专利名称：：人尿抗瘤(菌)肽及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属生物化学中的多肽领域。人们很早就知道尿的药用价值，1943年Magnelia等首次将尿的提取物用来治疗癌症。1967年Burzynski等从人尿中分离得到了抗瘤酮，经电泳、高效液相层析进一步纯化得抗瘤酮A1、A2、A3、A4和A5五个组分，后来又从A1～A5中分离得到一个共同的活性成份抗瘤酮A10，其结构为类似二肽的3-苯乙酰胺基-2，6-口辰啶二酮。目前对抗瘤酮A1～A5和A10抗癌作用的机制不甚清楚，但由于A10的分子和形状类似于DNA的碱基，因此推测A10可能是在DNA水平上嵌入其立体结构，从而形成了对致癌物质的拮抗而起到抗癌作用。国外已对抗瘤酮A2、A3、A5和A10进行了I期和II期临床试验，试验结果表明大部分可完全缓解，少部分缓解，部分稳定，极少恶化，而且抗瘤酮毒性极低。近年来已有几家实验室分别合成了抗瘤酮的类似物和衍生物，并观察了它们的抗癌活性。抗瘤酮可望成为安全有效的抗癌药物，但由于文献报道的人尿中抗瘤酮的制备多属专利，且不适用于大规模生产，所用分离方法的材料、设备价格昂贵。实验室合成的抗瘤酮的类似物和衍生物活性较低，对L1210淋巴白血病细胞仅显示微弱的抑制活性。近年来国内有“纯化尿”的报道，台湾学者与安徽医科大学第一附属医院联合进行的“纯化尿”I期临床试验表明“纯化尿”在癌症治疗上有诱导恶性细胞逆转走向良性，但这种“纯化尿”中什么样的物质起作用未见进一步报导。关于人源抗菌肽，目前发现的有BP1、PIA2、defensins和cathelicidins等，其中defensins(防御素)是1997年发现的由29-35个氨基酸组成的阳离子多肽，有6个不变的cys残基，形成三个分子内二硫键，它们分布于人的血浆、胸膜液、尿和脑脊髓液等体液中，是一类广谱的抗微生物的活性肽。本发明的目的是利用我国尿源丰富的有利条件，采用适合我国国情的分离纯化方法，从人尿中制备出前人尚未报道过的一种既抗肿瘤又抗菌的小分子多肽物质，定名为UAP。UAP是机体产生的天然抗肿瘤和抗菌物质，可抑制肿瘤和微生物的生长，而对正常组织和细胞几乎无影响，而且无免疫抑制作用。UAP可用来制备抗肿瘤及抗菌药物，用于治疗肿瘤和由病原体引起的各种相关疾病。本发明可以通过以下措施来达到1、UAP的分离、纯化从500立升男性尿经提取尿激酶的废弃液中或孕妇尿经提取绒毛膜促性腺激素后的废弃液中，加硅胶吸附剂，搅拌3小时后弃去残液，将吸附剂装柱，用含1.5％氨水和5.8g/ml氯化铵的水溶液洗脱，收集洗脱液，再经CSC-1树脂在柱脱色，收集活性部分，冻干得12g。上SephadexG-25柱，用水洗脱，得2个峰(附图1)，峰1无活性，峰2有活性，收集峰2并冻干得2.4g左右较纯的UAP。UAP再经HPLCC18反相层析分离，用含0.1％三氟醋酸的25％乙腈等梯度洗脱，得4个峰(附图2)。峰2有生物活性，收集峰2再经一次HPLCC18反相层析分离，分离条件同上，得一个主峰(峰1)(附图3)，收集主峰分即得本申请的UAP20mg左右(附图4)。2、UAP的其它分离、纯化方法从男性尿经提取尿激酶的废弃液中或孕妇尿经提取绒毛膜促性腺激素后的废弃液中，加树脂吸附，再经CM-纤维素层析等同样可得到UAP或类似于UAP的小肽及其衍生物。3、UAP的鉴定UAP经5.7mol/LHCL水解12小时，进行氨基酸分析，知含Arg、Tyr、Pro、Phe、Leu、Gly、Ser、Asp、Glu、Val等氨基酸(附图5)UAP经电喷务质谱测定得三个峰(附图6)，峰1分子量为174；峰2分子量为600.2、622.3和638.3，分别为一种小肽的游离羧基，钠盐和钾盐的形式；峰3分子量为763.3，所有小肽的分子量均小于1000。从氨基酸分析和电喷雾质谱测定知UAP是3-4种小肽的混合物，每种小肽分子量均小于1000。UAP的热稳定试验表明，在40℃、60℃、80℃下处理，对它的抗菌活性没有影响，只有在100℃加热20分钟，活性才略有下降，但仍保持了原有抗菌活性的87.5％，这表明UAP是对热稳定的小肽(附图7)。4、UAP的抗肿瘤活性a、体外活性测定采用细胞培养和细胞计数的方法，人肝癌细胞7721和人白血病细胞U937均以PRMI1640为培养基，人胃癌细胞MKN和正常肾细胞(NRK)以DME/F12(1∶1)为培养基，视不同情况加入10％左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37℃、5％CO2培养箱中单层培养。当细胞长成单层后消化(U937悬浮细胞除外)，用含1％小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的UAP，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入10μl的PBS，试验组加入不同剂量的UAP，继续培养72h后，吸出培养液，用PBS洗，然后每孔加入200μl消化液消化，待细胞变园后加入800μl的PBS，在倒置显微镜下用血球计数板计数。U937细胞长到一定密度后，1000rpm/min离心5min，收集的细胞以与上述相同的条件接种于24孔板上，加入UAP后继续培养72h，然后用0.1％Trypanblue染色，10min后进行计数。b、体内活性测定30只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分为三组，每组10只，雌雄各半或全部为雄鼠。将已接种S180或HepA的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3的比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2μl瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105个。植瘤24h后，给药组分别以每只小鼠每天1mg的剂量腹腔注射，生理盐水作为对照组，连续注射9天后，于停药24h时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。5、UAP抑菌活性的测定参照Hultmark方法，将含0.2％葡萄糖的100mlLB琼脂高压灭菌，待冷却至45℃，加入1ml处于对数生长期的菌株，混匀，立即倒平板，凝固后，用直径为2mm的滴管打孔，每孔加入4μl不同浓度UAP的生理盐水溶液，37℃倒置培养过夜，测量抑菌圈的大小。6、用UAP制备单克隆抗体或多克隆抗体将UAP与血清白蛋白用戊二醛法偶联，然后去免疫动物，制备单克隆抗体或多克隆抗体。利用单克隆抗体或多克隆抗体可建立各种诊断方法和药盒，通过药盒来测定体液和组织中UAP含量和定位。本发明与现有技术相比所具有的效果本发明充分利用人尿资源，在生产尿激酶和人绒毛膜促性腺激素(HCG)的同时，制备其它有临床应用的尿中活性物质。目前临床上用的抗癌药物如5-氟尿嘧啶等对肿瘤细胞和正常细胞均有杀伤作用，我们从人尿中分离纯化到3-4种小肽的混合物，来源于天然，且化学本质为小肽，无毒副作用，亦无免疫抑制作用，对肿瘤细胞和一些微生物有强烈的抑制和杀伤作用，而对正常细胞几乎无影响，是一种安全、高效和理想的抗癌(抗菌)药物。当UAP浓度为10μg/ml时，能强烈抑制肝癌细胞、白血病细胞等的增殖，抑制率达90％以上。体内试验对肉瘤S180、肝癌HepA等的抑制率达40％以上。UAP对11种不同的病原菌及条件致病菌有强烈的抑制作用，在小于1PPM时仍能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌。图1SephadexG-25分离UAP图2HPLC第一次C18反相层析分离UAP图3HPLC第二次C18反相层析分离UAP图4UAP的HPLC5UAP的氨基酸组成分析图6UAP的质谱分析7温度对UAP抑菌活性的影响具体实施例方式实施例1UAP的制备从500立升男性尿经提取尿激酶的废弃液中或孕妇尿经提取绒毛膜促性腺激素后的废弃液中，加2％量的硅胶吸附剂，搅拌3小时后弃去残液，将吸附剂装柱，用含1.5％氨水和5.8g/ml氯化铵的水溶液洗脱，收集洗脱液，再经CSC-1树脂在柱脱色，用水洗脱，收集活性部分，冻干得12g。上SephadexG-25柱，用水洗脱，得2个峰(附图1)，峰1无活性，峰2有活性，收集峰2并冻干得2.4g左右较纯的UAP。UAP再经HPLCC18反相层析分离，用含0.1％三氟醋酸的25％乙腈等梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长220nm，得4个峰(附图2)。峰2有生物活性，收集峰2再经一次HPLCC18反相层析分离，分离条件同上，得一个主峰(峰1)(附图3)，收集主峰即得本申请的UAP20mg左右(附图4)。实施例2UAP对肿瘤细胞的抑制作用应用本专利说明书所述的方法，发现UAP对肝癌7721细胞有明显的抑制作用，且剂效关系显著，当培养液中UAP的浓度为1.0μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml和7.0μg/ml时，其抑制率分别为3％、55％、64％和88％。对7721细胞增殖达到最大抑制作用一半时UAP的浓度为3μg/ml(表1)。表1人尿抗瘤肽对人肝癌7721细胞增殖的抑制作用UAP对U937血癌细胞的抑制作用也有相类似的结果。在培养液中浓度为3μg/ml时，在细胞计数时可发现有许多被台酚蓝染色的死细胞，当UAP剂量为5μg/ml和7μg/ml时，可发现许多细胞碎片，UAP的浓度为1.0μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml和7.0μg/ml时，其抑制率分别为19％、39％、66％和90％。对U937细胞增值达到最大抑制作用一半时的浓度为4.5μg/ml(表2)。表2人尿抗瘤肽对人血癌U937细胞增殖的抑制作用但UAP对正常细胞无抑制作用，用大鼠正常肾细胞作为模型，当UAP的浓度达到6μg/ml时，仍无抑剂作用(表3)。表3人尿抗瘤肽对NRK大鼠正常肾细胞增殖的抑制作用实施例3UAP的抑菌作用应用本专利说明书中的抑菌试验方法，我们试验了UAP对4种敏感菌的抑菌作用，这四种菌分别为金黄色葡萄球菌、藤黄八迭球菌，枯草芽胞杆菌和假单孢杆菌。当UAP的浓度在0.021mg/ml、0.105mg/ml和0.21mg/ml时有很好的抑菌剂一效关系，其最低的抑菌浓度小于1PPM(表4)。表4不同浓度的UAP对四种敏感细菌的抑制作用我们又对UAP的抗菌谱作了进一步研究，对大肠杆菌、伤寒沙门氏杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌、肺炎克雷伯氏菌、产气杆菌、粘质赛氏杆菌，其UAP浓度在7.5PPM时，仍表现强烈的抑菌作用(表5)。表5UAP的抗菌谱*</tables>*UAP的浓度为0.75mg/ml温度对UAP抑菌活性也作了研究，表明UAP在100℃加热20min后，仍然保留其相对活性的87.5％。权利要求1.人尿抗瘤(菌)肽，其特征在于从人尿中分离、纯化得到的小肽混合物，定名为UAP。其分子量均小于1000，由Arg、Tyr、Pro、Phe、Leu、Gly、Ser、Asp、Glu、Val等氨基酸组成。2.人尿抗瘤(菌)肽的制备方法，其特征在于从人尿中经硅胶吸附剂吸附，CSC-1树脂脱色，SephadexG-25柱层析，HPLCC18反相层析等可得UAP。3.人尿抗瘤(菌)肽的其它制备方法，其特征在于从人尿中经树脂吸附，再经CM纤维素层析等同样可得到UAP，不管其分离方法和手段有什么改变，只要用合适的方法均可获得UAP或类似于UAP的小肽及其衍生物。4.人尿抗瘤(菌)肽，其特征在于a.具有抗肿瘤活性UAP对人7721肝癌细胞、人血癌U937细胞等的增殖具有明显的抑制作用。并对小鼠移植性肿瘤如肉瘤S180、肝癌HepA等的生长有抑制作用b.具有抗菌活性UAP对许多病原菌及条件致病菌有强烈的抑制作用，在小于1PPM时仍能杀死多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。5.人尿抗瘤(菌)肽的抗体，其特征在于用UAP制备抗体，建立各种诊断方法和药盒，通过这些方法和药盒可以用来测定体液和组织中UAP的含量和定位。全文摘要本发明属生物化学中的多肽领域。本发明从人尿中分离、纯化得到小肽混合物,定名为UAP。其分子量均小于1000,由Arg、Tyr、Pro、Phe、Leu、Gly、Ser、Asp、Glu、Val等氨基酸组成。UAP可抗肿瘤细胞的增殖;有广谱的抗菌活性,可以杀死多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。可应用UAP制备抗肿瘤和抗菌药物,用于治疗肿瘤和由一些病原菌引起的相关疾病。文档编号A61K38/08GK1275576SQ0011226公开日2000年12月6日申请日期2000年5月10日优先权日2000年5月10日发明者陈钧辉,王新昌,毛晓青,方成,吴黎明申请人:南京大学