专利名称：：特异性识别发育调控蛋白qBrn－2的抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于遗传工程，特别涉及特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体及其制备方法和用途。神经系统是动物胚胎发育中最早形成的系统之一，它在动物的生长发育、再生、衰老及行为和学习等许多生命现象中起着十分重要的作用。神经发育生物学是发育生物学的一个重要分支，是目前系统动物发育基因研究的主战场。对中枢神经系统的形态发生、细胞分化和功能区域定位过程中的基因水平的调控机理的认识是分子神经发育生物学中的关键问题之一。发育基因的研究是一门跨世纪的新的综合性的边缘学科。分子神经发育生物学不仅涉及生物学和医学的基础理论研究，同时在提高我国人口素质、优生优育、减少和控制与神经系统有关的遗传疾病方面有着广泛的应用前景。发育生物学的研究至今虽不过一二十年，却已经取得相当惊人的发展。现在证明，发育基因在动物胚胎发育过程中对形态发生和器官形成起着直接调控作用。这一领域的研究成果，很可能用于以基因工程手段防治遗传疾病的技术和新的高科技药物市场。现在已经发现一些调控蛋白分子在神经系统发育中起着关键作用。如，Hox基因在小鼠菱脑的表达模式与其分节结构非常吻合，在菱脑每一个分节的Hox基因的组合决定了这一部位的特性(Krumlauf,1993.遗传学趋势(TrendsGenet.)9:106-112.)。POU家族转录因子对神经系统的发育也起着非常重要的作用。如这一家族的Tst-1/Oct-6/SCIP主要在少树突神经胶质细胞的前体和发育中的施旺氏细胞中表达，这两种细胞分别负责中枢神经系统和外周神经系统覆盖髓鞘的过程。当这一基因被敲除后，中枢神经系统的髓鞘虽未受明显影响，但外周神经系统的髓鞘却受到严重损伤(Berminghametal1996.基因和发育(GenesDev)10:1751-1762；Jaegleetal1996.科学(Science)273:507-510)。又如，Brn-2在胚胎早期发生中的神经管广泛表达，其正常的生理功能对于下丘脑和垂体后叶的某些神经元的发育是必须的(Nakaietal1995.基因和发育(GenesDev)9:3109-3121；Schonemannetal1995.基因和发育(GenesDev)9:3122-3135)。在人类中，某些POU转录因子发生突变可以引起神经系统的疾病，如与镫骨相关的耳聋就是POU3F4突变所致(deKoketal1995，科学(Science)267:685-688)。到目前为止，虽然已经从很多物种里发现了POU转录因子(有关综述可以参阅Ryanetal1997.基因和发育(GenesDev)11:1207-1225；Veenstraetal1997.分子生物学报告(MolecularBiologyReports)24:139-155)，但是特异性识别这些转录因子的抗体却为数很少，使对这些转录因子的功能的认识受到很大局限。例如，XLPOU3在早期爪蟾胚胎发生中的表达模式(Baltzingeretal.发育的机制(MechDev)58,103-114),Brn-2在大鼠中的表达模式(Alvarez-Boladoetal.比较神经学杂志(TheJournalofComparativeNeurology)355,237-295)都是由反义核酸探针得到的结果。这些结果虽然使人们对这些基因的表达有了一定认识，但是对另外一些重要信息却无能为力，如这些基因的编码蛋白在动物胚胎发育中各个组织的分布及细胞内定位，信息核酸(mRNA)与其编码蛋白在时间上和空间上是否一致，编码蛋白是否存在转录后修饰。另外从方法上看，用反义核酸探针(anti-senseRNAprobe)操作复杂，而且对于每种动物都要制备相应的探针。本发明的目的是获得可以特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，为研究qBrn-2蛋白的结构与功能的关系、在胚胎发育中的表达模式及其对发育过程的调控作用提供一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体及其制备方法和用途。本发明的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体是一个以重组多肽为抗原免疫哺乳动物获得的多克隆抗体，这一多肽为基因重组表达和纯化的qBrn-2的N-末端非保守性肽段；这一抗体对发育调控蛋白qBrn-2的识别位点为qBrn-2的N-末端的非保守性的氨基酸序列，该抗体不识别其它POU结构域蛋白；在Western印记实验中，该抗体特异地识别单一的蛋白；利用免疫组织化学接示的qBrn-2表达模式与分子原位杂交的结果高度一致。例如在Western印记实验中，该抗体特异地识别孵化三天的鹌鹑胚胎中单一的蛋白，其表观分子量为56,000。其二，利用该抗体接示的qBrn-2表达模式于分子原位杂交的结果高度一致。所述的重组多肽是选取qBrn-2的cDNA的POU盒上游区或化学合成的cDNA，经基因重组表达和纯化，得到的多肽或融合多肽；或按照qBrn-2的cDNA的POU盒上游区所编码的氨基酸序列化学合成的多肽或融合多肽。所述的选取qBrn-2的cDNA的POU盒上游区或化学合成的cDNA是指qBrn-2的cDNA或化学合成的-4～621片段。所述的选取qBrn-2的cDNA或化学合成的-4～621片段的序列及其编码氨基酸序列为AGTCATGGCGACCGCAGCCTCCAACCACTACAGCMATAASNHYS1053CTGCTCGCCTCCGGCTCGCCCATGGTGCACGCCGAGCCGCCCGGCGGCATGCAGCCCGGCLLASGSPMVHAEPPGGMQPG30113GGAGGCTACCGCGACGCGGGCGCGCTGGTGCAGGCGGACTACGCGCTGCAGAGCAACGGGGGYRDAGALVQADYALQSNG50173CACCCGCTGAGCCACGCTCACCAGTGGATCGCCGCGCTGTCCCACGGCGGCCCCGGCGGCHPLSHAHQWIAALSHGGPGG70233GGCGGCGGAGGAGGGGGCGGCGGCGGCGGAGGGGGCGGCGGAGGCGGCGAGGCTCCCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGEAPW90293GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGCGCGCTGGGCCCGCCCGACATCAAGCCGGCCGCGAAAAAAAAGALGPPDIKPAA110353GTGCAGGCGGCCCCGCGCGGCGACGAGCTGCCGCCGCCTCCGCAGCACCCGCCGCCGCCGVQAAPRGDELPPPPQHPPPP130413GGCCGAGCCCCGCACCTGGTGCACCACGGCGGCGGAGGCGGCGGGCACCACGCGGCGTGGGRAPHLVHHGGGGGGHHAAW150473CGGGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGCCGGGCATGGCCGCGGCCAACGGAGCGGCGCAGRAGGAAHLPPGMAAANGAAQ170533GCGGGGCTGCTGTACCCGCAGCCGCCCGGCTTCACCGTGAACGGCATGTTGGGCGCCGCGAGLLYPQPPGFTVNGMLGAA190593CAGCCCGCCCTGCACCACCACGGCCTCCGCGACGCCCACGACGAGGCTCCC596QPALHHHGLRDAHDEAP207所述的qBrn-2的cDNA序列及其编码的氨基酸序列为阴影部分为POU盒。本发明特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法包括(1)．选取qBrn-2的POU盒上游区或化学合成的cDNA，构建表达质粒；(2)．将表达质粒导入宿主系统进行表达，经纯化获得电泳纯重组多肽；(3)．以这一电泳纯重组多肽为抗原，免疫哺乳动物获得特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，命名为anti-qBrn-2。所述的qBrn-2的POU盒上游区是指发育调控蛋白qBrn-2的1～207个氨基酸的编码序列。所述的将表达质粒导入宿主系统进行表达是指将pET导入BL21(DE3)；所述的电泳纯重组多肽的纯化是利用其N-末端添加His-tag，用Ni++-chelatingSepharose4B分离纯化。所述的pET是指pET3b207或phis207。所述的表达质粒pET3b207的构建是用HinfⅠ和SmaⅠ酶切qBrn-2cDNA，取其位置位于-4～621的HinfⅠ-SmaⅠ片段，用KlenowDNA聚合酶将末端补平，连接12mer的BamHⅠlinker；经BamHⅠ酶切后，将这一片段克隆至pET3b的BamHⅠ位点，形成表达质粒pET3b207；所述的表达质粒pHis207的构建，是用pET28a的XbaⅠ-NdeⅠ片段置换pET3b207的XbaⅠ-NdeⅠ片段，形成表达质粒phis207，这样就在表达质粒pHis207的N-末端添加了His-tag编码区。所述的重组多肽的表达是将pET3b207或phis207用CaCl2法转化BL21(DE3)菌株，用LB37℃液体培养；当OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为0.05～0.4mM的IPTG，继续培养2～3小时，离心收集菌体；pHis207所表达蛋白的纯化是用添加蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲液悬浮菌体，其中磷酸缓冲液的pH7.3,aprotinin1μg/ml,PMSF100μg/ml；每1升培养液用50ml缓冲液悬浮，于冰浴中超声裂解菌体；随后，加入终浓度为1％的TritonX-100，轻轻搅拌均匀30分钟；离心取上清，其中离心条件温度为4℃，转速为10000rpm，用Ni++-chelatingSepharose4B柱亲和吸附，用40mM咪唑洗脱除去杂蛋白；然后收集200mM咪唑洗脱组分，透析，冰冻干燥获得电泳纯重组多肽。所述的哺乳动物是新西兰白兔、小鼠、大鼠、荷兰猪、山羊、绵羊、马或牛。所述的免疫过程为将获得的电泳纯重组多肽作抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮下注射；首次免疫时，每只兔子使用的剂量为将1.0mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏完全作剂，充分混匀的混合物；28天后，加强免疫，每只兔子使用的剂量为将0.5mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏不完全作剂，充分混匀的混合物；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免疫10天后开始取耳缘静脉血检测效价，收集适合Western印记实验和免疫组织化学实验的抗血清，分装，于-80℃冻存。本发明特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的用途，其特征在于该抗体特异性识别神经发育调控蛋白qBrn-2及其同源蛋白，因此该抗体可以用于研究qBrn-2在胚胎发育中的表达模式和发育中的调控作用；研究qBrn-2与其靶DNA的相互作用及其与qBrn-2协同蛋白的相互作用。所述的特异性识别的方式是通过酶、生物素、荧光素、生色化学基团、放射性同位素或电泳迁移率的变化，检测神经发育调控蛋白qBrn-2蛋白及其同源蛋白。所述的研究qBrn-2在胚胎发育中的表达模式和发育中的调控作用的途径是石蜡切片、冰冻切片、全胚或细胞培养的免疫组织化学；研究qBrn-2与其靶DNA的相互作用及其与qBrn-2协同蛋白的相互作用的途径是EMSA(electrophoresismobilityshiftassay)。本发明的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体可以在细胞水平上接示qBrn-2及其脊椎动物中的同源蛋白在胚胎发育中的表达模式及调控作用；研究发育调控蛋白qBrn-2及其脊椎动物中的同源蛋白与其靶DNA的相互作用，及与其协同蛋白的相互作用。在方法上，操作十分简便。下面结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。图1、qBrn-2cDNA的结构；图2、pET3b207和pHis207的结构图及重组多肽His-P207的纯化；图3、anti-qBrn-2的特异性；图3A、Westernblot结果，anti-qBrn-2识别单一的蛋白(56,000)；图3B、E3鹌鹑的分子原位杂交结果，标尺(B,C)=1mm；图3C、邻片的免疫组织化学结果，标尺(B,C)=1mm；图4、14体节鹌鹑胚胎全胚的免疫组织化学结果；qBrn-2在整个神经管、视泡、耳窝有明显表达；图5、anti-qBrn-2揭示的qBrn-2在E4中的表达模式；切片是位于后肢部E4的横切片，qBrn-2在神经管、生肌节、脊索中表达；NT，神经管；NC，脊索；Myo，生肌节；标尺=53μm；图6、EMSA接示的发育调控蛋白qBrn-2与其靶DNA的相互作用；图中标示1．分子量标记2．诱导前3．诱导后4．分子量标记5．诱导前6．诱导后7．超声裂解上清液8．超声裂解沉淀9．过柱穿透液10．20mM咪唑洗脱液11．40mM咪唑洗脱液12．200mM咪唑洗脱液13．E3.5头14．E3.5躯干15.E5.5头16．E5.5躯干17．成体脑18．成体肾19．实施例7的样120．实施例7的样221．实施例7的样322．实施例7的样4T．端脑D．间脑M．中脑R．菱脑F．代表未结合的探针以下实施例所用的qBrn-2的cDNA为本实验室自主克隆(GenbankAF091043),表达载体为pET3b(Novagen),Ni++-chelatingSepharose4B(Pharmacia)，新西兰白兔(301医院)，种鹌鹑(北京种禽公司)，HRP-goatantirabbitIgG(Vector)。实施例1qBrn-2的cDNA的分子克隆。步骤1筛库探针的制备合成如下寡核苷酸序列引物1:5’CGACCTGGAGCAGTTCGCCAA3’引物2:5’AACCAGACACGCACCACCT3’取孵化五天的鹌鹑胚胎，采用mRNApurificationkit和cDNAsynthesiskit(PharmaciaBiotech),Inc)，按照产品说明书提供的的方法，制备cDNA。利用引物1和引物2，进行PCR实验，使用TaqDNA聚合酶。97℃保温10分钟后，进入如下循环，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，94℃变性1分钟，循环35次，得到筛库DNA片段，序列为1CGACCTGGAGCAGTTCGCCAAGCAGTTCAAGCAACGACGCATCAAGCTGGGCTTCACCCA61GGCCGACGTGGGACTGGCGCTGGGCACCCTCTACGGTAACGTGTTCTCGCAGACCACCAT121CTGCCGTTTCGAGGCCCTGCAGCTGAGCTTCAAGAACATGTGCAAGCTCAAGCCGCTGCT181CAACAAGTGGCTGGAGGAGACCGACTCGTCCAGCGGCAGCCCCACCAACCTGGACAAGAT241CGCGGCGCAGGGCCGCAAGCGCAAGAAGCGCACGTCCATCGAGGTGGGTGTCAAAGGCGC301GCTCGGCCGTCTGCAGAGCCACTTTCTCAAGTGTCCCAAGCACGAGATCACCGGCCTGGC361CGACAGCCTGCAACTGGAGAAGGAGGTGGTGCGTGTCTGGTT采用随机引物标记法，将该DNA片段进行32p标记，制备成为筛库探针。步骤2孵化五天的鹌鹑的全胚胎cDNA文库的构建。取孵化五天的鹌鹑胚胎，按步骤1的方法制备cDNA，末端连接EcoRⅠadaptor，然后克隆至pBluescriptSK载体中，转化DH5α菌株感受态细胞，构建成孵化五天的鹌鹑的全胚胎cDNA文库。扩增前该文库为3×105个克隆。步骤3用步骤1制备的探针对步骤2制备的文库进行筛选，采用常规方法(分子克隆，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)，得到发育调控蛋白qBrn-2的cDNA克隆，其序列如说明书中所示。实施例2表达质粒的构建。用HinfⅠ和SmaⅠ酶切qBrn-2cDNA(图1)，取HinfⅠ-SmaⅠ(-4～621)片段，用KlenowDNA聚合酶将末端补平，连接BamHⅠlinker(12mer)。经BamHⅠ酶切后，将这一片段克隆至pET3b的BamHⅠ位点，形成pET3b207。为便于后期纯化这一重组多肽，用pET28a的XbaⅠ-NdeⅠ(His-tag编码区)片段置换pET3b207的XbaⅠ-NdeⅠ片段，形成phis207(图2)。酶切图谱和DNA测序结果表明表达质粒的构建准确无误。实施例3重组多肽的的表达和纯化。将pHis207转化BL21(DE3)菌株，用LB37℃液体培养。当OD600=0.6时，加入IPTG(终浓度0.4mM)，继续培养3小时，离心收集菌体。用添加蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲液(pH7.3,aprotinin1μg/ml,PMSF100μg/ml)悬浮菌体，每1升培养液用50ml缓冲液悬浮，于冰浴中超声裂解菌体。随后，加入TritonX-100(终浓度1％)，轻轻搅拌均匀30分钟。离心取上清(4℃,10000rpm)，用Ni++-chelatingSepharose4B柱亲和吸附，用40mM咪唑洗脱除去杂蛋白。然后收集200mM咪唑洗脱组分，透析，冰冻干燥，得到电泳纯重组多肽(图2)。实施例4抗血清anti-qBrn-2的制备。取实施例2中获得的电泳纯重组多肽作抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮下注射；首次免疫时，每只兔子使用的剂量为将1.0mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏完全作剂，充分混匀的混合物；28天后，加强免疫，每只兔子使用的剂量为将0.5mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏不完全作剂，充分混匀的混合物；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免疫10天后开始取耳缘静脉血检测效价，收集适合Western印记实验和免疫组织化学实验的抗血清，分装，于-80℃冻存实施例5抗血清的特异性。anti-qBrn-2具有良好的特异性，这由以下结果证明。其一，Western印记实验。取孵化3.5天，5.5天鹌鹑胚胎的头部及躯干，成体鹌鹑脑、肾组织，加相当于组织体积1～2倍的悬浮缓冲液(0.1MNaCl,0.01MTris-Cl(pH7.6),0.001MEDTA(pH8.0),1μg/mLaprotinin,100μg/mLPMSF),将组织剪碎，然后迅速加入0.5体积的3倍的SDS-PAGE上样缓冲液(150mMTris-Cl(pH6.8),300mMDTT,6％SDS,0.3％溴酚蓝，30％甘油)，水浴煮10分钟。离心(14000rpm,4℃)取上清，确定各个上清液的蛋白浓度，方法如下。各取1μl上清液，加入200μl双蒸水中。同时分别取5,10,15,20,25μg牛血清白蛋白，加双蒸水至200μl。在每管中依次加入20μl0.15％脱氧胆酸钠和20μl72％三氯乙酸，离心(3000g)，取沉淀，然后用Lorry法测蛋白浓度。在免疫印记实验时，各取70μg蛋白，进行SDS-PAGE(12％)。电泳，然后电转移至硝酸纤维素膜上。随后，用溶液(PBS+0.2％Tween20+5％skimmilk+5％山羊血清)孵浴此膜以封闭非特异性位点，然后用一抗溶液(PBS+0.2％Tween20+5％skimmilk+5％山羊血清+1∶800anti-qBrn-2)孵浴此膜，再用溶液(PBS+0.2％Tween20+5％skimmilk+5％山羊血清)充分漂洗以除去过剩的一抗，接下来用二抗溶液(PBS+0.2％Tween20+5％skimmilk+5％山羊血清+HRP-goatantirabbitIgG,1∶20,000,Vector)特异性识别一抗，最后用ECL试剂(Dupont)浸润，X-片曝光，标记位置。结果表明，anti-qBrn-2可以特异地识别单一的蛋白(图3A)，说明它具有良好的特异性。其二，免疫组织化学与分子原位杂交结果的高度一致。取孵化3天鹌鹑的纵切片，分别做免疫组织化学和分子原位杂交，方法参照以往报道(Xue1993.发育机制(MechDev)43:149-158)。结果发现，二者揭示的表达模式高度吻合，qBrn-2在脑部和脊髓的神经管中广泛表达(图3B,C)，说明这一抗体所识别的蛋白正是qBrn-2。实验中的免疫组织化学的方法具体为，取石蜡切片，脱腊加水，用封闭液(PBS+0.15％Tween20+3％脱脂牛奶+5％山羊血清)除去非特异性结合位点，然后将anti-qBrn-2(1∶200)溶于封闭液中4℃孵育切片过夜。接下来用封闭液洗去未结合的一抗，将二抗(1∶2000,goatantirabbitIgG,Vector)溶于封闭液中孵育切片室温2小时，最后用PBS洗去多余二抗，DAB显色，镜检。实施例6anti-qBrn-2适用于全胚的免疫组织化学。取孵化一至两天的鹌鹑胚胎(具体发育期按体节数判定)，用PBS缓冲液清洗三次，然后用4％的多聚甲醛固定2小时。随后用PBS缓冲液清洗胚胎除去剩余的多聚甲醛，用3％H2O2于摇床上孵浴2小时。接下来用溶液PBS-A(PBS+0.2％TritonX-100+2％skimmilk+5％山羊血清)于摇床上孵浴1.5小时以除去非特异性结合位点。随后用anti-qBrn-2溶液(PBS-A+anti-qBrn-2,1∶200)4℃孵浴过夜。次日，用PBS-A充分漂洗以除去未结合的抗体。随后用二抗溶液(PBS-A+山羊抗兔IgG,1∶2000)孵浴2小时。最后用PBS充分漂洗，DAB显色(300μl/mlDAB,0.03％H2O2)。图4是一个14体节的胚胎全胚免疫组织化学结果，可以看到qBrn-2在神经管、视泡、耳窝有明显表达(图4)。实施例7anti-qBrn-2适用于切片上免疫组织化学。取孵化4天的鹌鹑胚胎，用4％多聚甲醛固定，制备石蜡切片(7μm)，按实施例4中的免疫组化方法操作，结果显示qBrn-2在神经管、生肌节、脊索有明显表达(图5)，在高倍镜下可以看到免疫标记位置位于神经上皮细胞的胞核内，与其作为转录因子的功能非常吻合，这些结果提示qBrn-2在这些部位的发育中起重要的作用。实施例8anti-qBrn-2适用于研究qBrn-2DNA相互作用。步骤1细胞全蛋白的提取。取孵化3.5天的鹌鹑胚胎3只，用PBS缓冲液清洗，加0.5ml缓冲液匀浆(5mMHepes(pH7.9),26％glycerol(v/v),1.5mMMgCl2,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,0.5mMPMSF)。此时测量组织悬浮液体积，加NaCl至300mM，混匀，冰浴30分钟。随后离心取上清液(24000g，分钟，4℃)，分装，于干冰/乙醇中速冻后，-70℃存。上述全细胞提取液的蛋白浓度由Lorry法测定。步骤2探针的制备。合成如下DNA序列a:5’AGCTTGCATAAATAATAGGC3’b:5’TCGAGCCTATTATTTATGCA3’将上述序列a和序列b用双蒸水溶解，按等摩尔混匀，终浓度为2pmol/μl。将此溶液于80℃水浴5分钟，随后缓慢冷却至室温，取2pmol进行32-P标记，采用Klenow聚合酶末端补平法，用SephadexG-50除去游离的dNTP。此时将体积调至200μl。步骤3蛋白与DNA的结合。按下表配制表1蛋白与DNA的结合<tablesid="table1"num="001"><table>缓冲液*KCl终浓度poly(dIdC)蛋白提取液anti-qBrn-21∶10免疫前血清1∶10样1样2样3样4至20μl至20μl至20μl至20μl50mM50mM50mM50mM2μg2μg2μg2μg15μg15μg15μg0001μl00001μl</table></tables>缓冲液*20mMHepes(pH7.9)，1mMMgCl2,4％Ficoll,0.5mMDTT。接下来，冰浴30分钟。随后，在样1,2,3,4中各加入探针1μl。然后，再冰浴40分钟。最后，电泳4％PAGE,0.25xTBE，放射自显影。结果发现，加入anti-qBrn-2后，其中一条带且仅有一条带消失(图6，尖头所指位置)，说明这条带是qBrn-2与探针结合产生的。权利要求1．一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，其特征在于是一个以重组多肽或化学合成多肽为抗原免疫哺乳动物获得的多克隆抗体，这一抗体对发育调控蛋白qBrn-2的识别位点为qBrn-2的N-末端的非保守性的氨基酸序列，该抗体不识别其它POU结构域蛋白；在Western印记实验中，该抗体特异地识别单一的蛋白；利用免疫组织化学接示的qBrn-2表达模式与分子原位杂交的结果高度一致。2．如权利要求1所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，其特征在于所述的重组多肽是选取qBrn-2的cDNA的POU盒上游区或化学合成的cDNA，经基因重组表达和纯化，得到的多肽或融合多肽；或按照qBrn-2的cDNA的POU盒上游区所编码的氨基酸序列化学合成的多肽或融合多肽。3．如权利要求2所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，其特征在于所述的选取qBrn-2的cDNA的POU盒上游区或化学合成的cDNA是指qBrn-2的cDNA或化学合成的-4～621片段。4．如权利要求3所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，其特征在于所述的选取qBrn-2的cDNA或化学合成的-4～621片段的序列及其编码氨基酸序列为AGTCATGGCGACCGCAGCCTCCAACCACTACAGCMATAASNHYS1053CTGCTCGCCTCCGGCTCGCCCATGGTGCACGCCGAGCCGCCCGGCGGCATGCAGCCCGGCLLASGSPMVHAEPPGGMQPG30113GGAGGCTACCGCGACGCGGGCGCGCTGGTGCAGGCGGACTACGCGCTGCAGAGCAACGGGGGYRDAGALVQADYALQSNG50173CACCCGCTGAGCCACGCTCACCAGTGGATCGCCGCGCTGTCCCACGGCGGCCCCGGCGGCHPLSHAHQWIAALSHGGPGG70233GGCGGCGGAGGAGGGGGCGGCGGCGGCGGAGGGGGCGGCGGAGGCGGCGAGGCTCCCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGEAPW90293GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGCGCGCTGGGCCCGCCCGACATCAAGCCGGCCGCGAAAAAAAAGALGPPDIKPAA110353GTGCAGGCGGCCCCGCGCGGCGACGAGCTGCCGCCGCCTCCGCAGCACCCGCCGCCGCCGVQAAPRGDELPPPPQHPPPP130413GGCCGAGCCCCGCACCTGGTGCACCACGGCGGCGGAGGCGGCGGGCACCACGCGGCGTGGGRAPHLVHHGGGGGGHHAAW150473CGGGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGCCGGGCATGGCCGCGGCCAACGGAGCGGCGCAGRAGGAAHLPPGMAAANGAAQ170533GCGGGGCTGCTGTACCCGCAGCCGCCCGGCTTCACCGTGAACGGCATGTTGGGCGCCGCGAGLLYPQPPGFTVNGMLGAA190593CAGCCCGCCCTGCACCACCACGGCCTCCGCGACGCCCACGACGAGGCTCCC596QPALHHHGLRDAHDEAP2075．如权利要求2所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，其特征在于所述的qBrn-2的cDNA序列及其编码的氨基酸序列为6．如权利要求1-5所述的一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于该方法包括(1)．选取qBrn-2的POU盒上游区或化学合成的cDNA，构建表达质粒；(2)．将表达质粒导入宿主系统进行表达，经纯化获得电泳纯重组多肽；(3)．以这一电泳纯重组多肽为抗原，免疫哺乳动物获得特异性识别发育调控蛋白qBrn-2的抗体，命名为anti-qBrn-2。7．如权利要求6所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的qBrn-2的POU盒上游区是指发育调控蛋白qBrn-2的1～207个氨基酸的编码序列。8．如权利要求6所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的将表达质粒导入宿主系统进行表达是指将pET导入BL21(DE3)；所述的电泳纯重组多肽的纯化是利用其N-末端添加His-tag，用Ni++-chelatingSepharose4B分离纯化。9．如权利要求8所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的pET是指pET3b207或pHis207。10．如权利要求9所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的表达质粒pET3b207的构建是用HinfⅠ和SmaⅠ酶切qBrn-2cDNA，取其位置位于-4～621的HinfⅠ-SmaⅠ片段，用KlenowDNA聚合酶将末端补平，连接12mer的BamHⅠlinker；经BamHⅠ酶切后，将这一片段克隆至pET3b的BamHⅠ位点，形成表达质粒pET3b207；所述的表达质粒phis207的构建，是用pET28a的XbaⅠ-NdeⅠ片段置换pET3b207的XbaⅠ-NdeⅠ片段，形成表达质粒pHis207，这样就在表达质粒pHis207的N-末端添加了His-tag编码区。11．如权利要求8所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的重组多肽的表达是将pET3b207或pHis207用CaCl2法转化BL21(DE3)菌株，用LB37℃液体培养；当OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为0.05～0.4mM的IPTG，继续培养2～3小时，离心收集菌体；phis207所表达蛋白的纯化是用添加蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲液悬浮菌体，其中磷酸缓冲液的pH7.3，aprotinin1μg/ml,PMSF100μg/ml；每1升培养液用50ml缓冲液悬浮，于冰浴中超声裂解菌体；随后，加入终浓度为1％的TritonX-100，轻轻搅拌均匀30分钟；离心取上清，其中离心条件温度为4℃，转速为10000rpm，用Ni++-chelatingSepharose4B柱亲和吸附，用40mM咪唑洗脱除去杂蛋白；然后收集200mM咪唑洗脱组分，透析，冰冻干燥获得电泳纯重组多肽。12．如权利要求6所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn～2抗体的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物是新西兰白兔、小鼠、大鼠、荷兰猪、山羊、绵羊、马或牛。13．如权利要求6所述的特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫过程为将获得的电泳纯重组多肽作抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮下注射；首次免疫时，每只兔子使用的剂量为将1.0mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏完全作剂，充分混匀的混合物；28天后，加强免疫，每只兔子使用的剂量为将0.5mg电泳纯重组多肽，溶解在1.0ml磷酸缓冲液中，添加1.0ml弗氏不完全作剂，充分混匀的混合物；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免疫10天后开始取耳缘静脉血检测效价，收集适合Western印记实验和免疫组织化学实验的抗血清，分装，于-80℃冻存。14．如权利要求1-5所述的一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的用途，其特征在于该抗体特异性识别神经发育调控蛋白qBrn-2及其同源蛋白，用于研究qBrn-2在胚胎发育中的表达模式和发育中的调控作用；研究qBrn-2与其靶DNA的相互作用及其与qBrn-2协同蛋白的相互作用。15．如权利要求14所述的一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的用途，其特征在于所述的特异性识别的方式是通过酶、生物素、荧光素、生色化学基团、放射性同位素或电泳迁移率的变化，检测神经发育调控蛋白qBrn-2蛋白及其同源蛋白。16．如权利要求14所述的一种特异性识别发育调控蛋白qBrn-2抗体的用途，其特征在于所述的研究qBrn-2在胚胎发育中的表达模式和发育中的调控作用的途径是石蜡切片、冰冻切片、全胚或细胞培养的免疫组织化学；研究qBrn-2与其靶DNA的相互作用及其与qBrn-2协同蛋白的相互作用的途径是EMSA。全文摘要本发明属于遗传工程,特别涉及特异性识别发育调控蛋白qBrn－2的抗体及其制备方法和用途。以重组多肽或化学合成多肽为抗原免疫哺乳动物获得的多克隆抗体,这一抗体对发育调控蛋白qBrn－2的识别位点为qBrn－2的N－末端的非保守性的氨基酸序列,该抗体不识别其它POU结构域蛋白;在Western印记实验中,该抗体特异地识别单一的蛋白;利用免疫组织化学接示的qBrn－2表达模式与分子原位杂交的结果高度一致。该抗体可以用于研究发育调控蛋白qBrn－2及其同源蛋白的结构、功能及在胚胎发育中的调控作用。文档编号C12N15/10GK1301772SQ99127339公开日2001年7月4日申请日期1999年12月30日优先权日1999年12月30日发明者刘伟,薛志刚,薛金晓,刘缨,赫荣乔申请人:中国科学院生物物理研究所