移至内质网中的疏水性氨基酸组成的信号肽。
在插入截短KGF DNA序列和/或编码表达产物前体的基因后，用转移载体的异源DNA和野生型杆状病毒基因组DNA共转化昆虫细胞宿主，通常用共转染法。构建体的启动子和转录终止序列一般含有2-5kb的杆状病毒基因组片段。将异源DNA导入杆状病毒所需位点的方法是本领域已知的。(参见Summers and Smith，同上；Ju et al.，(1987)；Smith et al.，Mol.Cell Biol.(1983)32156；Luckow andSummers(1989))。例如，可通过同源双交换重组插入一个基因如多角体蛋白基因内；也可插入在所需的杆状病毒基因中构建的限制酶位点内(Miller et al.，(1989)Bioassays 491)。当代替多角体蛋白基因克隆在表达载体中时，DNA序列的5’和3’端都邻接多角体蛋白特异性序列并且该DNA序列位于多角体蛋白启动子的下游。
新形成的杆状病毒表达载体随后包装成具感染性的重组杆状病毒。同源性重组的发生是低频率的(大约1％到5％)，因此，在共转染后产生的大部分病毒仍是野生型病毒。所以，必须有一种方法来鉴别重组病毒。本表达系统的一个优点是可用肉眼筛选鉴别出重组病毒。由天然病毒产生的多角体蛋白在病毒感染后期可在感染细胞的细胞核中以很高的水平产生。积累的多角体蛋白形成含有包埋颗粒的包含体。这些包含体大至15μm，具强折射性，使其具有明亮的外观，在光学显微镜下很容易看到。感染了重组病毒的细胞缺少包含体。为了区别野生型病毒和重组病毒，用本领域中已知的技术把转染上清液涂布在单层昆虫细胞上。在光学显微镜下筛选有包含体(表明是野生型病毒)和无包含体(表明是重组病毒)的噬菌斑。参见“Current Protocols inMicrobiology”，Vol.2(Ausubel et al.eds)at16.8(Supp.10，1990)；Summers and Smith，同上；Miller et al.(1989)。
已构建了用于感染数种昆虫细胞的重组杆状病毒表达载体。例如，已构建了用于以下昆虫的重组杆状病毒埃及伊蚊、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、黑尾果蝇、草地夜蛾和粉纹夜蛾(PCT Pub No.WO89/046699；Carbonell et al.，(1985)J.Virol.56153；Wright(1986)Nature 321718；Smith et al.，(1983)Mol.Cell Biol.32156；一般性讨论参阅Fraser，et al.(1989)InVitro Cell Dev.Biol.25225)。
用于在杆状病毒表达系统中直接和融合表达异源多肽的细胞和细胞培养基可以买到。细胞培养技术是本领域技术人员公知的。参见Summers and Smith(同上)。
修饰过的昆虫细胞可在合适的营养培养基中进行培养，以便稳定保持该细胞中存在的质粒。如果表达产物基因处于诱导控制下，宿主细胞可培养至高密度，然后再诱导表达。或者，如果表达是组成型的，则产物连续不断地表达进入培养基中，这时营养培养基需要连续不断地循环，同时移出目的产物并补加消耗的营养物。产物可用不同的技术纯化，诸如层析如HPLC、亲和层析、离子交换层析等；电泳；密度梯度离心；溶剂萃取等。如果需要，产物可适当进行进一步纯化以便去除几乎所有的也分泌到培养基中或昆虫细胞溶解产生的昆虫蛋白，获得至少基本上去除了宿主成份如蛋白、脂类和多糖的产物。
为了实现截短KGF的表达，从转化体得到的重组宿主细胞在能表达重组截短KGF编码序列的条件下进行培养。这些条件的不同取决于所选择的宿主细胞。然而，本领域技术人员根据本领域的已知技术容易确定这些条件。
iii.细菌系统细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是任何能结合细菌RNA聚合酶和起始向下游(3’)转录编码序列(如结构基因)生成mRNA的DNA序列。启动子有一个通常位于编码序列5’端附近的转录起始区域。该转录起始区域一般含有RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可有称为操纵基因的第二个区域，它可与RNA合成起点处的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(诱导性)转录，因为基因阻遏蛋白可结合在操纵基因上从而抑制特定基因的转录。组成型表达可在缺少负调控元件如操纵基因时发生。此外，正调控可通过一个基因活化蛋白结合序列来实现，所述结合序列如存在的话，通常位于RNA聚合酶结合序列附近(5’端)。基因活化蛋白的实例有降解物活化蛋白(CAP)，它帮助启动大肠杆菌中乳糖(ac)操纵子的转录[Raibaud et al.(1984)Annu.Rev.Genet.18173]。因此调控表达可以是正调控或负调控，从而增强转录或减弱转录。
编码代谢途径中酶的序列提供特别有用的启动子序列，其实例包括从糖代谢酶类如半乳糖、乳糖(lac)[Chang et al.(1977)Nature 1981056]和麦芽糖衍生的启动子序列。另外的例子包括从生物合成酶类如色氨酸(trp)[Goeddel et al.(1980)Nuc.Acids Res.84057；Yelverton et al.(1981)Nucl.Acids Res.9731；U.S.4,738,921；EPO Pub.Nos 036776and 121775]衍生的启动子序列。β-内酰胺酶(bla)启动子系统[Weis-smann (1981)“The cloning of interferon and other mistakes.”InInterferon 3(ed.I.Gresser)]、λ噬菌体PL[Shimatake et al.(1981)Nature292128]和T5[U.S.4 689 406]启动子系统也提供有用的启动子序列。
此外，自然界不存在的合成启动子也能起细菌启动子的作用。例如，一种细菌或噬菌体启动子的转录活化序列可与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接在一起，构建出合成的杂交启动子(美国专利4551433)。例如，tac启动子是由trp启动子和受lac阻遏物调控的lac操纵子序列组成的杂交trp-lac启动子[Amann et al.(1983)Gene 25167；de Boer et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021]。而且，细菌启动子可包括天然存在的非细菌来源的启动子，这些启动子能够结合细菌RNA聚合酶和起始转录。天然存在的非细菌来源的启动子也可与相容的RNA聚合酶联合，从而在原核细胞中达到一些基团的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是一个联合启动子系统的例子[Studier et al.(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074]。此外，杂交启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域组成(EPO Pub.No.267851)。
除有功效的启动子序列外，有效的核糖体结合位点对在原核细胞中表达外源基因也是有用的。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgano(SD)序列，包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine et al.(1975)Nature 25434]。据认为，SD序列通过它与大肠杆菌16S rRNA3’端的碱基配对而促进mRNA结合到核糖体上[Steitz et al.(1979)“信使RNA中的基因信号和核苷酸序列”，生物调控及发育基因表达(ed.R.F.Goldberger)]。用弱的核糖体结合位点表达真核细胞基因和原核细胞基因[Sambrook et al.(1989)“在大肠杆菌中表达克隆的基因”，分子克隆实验室手册]。
DNA分子可在细胞内表达。启动子序列可直接连接DNA分子，在这种情况下N-末端的第一个氨基酸总是蛋氨酸，它是由ATG起始密码子编码的。如果需要，N-末端的蛋氨酸可通过在体外与溴化氰一起保温或通过在体内或体外与细菌蛋氨酸N-末端肽酶一起保温而从蛋白质上切除(EPO Pub.No.219237)。
融合蛋白提供了直接表达以外的另一种方法。一般是编码内源细菌蛋白或其它稳定蛋白N-末端部分的DNA序列与异源编码序列的5’端融合。表达时，该构建体提供两种氨基酸序列的融合。例如，λ噬菌体基因可连接在外源基因的5’端而在细菌中表达。所得的融合蛋白最好保留一个加工酶(因子Xa)位点使噬菌体蛋白从外源蛋白上切下[Nagai et al.(1984)Nature 309810]。融合蛋白也可由下列基因的序列构成LacZ[Jia et al.(1987)Gene 60197]；trpE[Allen et al.(1987)J.Biotechnol.593；Makoff et al.(1989)J.Gen.Microbiol.13511]；Chey[EPO Pub.No.324647]。位于两种氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码一个可切割位点。另一个例子是泛素(ubiquitin)融合蛋白。这种融合蛋白是由最好保留了加工酶(如泛素特异性加工蛋白酶)位点从而能把泛素从外源蛋白上切下的泛素区域形成的。通过这种方法可分离出天然的外源蛋白[Miller et al.(1989)Bio/Technology 7698]。
此外，外源蛋白也可通过构建嵌合DNA分子而从细胞中分泌出来，该嵌合DNA分子编码的融合蛋白含有能使外源蛋白在细菌中分泌的信号肽序列片段[U.S.4,336,336]。信号序列片段一般编码由指导蛋白从细胞中分泌的疏水性氨基酸组成的信号肽。该蛋白可分泌到生长培养基中(革兰氏阳性细菌)或分泌到位于细胞内膜和外膜间的周质间隙内(革兰氏阴性细菌)。最好在信号肽片段和外源基因间编码能在体内或体外切割的加工位点。
编码合适信号序列的DNA可从分泌的细菌蛋白的基因中得到，例如大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui et al.(1993)，基因表达的实验操作；Ghrayeb et al.(1984)EMBO J.32437]和大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)[OKa et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。作为另一例子，各种杆菌菌株的α-淀粉酶基因的信号序列可用于从枯草杆菌中分泌异源蛋白[Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795582；EPO Pub.No.244042]。
一般来说，由细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’端的调控区域，因此与启动子一起邻接编码序列。这些序列指导可翻译成由DNA编码的多肽的mRNA的转录。转录终止序列常包括能形成基环结构的大约50个核苷酸的DNA序列，上述基环结构有助于终止转录。所述序列包括从具有强启动子的基因如大肠杆菌trp基因以及其它生物合成基因得到的转录终止序列。
一般来说，上述成份，包括启动子、信号序列(如需要的话)、目的编码序列、以及转录终止序列，被一起置于表达构建体中。表达构建体常保持在复制子中，如能在宿主如细菌中稳定保持的染色体外元件(如质粒)。该复制子有一个复制系统，使得它能保持在原核宿主中以进行表达或克隆和扩增。此外，复制子可是低或高拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数是约5到200，一般为约10至150。含有高拷贝数质粒的宿主最好含有至少约10个质粒，更为优选的是至少约20个质粒。选择高拷贝数还是低拷贝数的载体取决于载体和外源蛋白对宿主的影响。
或者，表达构建体也可用整合载体整合到细菌基因组中。整合载体一般含有至少一段与细菌染色体同源的序列以使载体整合。整合似乎是在载体中的同源DNA和细菌染色体之间发生重组的结果。例如，用各种杆菌菌株的DNA构建的整合载体能整合到杆菌的染色体中(EPO Pub.No.127328)。整合载体也可由噬菌体或转座子序列组成。
一般来说，染色体外表达构建体和整合表达构建体可含有选择性标记以便筛选已转化的细菌菌株。选择性标记可在细菌宿主中表达，可包含使细菌对诸如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素具有抗性的基因[Davies et al.(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469]。选择性标记也可包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的基因。
或者，一些上述成份可共同置于转化载体中。转化载体一般含有一个选择性标记。如上所述，该选择性标记或者保持在复制子中，或者插入到整合载体中。
已经构建出能用于转化入许多细菌的表达和转化载体，这些载体或者是染色体外复制子，或者是整合载体。例如，已构建出用于如下细菌的表达载体枯草杆菌[Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPO Pub.Nos.036259和063953；PCT WO84/04541]；大肠杆菌[Shimatake et al.(1981)Nature 292128；Amann et al.(1985)Gene 40183；Studier et al.(1986)J.Mol.Biol.189113；EPO Pub.Nos.036776，136829和136907]；乳酪链球菌[Powell et al(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]；变青链球菌[Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]；变青链霉菌[U.S.4,745,056]。
将外源DNA导入细菌宿主的方法是本领域已知的，一般包括用CaCl2或其它试剂如二价阳离子和DMSO处理细菌的转化方法。DNA也可用电穿孔的方法导入细菌细胞。转化方法通常因所要转化的细菌种属不同而不同。参见如，[Masson et al.(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273；Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPOPub.Nos.036259和063953；PCT Publication No.WO84/04541，杆菌]、[Miller et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；Wang et al.(1990)J.Bacteriol.172949，弯曲杆菌]；[Cohen et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower et al(1988)Nucl.Acids Res.166127；Kushner(1978) “用ColE1衍生的质粒转化大肠杆菌的改进方法”，基因工程国际基因工程讨论会年鉴(eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)；Mandel etal.(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949318；埃希氏菌]；[Chassy et al.(1987)FEMS Microbiol.Lett.44173，乳杆菌]；[Fiedler et al.(1988)Anal.Biochem.17038，假单胞菌]；[Augustin et al.(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203，葡萄球菌]；[Baranyet al.(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)“用电穿孔法转化乳链球菌”，链球菌遗传学(ed.J.Ferretti and R.Curtiss III)；Perry et al.(1981)Infec.Immun.321295；Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti et al.(1987)Proc.4th Evr.Cong.Brotechnology 1412，链球菌]。
iv.酵母表达酵母表达系统也是本领域技术人员已知的。酵母启动子是任何能够结合酵母RNA聚合酶和起始编码序列(如结构基因)下游(3’)方向转录成mRNA的DNA序列。启动子有一个通常位于编码序列5’端附近的转录起始区域。该转录起始区域一般包括RNA聚合酶结合位点(“TATA框”)和转录起始位点。酵母启动子也可有称为上游活化序列(UAS)的第二区域，如有的话，它通常位于结构基因的远处。该UAS允许调控(诱导性)表达。组成型表达在缺少UAS时发生。调控表达可以是正调控或负调控，从而增强转录或减弱转录。
酵母是具有活性代谢途径的发酵生物，因此编码代谢途径中的酶类的序列提供特别有用的启动子序列，其实例包括乙醇脱氢酶(ADH)(EPO Pub.No.284044)、烯醇化酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶(PyK)(EPO Pub.No.329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供有用的启动子序列[Myanohara et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801]。
此外，在自然界不存在的合成启动子也能起酵母启动子的作用。例如，一种酵母启动子的UAS序列可与另一种酵母启动子的转录活化区域连接起来，从而构建出合成的杂交启动子。这种杂交启动子的例子包括ADH调控序列与GAP转录活化区域连接形成的启动子(U.S.4876197和U.S.4880734)。其他杂交启动子的例子包括由ADH2、GAIA、GAL10或PHO5基因的调控序列与糖酵解酶基因如GAP或PyK的转录活化区域结合而构成的启动子(EPO Pub.No.164556)。而且，酵母启动子也包括能结合酵母RNA聚合酶和起始转录的天然存在的非酵母来源的启动子。这种启动子的例子包括文献中的启动子[Cohen et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078；Henikoff et al.(1981)Nature 283835；Hollenberg et al.(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96119；Hollenberg et al.(1979)“在啤酒酵母中表达细菌抗生素抗性基因”，医学、环境和商业上重要的质粒(eds.K.N.Timmis andA.Puhler)；Mercerau-Puigalon et al.(1980)Gene 11163；Panthier et al.(1980)Curr.Genet.2109]。
DNA分子可以在酵母中进行胞内表达。启动子序列可直接连接DNA分子，在这种情况下重组蛋白N-末端的第一个氨基酸总是由ATG起始密码子编码的蛋氨酸。如果需要，该N-末端蛋氨酸可通过在体外与溴化氰一起保温而从蛋白上切下。
融合蛋白提供了酵母表达系统以及哺乳动物、杆状病毒和细菌表达系统以外的另一种选择。一般是编码内源酵母蛋白或其它稳定蛋白N-末端的DNA序列与异源编码序列的5’端融合。在表达时这个构建体提供两种氨基酸序列的融合。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可连接在外源基因的5’端并在酵母中表达。在二种氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码切割位点。参见如EPO Pub.No.196056。另一个例子是泛素融合蛋白。这种融合蛋白是由最好保留了加工酶(如泛素特异性加工蛋白酶)位点从而能从外源蛋白上切除泛素的泛素区域形成的。因此通过这种方法可分离得到天然的外源蛋白(参见如PCT Pub.No.WO88/024066)。
此外，外源蛋白也可以通过构建嵌合DNA分子而从细胞中分泌到生长培养基中，该嵌合DNA分子编码的融合蛋白含有能使外源蛋白在酵母中分泌的前导序列片段。最好在前导序列片段和外源基因之间编码加工位点，从而能在体内或体外切割。该前导序列片段一般编码由指导蛋白从细胞中分泌的疏水性氨基酸组成的信号肽编码合适信号序列的DNA可从分泌的酵母蛋白的基因中得到，如酵母转化酶基因(EPO Pub.No.012873；JPO Pub.No.62,096,086)和A因子基因(U.S.4,588,684)。另外，还有一些非酵母来源的前导序列如干扰素前导序列也能在酵母中起分泌作用(EPO Pub.No.060057)。
一类优选的分泌前导序列是采用“pre”信号序列和“pro”区域的酵母α-因子基因片段的前导序列。可使用的α-因子片段类型包括全长的pre-proα-因子前导肽(约83个氨基酸残基)以及截短的α-因子前导肽(一般约25到50个氨基酸残基)(U.S.4,546,083和U.S.4,870,008；EPO Pub.No.324,274)。另外的使用有分泌功能的α-因子前导肽片段的前导肽包括由第一种酵母α因子的pre顺序和第二种酵母α-因子的pro区域组成的杂交α-因子前导肽。参见如PCTPub.No.WO89/02463。
一般来说，由酵母识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’端的调控区域，因此与启动子一起邻接编码序列。这些序列指导能翻译成由DNA编码的多肽的mRNA的转录。转录终止序列和由酵母识别的其它终止序列的例子有编码糖酵解酶类的序列。
一般来说，上述成份，包括启动子、前导序列(如需要的话)、目的编码序列、以及转录终止序列，被一起置于表达构建体中。表达构建体常保持在那些能在宿主如酵母或细菌内稳定保持的复制子中，如染色体外元件(如质粒)。该复制子可具有两个复制系统，使其能保持在如酵母中用于表达，也能保持在原核细胞宿主中用于克隆和扩增。这种酵母-细菌穿梭载体的实例包括YEp24[Botstein et al.(1979)Gene 817-24]；PCl/1[Brake et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646]；YRp17[Stinchcomb et al.(1982)J.Mol.Biol.158157]。此外，复制子可以是高或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒的拷贝数通常约为5到200，一般约为10到150。含有高拷贝数质粒的宿主优选含有至少约10个质粒，更为优选的是至少约20个质粒。选择高还是低拷贝数载体取决于载体和外源蛋白对宿主的影响。参见如Brake等人(同上)。
或者，表达构建体也可用整合载体整合到酵母基因组中。整合载体一般含有至少一段与酵母染色体同源的序列以使载体整合，优选含有两段邻接表达构建体的同源序列。整合似乎是在载体中的同源DNA和酵母染色体之间发生重组的结果[Orr-Weaver et al.(1983)Methods inEnzymol.101228-245]。可通过选择合适的同源序列加入整合载体中，可将该载体引导到酵母中的特定位置。参见Orr-Weaver等人(同上)。单个或更多的表达构建体都可整合，这也许会影响重组蛋白的生产水平[Rine et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750]。包含在载体中的染色体序列既可以是载体中的单个片段，也可以是与染色体中相邻片段同源并在载体中邻接表达构建体的两个片段，前者导致整个载体的整合，后者则会导致只稳定整合表达构建体。
一般来说，染色体外表达构建体和整合表达构建体可以含有选择性标记以便选择已转化的酵母菌株。选择性标记可包括能在酵母宿主中表达的生物合成基因，如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7，以及G418抗性基因，这些基因使酵母细胞分别对衣霉素和G418有抗性。此外，合适的选择性标记也使酵母具有在毒性化合物如金属离子存在下生长的能力。例如，含有CUP1选择生标记的酵母能在铜离子存在下生长[Butt et al.(1987)Microbiol.Rev.51；351]。
或者，上述的一些成份可一同置于转化载体中。如上所述，转化载体一般含有一个保持在复制子中或进入整合载体中的选择性标记。
现已构建出用于转化入许多酵母中的表达和转化载体，这些载体中既有染色体外复制子，也有整合载体。例如，已构建出用于下述酵母的表达载体白假丝酵母[Kurtz，et al.(1986)Mol.Cell Biol.6142]；麦芽糖酵母[Kunze，et al.，(1985)J.Basic Microbiol.25141]；多形汉逊氏酵母[Gleeson，et al.，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkampet al.(1986)Mol.Gen.Genet.202302]；脆壁克鲁维酵母[Das，et al.，(1984)J.Bacteriol.1581165]；乳酸克鲁维酵母[De Louvencourt et al.，(1983)J.Bacteriol.154737；Van den Berg et al.，(1990)Bio/Technology 8135]；季也蒙毕赤酵母[Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141]；巴斯德毕赤酵母[Cregg，et al.(1985)Mol.Cell Biol.53376；U.S.4,837,148和U.S.4,929,555]；啤酒酵母[Hinnen et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929；Ito et al.(1983)J.Bacteriol.153163]；彭贝裂殖酵母[Beach and Nurse(1981)Nature 300706]；解脂芪草酵母[Davidow et al(1985)Curr.Genet.10380-471；Gaillardin et al.(1985)Curr.Genet.1049]。
本领域中熟知的用于将外源DNA导入酵母宿主的方法一般包括转化原生质球或转化用碱性阳离子处理过的完整酵母细胞。转化方法通常因欲转化的酵母种属的不同而不同。参见如[Kurtz et al.(1986)Mol.Cell Biol.6142；Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141，假丝酵母]；[Gleeson et al.(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp etal.(1986)Mol.Gen.Genet.202302，汉逊氏酵母]；[Das et al.(1984)J.Bacteriol.1581165；De Louvencourt et al.(1983)J.Bacteriol.1541165；Van den Berg et al.(1990)Bio/Technology 8135，克鲁维酵母]；[Cregget al.(1985)Mol.Cell Biol.53376；Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141；U.S.4,837,148和U.S.4,929,555，毕赤酵母]；[Hinnen et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929；Ito et al.(1983)J.Bacteriol.153163，酵母]；[Beach and Nurse(1981)Nature 300706，裂殖酵母]；[Davidow et al.(1985)Curr.Genet.1039；Gaillardin et al.(1985)Curr.Genet.1049，芪草酵母]。
在本发明中，可将选择性标记、复制起点和宿主细胞同源性序列置于表达载体中。选择性标记可用于筛选可能含有表达载体的宿主细胞。这种标记包括能使宿主细胞对诸如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、新霉素和四环素等药物具有抗性的标记。标记也可包括宿主细胞生长所需的生物合成基因，如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸合成途径中的基因。因此，当Leu(-)宿主细胞作为受体而用表达载体转化，而且培养基中缺少亮氨酸时，只有携有含Leu(+)基因质粒的细胞才能存活。
在本发明中，可将复制起点掺入表达载体中使载体能在宿主细胞中自主复制。这种复制起点包括能使表达载体在有合适蛋白存在下在细胞中以高拷贝数繁殖的复制起点，例如2μ和自主复制序列在酵母中是有效的，而病毒T-抗原复制起点在COS-7细胞中是有效的。
为了本发明的目的，表达载体可在细胞中整合到宿主细胞基因组中或保持自主状态。为整合到宿主基因组中，此处的表达载体可含有与宿主细胞基因组内的序列同源的多核苷酸序列。同源性序列不必与表达载体连接。[例如，表达载体可通过一个未连接的二氢叶酸还原酶基因整合到CHO基因组中。]在酵母中，同源序列最好邻接表达盒。本发明特别有效的同源酵母基因组序列是PCT WO90/001800所公开的序列，以及Genbank系列号J01331中所述的HIS4基因序列。
启动子、终止子和其它任选的表达载体元件的选择也取决于所选择的宿主细胞，这是本领域普通技术人员已知的。本发明不取决于所选择的宿主细胞。所需的蛋白表达水平及操作程序的简易将决定最适合的宿主细胞。在本领域中已知有许多宿主可用于表达并可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
例如，本发明中适合表达KGF片段或类似物的细菌宿主包括弯曲杆菌属、杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属。下列属中的酵母可作为宿主使用假丝酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、芪草酵母属。在本发明中可用作宿主的无限增殖哺乳动物细胞包括CHO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(“BHK”)细胞、猴肾细胞(“COS”)、人肝细胞癌细胞如HepG2。许多昆虫细胞宿主也适合表达KGF片段或类似物，这些昆虫包括埃及伊蚊、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、黑尾果蝇、草地夜蛾，参见PCT WO89/046699；Carbonell et al.J.Virol.56153(1985)；Wright，Nature 321718(1986)；Smith et al.，Mol.Cell Biol.32156(1983)；一般性叙述见Fraser，et al.in vitro Cell.Dev.Biol.25225(1989)。
将含有KGF片段或类似物的表达载体插入到宿主细胞中。任何本领域熟知的转化技术都可用于把表达载体插入到宿主细胞中。例如，细菌宿主的转化一般包括首先用CaCl2或其它试剂如二价阳离子和DMSO处理细菌，然后再把外源DNA导入处理过的细菌细胞中。DNA也可通过电穿孔或病毒侵染的方法导入细菌细胞。本发明可采用的细菌宿主转化方法包括在下列文献中描述的方法Massonet al.FEMS Microbiol.Lett.60273(1989)；Palva et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582(1982)；EP Pub.Nos.036259和063953；PCT WO84/04541，杆菌)，Miller et al.Proc.Natl.Acad.Sci.85856(1988)；Wanget al.J.Bacteriol.172949(1990)，弯曲杆菌)，Cohen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.692110(1973)；Dower et al.Nucleic Acids Res.166127(1988)Kushner“用ColE1衍生的质粒转化大肠杆菌的改进方法”，基因工程国际基因工程讨论会年数eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)(1978)Mandel et al.J.Mol.Biol.53159(1970)；Taketo，Biochim.Biophys.Acta 949318(1988)；埃希氏菌，Chassy et al.FEMS Microbiol.Lett.44173(1987)乳杆菌；Fiedler et al.Anal.Biochem.17038(1988)，假单胞菌；Angustin et al.FEMS Microbiol.Lett.66203(1990)，葡萄球菌，Barany et al.J.Bacteriol.144698(1980)；Harlander“乳酸链球菌电穿孔转化方法”，链球菌遗传学(ed.J.Ferretti和R.CurtissIII)(1987)Perry et al.Infec.Immun.321295(1981)；Powell et al.Appl.Environ.Microbiol.54655(1988)；Somkuti et al.Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412(1987)，链球菌。
本领域中熟知的转化酵母宿主的方法一般包括原生质球或经碱性阳离子处理过的完整酵母细胞的转化。酵母宿主也可用电穿孔法转化，参见Methods in Enzymology，Vol.194，1991，“酵母遗传学和分子生物学介绍”。本发明所使用的转化方法因所要转化酵母种属的不同而不同，包括下列文献中所述的方法Kurtz et al.Mol.Cell Biol.6142(1986)；Kunze et al.J.Basic Microbiol.25141(1985)；假丝酵母；Gleeson et al.J.Gen.Microbiol.1323459(1986)；Roggenkamp et al.Mol.Gen.Genet.202302(1986)；汉逊氏酵母；Das et al.J.Bacteriol.1581165(1984)；De Louvencourt et al.J.Bacteriol.1541165(1983)；Van den Berg et al.Bio/Technology 8135(1990)；克鲁维酵母；Cregget al.Mol.Cell Biol.53376(1985)；Kunze et al.J.Basic Microbiol.25141(1985)；美国专利4,837,148和4,929,555；毕赤酵母；Hinnen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929(1978)；Ito et al.J.Bacteriol.153163(1983)，酵母；Beach and Nurse，Nature 300706(1981)；裂殖酵母；Davidow et al.Curr.Genet.1039(1985)；Gaillardin et al.Curr.Genet.1049(1985)；芪草酵母。
本领域中用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的已知方法包括，例如，病毒感染、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸包入脂质体内，以及将DNA直接微注射到细胞核中。
用于将异源DNA导入杆状病毒形成表达载体的方法以及转化昆虫宿主细胞的方法也是本领域中熟知的，参见Smith et al.，Mol.CellBiol.32156(1983)；Lucklow and Smmers，Virology 1731(1989)。例如，KGF片段DNA可通过同源双交换重组而插入到多角体基因中。插入也可发生在所需杆状病毒基因中构建的限制酶位点处，参见Miller et al.Bioassays 491(1989)。KFG片段的DNA序列当代替多角体基因被克隆在表达载体中时，它的5’和3’端两侧都邻接多角体特异性序列并位于多角体启动子的下游。
在本发明的实施方案中，新形成的杆状病毒表达载体可以随后包装成具感染性的重组杆状病毒。在杆状病毒表达系统中，同源重组发生频率很低，约在1％和5％之间。因此，通常转染后形成的大部分杆状病毒仍是野生型病毒。然而重组病毒可用已知的方法识别。例如，天然病毒在病毒感染后期在感染细胞的细胞核内产生大量的多角体蛋白。积累的多角体蛋白形成含有包埋病毒颗粒的包含体。这些包含体大至15μm，高度折光，使其外观明亮，很容易在光学显微镜下观察到。由重组病毒感染的细胞中则无包含体。重组病毒和野生型病毒可通过涂布平皿来区分，即把转染上清液或其稀释液用标准技术涂布在单层昆虫细胞上。形成的噬菌斑可在光学显微镜下进行筛选，出现包含体的是野生型病毒，不出现包含体的则是重组病毒。参见“Current Protocols in Microbiology”Vol.2(Ausubel et al.eds)at 16.8(Supp.10，1990)。
可以利用本领域已知的免疫测定和活性测定法测定转化的宿主细胞是否表达所需的KGF片段。例如，免疫萤光测定法可直接在转化宿主细胞上进行而无须从细胞膜上分离KGF片段。在这种测定方法中，宿主细胞首先固定在固相载体如载玻片或微量滴定孔上。随后，使固定化的宿主细胞接触抗-KGF抗体。为了提高测定的灵敏度，固定化的细胞最好接触第二种抗体，该第二种抗体是有标记的并能与抗-KGF抗体结合。例如，第二种抗体可用荧光标记物标记。表达KGF片段的宿主细胞将被荧光标记并能在显微镜下观察到。
实施例1通过将人KGF cDNA克隆到如图1所示的pAcC 13 Pst/Not1表达载体中，将该cDNA插入到杆状病毒表达系统中。该质粒是从pAcC12衍生的，参见Munemitsu et al.Mol.Cell Biol.105977-5982(1990)。
根据现有的KGF N-末端氨基酸序列设计用于截短的18kd KGF的PCR寡核苷酸引物。参见Finch et al.Science 2752-755(1989)。在引物中掺入邻接限制位点(PstI和NotI)，以便亚克隆到pAcC13表达载体中，pAcC13是pVL941转移载体的衍生物，参Luckow et al.Virology 17031-39(1989)和Quilliam et al.Mol.Cell Biol.102901-2908(1990)。该表达载体是通过将KGF编码片段插入到pAcC13的PstI/NotI多接头位点中而构建的。该KGF cDNA编码成熟加工形式的KGF，即含有163个氨基酸残基，在第14到第16位残基上有一个潜在的N-糖基化位点的KGF。
条件培养基的准备草地夜蛾Sf9昆虫细胞用含有KGF1-163cDNA的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒感染。稀释到[XX10x]细胞/毫升后，在不含血清添加物、抗生素或杀真菌剂的Excell-400中培养细胞48-72小时。收集培养液并在10000×g下离心30分钟，去除上浮细胞及其它细胞碎片。该条件培养基然后用0.8μ滤膜(Millipore)过滤，大约5升这种培养基用具有3KDa截断分子量的Filtron盒系统(Omega膜)浓缩至200毫升。
浓缩后，经10000×g离心20分钟收集从转染的Sf9细胞中获得的条件培养基，然后该培养基用顺序的肝素琼脂糖(“HS”)亲和层析法纯化。在本发明的一个实施方案中，大约1升Sf9细胞条件培养基使用具有截断分子量为3-KDa的Omega膜(Filtron)进行超滤，产生200毫升超滤保留液。
HSAC和Mono S阳离子交换层析将上清液调至pH7.2。取30毫升样品上样到事先用10mMTris-HCl pH7.3、150mM NaCl缓冲液平衡过的肝素琼脂糖树脂上。树脂用平衡缓冲液充分洗至光吸收回到基线，然后将NaCl浓度从0.45M逐渐提高到1M和2M进行阶段洗脱。从各分部中取等份试样用于细胞增殖测试，合并1M分部中最高生物活性的部分，合并的分部用10mM Tris pH7.2缓冲液稀释5倍(终盐浓度为0.2M NaCl)，该样品用Super loop上样到连接FPLC系统(Pharmacia，Piscataway，NJ)的Mono S柱上。用线性梯度(10mM Tris pH7.3，0.2M NaCl到10mM Tris pH7.3，1M NaCl)洗脱。分部收集后测试各等份试样的生物活性，合并活性分部。
将保留液调至pH7.3，然后上样到含有大约30毫升床体积的HS柱上。该柱在4℃下展开约2小时。该柱用150毫升含有10mM Tris-HCl和0.15M NaCl的pH7.3平衡缓冲液中洗。滞留的蛋白用0.45M NaCl和1M NaCl洗脱。在洗脱时调节柱流速为约90毫升/小时，以3毫升为一分部进行收集。
将HS亲和层析步骤的有生物活性的1M NaCl分部合并，用10mM Tris pH7.3稀释5倍，然后直接上Mono S HR 5/5柱(Pharmacia)。滞留的蛋白用0.2MNaCl到1MNaCl梯度洗脱。活性分部的生物测定用Balb-Mk细胞系进行。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析由Mono S阳离子交换层析分离的生物活性蛋白分部。合并分部37-39和分部41-42，取10μl等份试样加入到SDS和10mMDTT中。将这些样品加热变性，然后在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后凝胶用银染色。样品无论在还原环境还是非还原环境中进行电泳都得到相似的迁移图谱。分部37-39中所含蛋白的表观分子量为25Kd，而分部41-42中所含蛋白的表观分子量为18Kd。
HS生物活性分部的层析图谱表明了分部31到47的Balb/Mk生物活性分布，证明有2种分子存在，一种在0.55M NaCl处洗脱，另一种在0.6M NaCl处洗脱。
KGF活性的测定所获分部中KGF活力的测定是基于各分部促进BALB/C-Mk细胞生长的能力。为此，从某些分部中取10μl等份样品稀释到1毫升含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液(“PBS”)中，从稀释的分部中取10μl测试列接种在12孔聚簇板上的BALB/C-Mk细胞的生长刺激活性，每板有若干22mm的孔，每孔中有5×103个细胞。测得所有KGF活性都滞留在柱中并由1M NaCl洗脱下来。
用1M NaCl从HS柱上洗脱下来的KGF生物活性分部用阳离子交换FPLC柱层析法进一步纯化。将这些分部合并，用10mM TrispH7.3缓冲液稀释5倍，然后直接上Mono S HR 5/5柱(Pharmacia)。
滞留在Mono S HR 5/5柱中的蛋白用0.2M NaCl到1M NaCl梯度洗脱。洗脱出的分部生物活性的测定用上述方法使用BALB/C-Mk细胞进行。图3表明分部31到47的活性分布。
在促细胞分裂测定中，在每孔装有1ml补充10％小牛血清和抗生素的DMEM的12孔聚簇板中，每孔接种104个ABAE细胞和5×103个ACE细胞，接种密度为5×103个细胞/孔。参见Bohlen et al.EMBO41951-1956(1985)；Gospodarowicz et al.J.Cell Physiol.127121-136(1986)；Bellosta et al.J.Cell Biol.121705-713(1993)。在6小时培养后，以三个平行孔为一组用胰蛋白酶消化，然后计数细胞以确定平板效率。在第1、第3和第5天，从适当稀释过的每个样品中取10μl等份试样重复三次加到板上的孔内。经6天培养后，所有板用胰蛋白酶消化，然后用Coulter计数器(Coulter Electronics，Hialeah，FL)测定细胞密度。
在第1天及以后每隔1天以指定的浓度加入KGF或碱性FGF。经5天培养后，细胞用胰蛋白酶消化，用Coulter计数器测定最终细胞密度。
电泳(NaDodSO4/PAGE)按照由Laemmli et al.Nature 227680-685(1970)描述的步骤用NaDodSO4制备聚丙烯酰胺凝胶。将样品在10mM DTT存在下煮沸3分钟，然后在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶经固定后用BioRad的试剂和方法进行银染色，参见Merri et al.Science 2111437-1438。合适的分子量标记是BioRad产品。
细胞增殖测定柱分部和纯化过的样品的促细胞分裂活性用Balb/Mk细胞作为靶细胞进行测定。将贮存培养物培养和保持在改良的低钙伊格耳氏培养基中，该培养基中补充了10％FCS、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B和10ng/ml aFGF。参见Gospodarowicz et al.J.Cell Physiol.142325-333。为进行促细胞分裂测定，细胞以每孔5×103到1×104个细胞的密度在1ml补充了10％FCS的低钙MEM中接种在12孔的聚簇板上(如Gospodarowicz等人所述)。样品的加入和细胞培养5天后最终细胞密度的测定按照Gospodarowicz等人所述进行。
最终纯化的物质促细胞分裂活性的测试在成年牛主动脉内皮细胞(“ABAE”)和肾上腺皮质衍生的毛细血管内皮细胞(“ACE”细胞)上进行，参见Gospodarowicz et al.Proc.Natl.Acad.Sci.734120-4124(1976)。贮存培养物在补充了10％FCS、50μg/ml庆大霉素和0.25μg/ml两性霉素B的DMEM存在下保持，每星期在明胶化的组织培养皿上以1∶10的分流比传代一次。
使用本领域中熟知的标准方法，确定了KGFdesl-23N-末端第1到20位确实的氨基酸序列如下S1Y D M5E G G D I R V R R L F X R T Q本发明也包括编码KGFdesl-23以及其它相对于FGF族中其它成员缺少了KGF163特有的非保守N-末端的较短KGF的DNA片段。
蛋白微量测序取二份标称100皮摩尔KGF163和KGFdesl-23样品进行埃德曼降解，并在离心吸附在聚偏二氟乙烯(PVDF，Applied Biosystems Biospin)上后进行氨基酸分析。样品加在Applied Biosystems 477A气相蛋白测序仪上。使用Applied Biosystems提供的标准软件和化学试剂进行了20次埃德曼降解，PTH氨基酸的鉴定用自动联机HPLC柱(120A型，Applied Biosystems)进行。
权利要求
1.一种角质形成细胞生长因子片段，该片段包含成熟全长角质形成细胞生长因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子至少高2倍的促细胞分裂活性，并缺少含有成熟的全长角质形成细胞生长因子头23个N末端氨基酸残基的序列。
2.权利要求1所述的角质形成细胞生长因子片段，其中该片段具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子高7倍的促细胞分裂活性。
3.权利要求1所述的角质形成细胞生长因子片段，其中该片段具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子高10倍的促细胞分裂活性。
4.权利要求1所述的角质形成细胞生长因子片段，其中该片段具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子降低了的细胞毒性。
5.一种结合物，该结合物含有(a)一种角质形成细胞生长因子片段，该片段包含成熟全长角质形成细胞生长因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子至少高2倍的促细胞分裂活性，并缺少含有成熟的全长角质形成细胞生长因子头23个N末端氨基酸残基的序列；(b)一种毒素分子。
6.权利要求5的结合物，其中毒素分子选自蓖麻毒蛋白A、白喉毒素和皂草素。
7.权利要求5的结合物，其中所述片段具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子高7倍的促细胞分裂活性。
8.权利要求5的结合物，其中所述片段具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子高10倍的促细胞分裂活性。
9.一种治疗组合物，该组合物含有(a)一种角质形成细胞生长因子片段，该片段包含成熟全长角质形成细胞生长因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重组全长角质形成细胞生长因子至少高2倍的促细胞分裂活性，并缺少含有成熟的全长角质形成细胞生长因子头23个N末端氨基酸残基的序列；(b)一种药学上可接受的载体。
10.一种DNA分子，该DNA分子含有编码权利要求1的角质形成细胞生长因子片段的核苷酸序列。
11.一种DNA分子，该DNA分子含有编码权利要求2的角质形成细胞生长因子片段的核苷酸序列。
12.一种DNA分子，该DNA分子含有编码权利要求3的角质形成细胞生长因子片段的核苷酸序列。
13.一种表达载体，该表达载体含有权利要求10的DNA分子和用于该DNA分子表达的调控序列。
14.权利要求13所述的表达载体，其中该载体是杆状病毒。
15.一种用权利要求13的表达载体转化的宿主细胞。
16.权利要求15所述的宿主细胞，其中该细胞选自细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
17.一种制备角质形成细胞生长因子片段的方法，该方法包括培养权利要求15的宿主细胞，从培养物中分离角质形成细胞生长因子片段。
18.一种伤口愈合方法，该方法包括在需治疗的伤口部位施用权利要求9的治疗组合物并让伤口愈合。
19.一种治疗表皮过度增生疾病的方法，该方法包括在需要治疗的部位施用权利要求5的结合物。
20.权利要求19所述的治疗方法，其中所述疾病选自牛皮癣和基细胞癌。
全文摘要
本发明涉及由成熟全长角质形成细胞生长因子KGF
文档编号C12N15/12GK1129955SQ94193193
公开日1996年8月28日 申请日期1994年4月28日 优先权日1993年6月29日
发明者D·J·戈斯波达罗维茨, F·马西阿茨 申请人:奇龙公司