专利名称：恶性疟原虫动力素蛋白基因的制作方法
技术领域：
本发明为一种恶性疟原虫新动力素蛋白基因的免疫学作用，涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。
疟疾是当今世界上最致命的流行病之一。全球每年约有3亿到5亿人感染，2百万人死亡。其生活史可以简单归纳如下当雌性按蚊叮咬宿主时，单核的子孢子从血循环侵入肝细胞，并在此发育为成熟的肝内期裂殖体，成熟的肝裂殖子从肝细胞内释放入血，侵入红细胞进行红内期无性生殖，经过2至3天后发育为成熟的裂殖体，从每个感染红细胞内可释放6至30个裂殖子，这些裂殖子再侵入其它红细胞，进行多轮扩增，导致大量的红细胞被感染、破裂，裂殖子和疟原虫的代谢产物、残余和变性的血红蛋白以及红细胞碎片等一并进入血流，刺激免疫细胞产生内源性热源质，起周期性寒热发作，并出现贫血及脾肿大。与此同时，少量裂殖子发育为有性期的雌、雄配子体，当宿主再次被蚊子叮咬后随血液进入蚊体开始其生活史的蚊虫期，生成下一代子孢子。由于恶性疟原虫生活周期的复杂性，以及恶性疟原虫抗原的高度多态性的特点，造成了目前仍未有很好的保护性抗原。
恶性疟原虫在人红细胞的发育过程中对宿主细胞的细胞膜和细胞骨架进行修饰，这种修饰对于恶性疟原虫本身的生存和致病性有着重要的意义。由于红细胞本身缺乏细胞内膜结构及细胞器，恶性疟原虫必需具备一个独特的蛋白转运系统，来完成这些修饰。同时恶性疟原虫在侵染红细胞过程中，有许多微粒体和棒状体释放的转运蛋白参与。目前对于恶性疟原虫红内期的蛋白运转机制还知之甚少。然而蛋白转运系统相关基因在生物体内是相对保守的，因此克隆恶性疟原虫蛋白转运系统相关基因对于恶性疟原虫生命特征的认识及寻找新的恶性疟原虫免疫治疗候选抗原具有重要意义。
动力素蛋白(dynamin)家族是一种有内源性GTP酶活性的高分子量GTP结合蛋白家族，它们在不同的生物体内参与不同类型的蛋白转运过程。因此恶性疟原虫动力素蛋白可作为潜在的抗原候选基因。
本发明的目的在于寻找和克隆恶性疟原虫动力素蛋白新基因，对该基因表达蛋白进行免疫保护研究，为恶性疟原虫的免疫治疗提供新的作用靶点。
本发明的内容是应用基因组信息学原理、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、Western印迹杂交法，克隆鉴定恶性疟原虫动力素蛋白新基因Pfdyn，并用恶性疟原虫体外抑制实验进行了免疫保护分析。
该基因达到的技术指标为1.恶性疟原虫动力素蛋白Pfdyn的cDNA全长序列3014bp，AT含量为74.12％，，起始密码子ATG位于315bp处，其邻近的序列具有典型的Kozak序列特性(ANNATGG)。编码的蛋白质含837个氨基酸，N端具有三重GTP结合位点(图1)。Pfdyn在恶性疟原虫3D7株和Dd2株间在1976bp处存在一个从A到G的变异，但不影响氨基酸的编码页序。
2.恶性疟原虫动力素蛋白Pfdyn N端151个氨基酸重组蛋白在大肠杆菌BL21株中获得了表达。(图2)3.恶性疟原虫动力素蛋白Pfdyn在红内期裂殖体期特异表达(图3)。
4.抗恶性疟原虫动力素蛋白Pfdyn多克隆IgG在体外可抑制恶性疟原虫Dd2株和FCC1株的生长(图4)。
本项发明的优点对筛选的恶性疟原虫动力素蛋白Pfdyn进行免疫学的研究，为恶性疟原虫的免疫治疗提供了新的保护性候选抗原。
下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
图1 Pfdyn cDNA及其编码蛋白质序列图。
下划线部分为三重GTP结合结构域，斜体部分为Kozak序列。
图2重组的Pfdyn N端多肽在大肠杆菌中的表达。
1，低分子量蛋白Marker；2，未诱导的含空白质粒对照的裂解物；3，诱导的含空白质粒对照的裂解物；4，未诱导的含Pfdyn N端片段质粒的对照裂解物；5，诱导的含Pfdyn N端片段质粒的裂解物。箭头所指为重组蛋白带。
图3 Western印迹分析红内期Pfdyn基因的表达1，高分子量预染蛋白Marker；2，红细胞对照；3，环状体期感染红细胞；4，裂殖体期感染红细胞。箭头所指为92Kd Pfdyn蛋白。
图4抗Pfdyn IgG的恶性疟原虫体外生长抑制曲线图实施例1恶性疟原虫动力素蛋白基因Pfdyn的克隆及序列分析1.筛选探针的制备从GenBank中查到酵母动力素相关蛋白Vps1P(GenBank Number M33315)，找到其三重GTP结合保守区。根据第一个GTP结合区序列(IDLPQINVVGSQSSGKSSVLENIVGRDFLPRGTGIVTRRP，27Aa-66Aa)，应用NCBI恶性疟原虫BLAST主页(www.ncbi.nlm.nih.gov/malaria)的tBlastN程序，在恶性疟原虫11号染色体找到一段高度同源区。根据此序列，设计引物，上游5’-gatggaaacgtcaatgtac-3’；下游5’-ggattgtaacaaggagac-3’。利用PCR扩增恶性疟原虫Dd2株红内期cDNAλZAP文库(由美国ATCC所属MR4提供)。反应条件为94℃预变性5分，然后94℃变性30秒，53℃退火50秒，70℃延伸45秒，循环30次，70℃延伸5分钟。PCR扩增产物为200bp片段。
2.探针的标记及文库的筛选用胶回收试剂盒(A.Phamacia公司)进行探针的回收，探针利用随机引物试剂盒(Promega公司)进行α-P32-ATP的标记。以此标记探针对恶性疟原虫Dd2株红内期cDNAλZAP文库进行筛选，获得阳性克隆后，送于大连宝生公司进行序列测定(图1)。
3.cDNA全长序列与编码氨基酸的分析Pfdyn cDNA全长3014bp(图1)，AT含量为74.12％，具有典型的恶性疟原虫基因的性质。编码的蛋白质含837个氨基酸，其相对分子量为92KD。起始密码子ATG位于315bp处，其邻近的序列具有典型的Kozak序列特性(ANNATGG)。将上述序列与恶性疟原虫数据库进行比较，发现Pfdyn Dd2 cDNA序列与Pfdyn 3D7基因组序列在1976位有一个A-G的突变，但这一突变并不改变开放阅读框架。实施例2Pfdyn N端151个氨基酸肽段免疫血清的制备及纯化1.Pfdyn N端151个氨基酸肽段的亚克隆利用WINSTAR软件分析，Pfdyn N端435bp到887bp序列具有很高的抗原性。根据此序列设计引物上游5′GGATCCGTAGTGGTAAGAGTAGTGTTCTTGA3’，包含BamH I位点(下划线)，下游5′GAATTCTTAATCGCTTGTGGACATATCAGC3’，包含EcoR I位点(下划线)，用此对引物经PCR从Pf dyn cDNA克隆中扩增得到453bp片段。将此片段经BamH I、EcoR I酶切后，亚克隆于大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1(A.Phamacia)。正确的克隆转化大肠杆菌BL21株，经37℃ IPTG诱导3小时，得到Pfdyn N端150氨基酸的融合重组蛋白。(图2)。2.免疫血清的制备及纯化重组蛋白送于Bethyl公司制备免疫血清。100μg的蛋白免疫兔子，每两周加强一次，共加强5次。免疫血清经两次硫酸胺沉淀后，过DEAE-52柱纯化得到IgG.实施例3Pf dyn基因红内期特异性表达1.恶性疟原虫红内期特异性全蛋白的制备恶性疟原虫Dd2(红内期疟原虫可分为环状滋养体、成熟滋养体、裂殖体和裂殖子阶段)虫株经5％山梨醇处理两次后，48小时和72小时分别取相同体积的红细胞，用等体积SDS电泳上样缓冲液100℃煮沸5分钟，用同样体积的红细胞作为阴性对照。2.Western印迹分析恶性疟原虫Pfdyn红内期的特异性表达等体积的恶性疟原虫红内期全蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移于PVDF膜上(Roche公司)，用BM化学发光试剂盒(Roche公司)检测，以1∶1000免疫血清作为第一抗体。结果证明红内期裂殖体期有92KD特异表达带(图3)。实施例4恶性疟原虫的体外抑制1.正常人单核细胞的分离从正常中国成年人体内取全血，以肝素抗凝。全血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心后，分离到单个核细胞。将细胞用RPMI1640不完全培养基(Gibico公司)重悬，37℃，5％CO2孵箱孵育90分钟，洗去未粘附的细胞，贴壁的细胞用NSE染色(Sigma公司)确认其中单核细胞数。2.恶性疟原虫体外抑制实验以两次5％山梨醇处理的恶性疟原虫Dd2虫株和FCC1虫株作为实验虫株，起始虫血率为1％。在96孔培养板上设计如下实验(1)抗Pfdyn IgG；(2)抗Pfdyn IgG，单核细胞；(3)正常兔IgG；(4)正常兔IgG，单核细胞；(5)单核细胞。其中每孔中总体积为200μl，红细胞与单核细胞比为200∶1，IgG浓度为原始IgG浓度的5％，10％，20％。5％CO2，5％O2，90％N2，37℃培养48小时后计数虫血率。结果显示，与对照相比，抗Pfdyn IgG在一定浓度能有效抑制恶性疟原虫的生长(图4)。这种抑制与单核细胞的存在无关，说明抗Pfdyn IgG的抑制作用发生在裂殖子侵染阶段。
由于本实验抗Pfdyn IgG在体外可有效抑制恶性疟原虫的生长，据此可作为保护性候选抗原，应用于恶性疟原虫的免疫治疗。
权利要求
1.本发明涉及恶性疟原虫动力素蛋白基因(Pfdyn)，其特征在于该基因在恶性疟原虫两种不同株间高度保守，在红内期裂殖体期特异表达。
2.根据权利要求1所述之恶性疟原虫动力素蛋白基因，其特征在于氨基端151个氨基酸肽段免疫产生的多克隆IgG，在体外可以抑制恶性疟原虫的生长。
3.根据权利要求1、2所述之恶性疟原虫动力素蛋白基因，其特征在于可作为恶性疟原虫免疫治疗的候选靶抗原。
全文摘要
本发明涉及恶性疟原虫动力素蛋白基因,该基因编码含三重GTP结合结构域的内源性GTP酶,在恶性疟原虫红内期裂殖体期特异表达。该基因氨基端多肽片段产生的多抗,在体外可抑制两株红内期恶性疟原虫的生长,可作为恶性疟原虫免疫治疗的候选靶抗原,可以增进对恶性疟原虫生活特性的认识。
文档编号A61K39/002GK1377967SQ0111025
公开日2002年11月6日 申请日期2001年4月4日 优先权日2001年4月4日
发明者王恒, 李会良 申请人:中国医学科学院基础医学研究所