细胞死亡抑制蛋白的制作方法

专利名称：细胞死亡抑制蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过与caspase-12或其前体结合来抑制caspase-12活化的蛋白，以及含有该蛋白的细胞死亡抑制剂。
caspase是一族在多细胞生物体的编程性细胞死亡中起着关键性作用的蛋白酶。至今已从人和鼠中鉴定了Caspase族的十四个成员(Thornberry,N.A.和Lazebnik,Y.,“caspase，内部危害物”，科学281,1312-1316(1998))。通过利用其特异蛋白水解活性裂解一组特异的蛋白来实现Caspase的功能。存在多种caspase的原因之一被认为是因为不同的caspase功能对应于不同的编程性细胞死亡刺激物。
现在正在阐明，当caspase与正常功能如发育过程中的形态形成，成人中(体内)稳态的维持，和对身体有害细胞的清除有关时，如果它们被非正常活化则可能引起严重的疾病如神经变性的疾病(Yuan,J.和Yankner,B.A.,Nat.Cell Biol.1,E44-45(1999))。
Caspase被生物合成为非活性前体的形式并通过分子内的特异性裂解(过程)而被活化。因此，如果这一过程被抑制，则有可能抑制由caspase引起的编程性细胞死亡。
本发明的目的是提供一种抑制caspase-12活化的蛋白和一种含有该蛋白的细胞死亡抑制剂。
为了解决上述问题，本发明发明人通过广泛和深入地研究，结果发现了一种癌特异蛋白MAGE-3或其被截短的形式与caspase-12或其前体(以下常被称作“caspase-12前体”)特异结合。因而实现本发明的目的。
本发明涉及一种选自下列(a)和(b)的重组蛋白，或编码该重组蛋白的基因(a)一种由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白。
本发明的一个技术方案中，上述基因是一种由选自下列(C)和(d)的DNA组成的基因(c)一种由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成的DNA，(d)一种在严格条件下与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列杂交的DNA并且该DNA编码一种抑制caspase-12活化的蛋白。
本发明还涉及一种含有上述基因的重组载体。
本发明还涉及一种含有上述重组载体的转化体。
本发明还涉及一种制备抑制caspase-12活化的蛋白的方法，该方法包括在培养基中培养上述转化体并从得到的培养物中回收该蛋白。
本发明还涉及一种通过将MAGE-3蛋白和/或其截短形式与caspase-12或其前体结合所形成的复合物。
本发明还涉及一种含有作为活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的细胞死亡抑制剂。
在本发明的一个技术方案中，MAGE-3蛋白是一种选自下列(e)和(f)的重组蛋白(e)一种由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白，(f)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白。在本发明的一个技术方案中，MAGE-3蛋白的截短形式是一种选自上述(a)和(b)的重组蛋白。
在本发明的一个技术方案中，细胞死亡是至少一种选自编程性细胞死亡、坏死、预定(scheduled)细胞死亡、程序细胞死亡和细胞损伤的细胞死亡。
本发明还涉及一种用于治疗细胞死亡相关疾病的治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
在本发明的一个技术方案中，与细胞死亡有关的疾病是至少一种选自阿尔茨海默疾病、神经变性疾病、自体免疫疾病、肌萎缩和器官紊乱的疾病。
本发明还涉及一种抑制caspase-12的活化的方法，包括将MAGE-3蛋白或其截短形式与caspase-12或其前体结合。
本发明还涉及一种检测组织或细胞内的抗编程性细胞死亡活性的方法，包括采用特异识别MAGE-3蛋白或其截短形式的抗体来处理所述组织或细胞，并检测所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述组织或细胞中的表达，其中检测到所述MAGE-3蛋白或其所述截短形式的高度表达表明所述细胞组织具有抗编程性细胞死亡活性。
本发明还涉及一种检测组织或细胞内抗编程性细胞死亡活性的方法，包括检测编码MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在组织或细胞中的表达。


图1表示纯化源自大肠杆菌的MAGE-3蛋白的SDS-聚丙酰胺凝胶电泳图谱。
图2表示测定哺乳动物培养细胞中MAGE-3与caspase-12结合的试验结果。
图3表示测定哺乳动物培养细胞中MAGE-3与caspase-12的p10区域结合的试验结果。
图4表示MAGE-3的氨基酸序列。
图5表示MAGE-3与两种形式的caspase-12(即成熟酶和酶原)之间的结合亲合力的比较结果。
图6表示caspase-12前体的示意图。
图7表示测定MAGE-3抑制caspase-12活化的结果。
图8表示通过MAGE-3的高表达诱导细胞抵抗编程性细胞死亡的实验结果。
本说明书包括本申请要求了优先权的在先日本专利申请NO.2000-41927的说明书和/或附图的内容。
本发明涉及一种被命名为“黑素瘤相关抗原3”的癌-特异蛋白及其截短形式和它们的用途。基于上述蛋白具有抑制caspase-12的加工过程的功能这一发现而实现了本发明。
caspase-12前体定位在细胞的内质网(ER)上，并通过ER-特异应力引发的自我加工过程而成为有活性的caspase-12(Nakagawa,T．等，自然403,98-103(2000))。已提出ER应力是一种阿尔茨海默疾病、人类神经变性疾病的诱因。因此，通过利用MAGE-3抑制从caspase-12前体到成熟caspase-12的活化或成熟caspase-12本身的活化，与ER应力有关的疾病如阿尔茨海默疾病能得到预防或治疗。而且，由于MAGE-3蛋白对caspase活化的抑制与caspase-12具有特异性，因此利用MAGE-3的抑制剂是高度特异的，因此预料不会对其它caspase的正常功能产生副作用。
本文使用的表达方式“抑制caspase-12的活化”的意思是通过与caspase-12前体的特异结合来抑制从caspase-12前体到成熟caspase-12的加工过程，或通过与成熟caspase-12的特异结合来抑制从caspase-12前体到成熟(活化)caspase-12的功能。这种抑制的结果使得由成熟caspase-12引起的细胞死亡得到抑制成为可能。然而，本发明中，优选地是让MAGE-3或其截短形式与caspase-12前体结合。
本发明中，通过MAGE-3(Caugler,B．等，实验医学杂志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))蛋白或其截短形式抑制caspase-12的活化是可能的。本发明中，MAGE-3蛋白被表示为“MAGE-3”，编码MAGE-3的基因被表示为“MAGE-3”。MAGE-3及其截短形式对caspase-12特异并且不具有结合其它caspase的活性。
本发明中，通过传统基因工程技术分离MAGE-3。将得到的基因引入载体来制备重组载体，在将重组载体引入合适的宿主来制备转化体。如果将重组载体构建成能在宿主中具有功能的表达载体，通过培养转化体可以获得MAGE-3。
1．编码MAGE-3及其截短形式的基因的克隆首先，为了获得本发明的MAGE-3而进行MAGE-3的克隆。尽管MAGE-3的核苷酸序列是己知的(Caugler,B．等，实验医学杂志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))，但它也可通过以下描述的基因工程技术来制备。
(1)MAGE-3的cDNA文库的构建和筛选可通过传统技术来制备MAGE-3的mRNA。例如，用胍试剂或酚试剂处理睾丸或肿瘤的组织或细胞来获得全长RNA。然后，通过采用以寡脱氧胸苷酸(dT)纤维素或采用Sepharose2B的聚尿苷酸-Sepharose(琼脂糖凝胶)为载体的亲和柱方法或通过分批方法获得聚腺苷酰化的RNA(mRNA)。以得到的mRNA为模板，采用寡脱氧胸苷酸引物和反转录酶合成单链cDNA。然后，从单链cDNA合成双链cDNA。将如此得到的双链cDNA整合到合适的克隆载体中来制备重组载体。用该重组载体转化诸如大肠杆菌的宿主。以四环素抗性和氨苄青霉素抗性为标记筛选所产生的转化体从而获得cDNA文库。
或者，本发明可以使用商品cDNA文库(例如，人睾丸cDNA文库；Clontech)。
作为从选择的转化体中筛选具有目的DNA的那些克隆的筛选方法，例如可以采用使用抗体的免疫筛选技术或以已知DNA序列为基础合成引物然后使用该引物进行PCR的方法。
(2)截短的MAGE-3的制备本发明中，设计并合成编码截短形式的MAGE-3的基因(下文称作“截短的MAGE-3”)。截短形式的MAGE-3指的是在MAGE-3的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的N-端或C-端或两端具有氨基酸缺失的蛋白，最多缺失氨基酸的总数是312。更特别地，截短形式的MAGE-3指的是缺失后至少保留了2个，优选地10个或更多的SEQ IDNO:2的氨基酸的多肽或蛋白。本发明的截短形式的MAGE-3的特定实例包括缺失了从SEQ ID NO:2的位点1至位点81(丝氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了从SEQ IDNO:2的位点1至位点88(丝氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白；缺失了从SEQ ID NO:2的位点1至位点90(谷氨酰胺)的氨基酸的MAGE-3蛋白；和缺失了从SEQ ID NO:2的位点1至位点93(谷氨酸)的氨基酸的MAGE-3蛋白。
本发明的截短形式的MAGE-3(下文称作“截短的MAGE-3”)中，缺失了从SEQ ID NO:2的位点1至位点93的氨基酸的MAGE-3蛋白以SEQ ID NO:4表示。与SEQ ID NO:2的部分氨基酸序列对应的这一氨基酸序列跨越位点94至位点314。
通过以MAGE-3(SEQ ID NO:1；Caugler,B．等，实验医学杂志(J.Exp.Med)179,921-930(1994))为模板和采用以定位于目的截短蛋白编码区以外的SEQ ID NO:1的任何区域的部分序列为基础所设计的引物进行PCR能够获得这些截短的蛋白。必须指出为了合成截短的MAGE-3将含有翻译起始密码的核苷酸序列插入到编码区的5’端是有利的。
(3)MAGE-3的突变体和截短MAGE-3的突变体的构建本发明中，将突变引入MAGE-3或截短MAGE-3的部分氨基酸序列是可能的。因此，本发明的MAGE-3或截短MAGE-3的还包括这些突变蛋白。为了将突变引进氨基酸，采用一种将突变引进编码目的氨基酸的基因的核苷酸序列的技术。
通过已知技术如Kunkel的方法或缺口双链体方法，或通过基于这些方法的技术可以将突变引进基因。例如，通过以引进突变的寡核苷酸为引物(Yoshikawa,F．等，生物化学杂志271:18277-18284(1996))的点-特异诱变可以引进突变。这可以采用商品诱变试剂盒如Mutan-K(Takara)或Mutan-G(Takara)或体外诱变系列试剂盒(Takara)中的LA PCR来进行。
例如，合成了由在MAGE-3或截短的MAGE-3的核苷酸序列中发现的突变核苷酸及其侧翼区(每侧大约10个核苷酸)组成的引物。然后，以MAGE-3为模板并使用上述引物进行PCR。纯化PCR产物并采用合适的限制酶进行处理，因而获得想要的MAGE-3或截短的AMAGE-3。
(4)核苷酸序列的测定测定如此获得的基因的核苷酸序列。通过Maxam-Gilbert的化学修饰法或利用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法进行测序。然而，通常采用自动DNA测序仪进行测序(例如，377A DNA序列仪；Perkin-Elmer)。
SEQ ID NO:1表示MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:2表示MAGE-3的氨基酸序列。SEQ ID NO:3表示截短的MAGE-3的核苷酸序列，SEQ ID NO:4表示截短的MAGE-3的氨基酸序列。只要由这些氨基酸序列组成的多肽具有特异结合caspase-12或caspase-12前体的活性(即，只要它们能够抑制caspase-12的活化)，那么这些氨基酸序列就可能发生了突变如缺失、替换或添加了一个或多个(例如，一个或几个，优选地大约一个至十个，更优选地一个至五个)氨基酸。
除了编码含在本发明的截短MAGE-3(SEQ ID NO:4)中的氨基酸的基因(SEQ ID NO:3)外，本发明的基因还包括只是简并密码不同的编码相同多肽的简并异构体。而且，本发明的基因还包括在严格条件下与截短的MAGE-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)杂交并编码抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。本文使用的“严格条件”指的是这样的条件，即其中发生了所谓的特异性杂交，但没有发生非特异性杂交。例如，可以给出的那些条件，即其中两个高度同源的核苷酸(即，彼此具有60％或更高，优选地80％或更高同源性的DNA)相互杂交，但两个同源性较低的核苷酸之间不发生杂交。更特别地是，采用15-900mM，优选地15-150mM的钠浓度，和37-70℃，优选地68℃的温度。
一旦测出了本发明的截短的MAGE-3的核苷酸序列，就可以通过化学合成或通过采用基于所测核苷酸序列合成的引物而进行的PCR来获得本发明的基因。
3．含有本发明的基因的重组载体和转化体的制备(1)重组载体的制备通过将本发明的基因连接(插入)到合适的载体中来获得本发明的重组载体。只要能够在宿主中复制，插入了本发明基因的载体没有特别的限制。例如，可以使用质粒DNA、噬菌体DNA等等。
质粒DNA的特定实例包括商品质粒如pBluescript SK+(Stratagene)。本发明使用的其它质粒的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(例如，pBR322,pBR325,pUC118和pUC119)，来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如，pUB110和pTP5)和来源于酵母的质粒(例如，YEp13,YEp24和YCp50)。噬菌体DNA的特定实例包括λ噬菌体(例如，Charon4A Charon21A,EMBL3,EMBL4,λgt10,λgt11和λZAP)。并且，还可以使用动物载体如反转录病毒、腺病毒或痘苗病毒；或昆虫病毒载体如杆状病毒。并且，可以使用其中连接了基因表达活化蛋白(如B41)的融合质粒(例如，pJG4-5)。本发明可以使用的融合质粒并不限于上述的pJG4-5。本发明还可以使用其中连接着GST、GFP、His-tag、Myc-tag等的融合质粒。
为了将本发明的基因插入载体中，可以采用的方法是用合适的限制酶消化纯化的DNA，然后插入到合适的载体DNA的限制酶切位点或多克隆位点中来与载体连接。
本发明的基因必须与载体进行可操纵性的连接。为了这个目的，除了启动子和本发明的基因外，如果需要，本发明的载体可含有顺式元件如一个加强子、一个剪切信号、一个聚腺苷酸插入信号、筛选标记、一个核糖体结合序列(SD序列)等。作为筛选标记，可以列举出氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。
(2)转化体的制备将本发明的重组载体引入宿主可以获得本发明的转化体，因而进行目的基因的表达。只要能够表达本发明的基因，所述宿主没有特别的限制。本发明可以使用的宿主的特定实例包括埃希氏杆菌如大肠杆菌；芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌；假单胞杆菌如恶臭假单胞菌；酵母菌如酿酒酵母、粟酒裂殖酵糖母；动物细胞和昆虫细胞。
如果采用细菌如大肠杆菌作为宿主，那么本发明的重组载体优选地不但能够在宿主中自我复制而且还由一个启动子、一个核糖体结合序列、本发明的基因和一个转录终止序列组成。
本发明可以使用的大肠杆菌的特定实例包括BL21(DE3)、JM109和HB101。本发明可以使用的枯草芽孢杆菌的特定实例包括WB700和LKS87。
只要能够指导本发明的基因在宿主如大肠杆菌中表达，任何启动子都可以用来作为本发明的启动子。例如，可以使用一种来源于大肠杆菌或噬菌体的启动子如trp启动子、lac启动子、PL启动子或PR启动子；或一种来源于大肠杆菌-感染噬菌体的启动子如T7启动子。也可以使用人工修饰的启动子如tac启动子。
如果以酵母作为宿主，可以使用例如酿酒酵母、粟酒裂殖糖酵母或Pichia pastoris。这种情况下可使用的启动子没有受到特别的限制。只要能够指导本发明的基因在酵母菌中表达，任何启动子都可以使用。可以列举，例如，GAL1启动子、GAL10启动子、热休克蛋白启动子，MFα1启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、AOX1启动子等。作为将重组载体引入酵母的方法，可以使用任何DNA转移方法。可以列举，例如，电穿孔方法(Beker,D.M.，酶学方法，194:182-187(1990))，原生质球法(Hinnen,A．等，美国国家科学院院报，75:1929-1933(1978))，醋酸锂方法(Itoh,H.,J.Bacteriol.,153:163-168(1983))等。
如果以动物细胞作为宿主，可以使用猿COS-7或非洲绿猴肾细胞株系细胞；中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)；小鼠L细胞；大鼠GH3,PC12或NG108-15细胞；人FL、HEK293、Hela或Jurkat细胞等。SRα启动子、SV40启动子、LRT启动子、β-肌动蛋白启动子等可用作启动子。还可使用人巨细胞病毒的早期基因启动子。例如，可以采用电穿孔、磷酸钙方法或脂转染作为将重组载体引入动物细胞的方法。
如果以昆虫细胞为宿主，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞等。例如，可以采用磷酸钙方法、脂转染或电穿孔作为将重组载体引入昆虫细胞的方法。
4．截短的MAGE-3的制备通过培养上述转化体和从得到的培养物中回收所述蛋白来获得本发明的截短的MAGE-3。术语“培养物”指的是下列任何物质培养物上清液、培养细胞或微生物，或从培养细胞或微生物得到的裂解产物。按照普遍用于培养宿主的传统方法进行本发明转化体的培养。
只要含有可被微生物同化的碳源、氮源和无机盐并能有效培养转化体，无论是天然培养基还是合成培养基都可用作培养由微生物宿主如大肠杆菌或酵母菌获得的转化体的培养基。
碳氢化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉；有机酸如乙酸、丙酸；和醇如乙醇和丙醇可以用作碳源。氨，无机或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵；其它含氮化合物；胨；肉抽提物；玉米浆等可用作氮源。磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁(Ⅱ)，硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等可用作无机物。
通常，在有氧条件(如振荡培养或通气搅拌培养)和37℃下培养24小时。培养过程中，PH保持在6.5至7.5。用无机或有机酸、碱溶液等进行PH调节。培养过程中，如果需要，可以向培养基中添加抗生素如氨苄青霉素或四环素。
当对用含有诱导启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，如果需要，可以往培养基中添加诱导物。例如，当对用含有由异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以往培养基中添加IPTG。当对用含有由吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以往培养基中添加IAA。
可以采用通常使用的RPMI1640培养基或DMEM培养基，或一种补充了胎牛血清的这些培养基等作为培养从动物宿主细胞中获得的转化体的培养基。通常，在5％CO2的条件下和37℃下培养1至30天。培养过程中，如果需要，可以向培养基中添加抗生素如卡那霉素或青霉素。
培养后，如果蛋白产生于微生物或细胞内，则通过诸如超声处理、反复冻融、或匀浆器处理的方法裂解微生物或细胞来获得本发明截短的MAGE-3。如果本发明截短的MAGE-3产于微生物或细胞外，则直接采用培养液或进行离心去除微生物或细胞。然后，采用传统分离/纯化蛋白的生化技术处理得到的上清液。这些技术包括硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析和亲合层析，并且这些技术可以单独使用，也可以进行适当的组合来使用。因此，从上述培养物中可以分离和纯化到本发明的蛋白。
5．细胞死亡抑制剂MAGE-3或其截短的MAGE-3与caspase-12或其前体发生特异反应，因而抑制了从前体到成熟酶的转变过程。因此，MAGE-3或其截短的MAGE-3可用作细胞死亡抑制剂。MAGE-3或其截短的MAGE-3还可用于治疗或预防与细胞死亡有关的疾病(细胞死亡相关疾病)。而且，MAGE-3或其截短的MAGE-3被用作基因治疗的治疗剂。另外，通过测定细胞中的MAGE-3含量，能够检测细胞或组织抵抗编程性细胞死亡的能力。
细胞死亡相关疾病的特定实例包括阿尔茨海默疾病、神经变性疾病、自体免疫疾病、肌萎缩和器官紊乱的疾病。不论这些疾病是单独发生还是以并发症的形式发生，都可以采用本发明的治疗剂进行治疗。所述并发症也包括上述疾病与其它疾病的结合。
本发明的治疗剂或用于基因治疗的治疗剂可以经口服或非肠道和系统或局部给药。
如果本发明的所述蛋白或基因被用作细胞死亡相关疾病的预防剂或治疗剂(包括基因治疗剂)，则没有特别限制靶位。例如，本发明的治疗剂可用于治疗或预防发生在神经系统(如大脑、脊髓)、血管系统(如动脉、静脉、心脏)、呼吸系统(如气管、肺)、消化系统(如唾液腺、胃、肠、肝、胰腺)、淋巴系统(如淋巴节、脾、胸腺)、泌尿系统(如肾)，或生殖系统(如睾丸、卵巢、子宫)的组织中的细胞死亡相关疾病的特定目的。这种疾病可能是一种独立的疾病，也可能与其它细胞死亡相关疾病并发，或者甚至与细胞死亡相关疾病之外的疾病并发。
如果本发明的治疗剂是口服用药，则可将该治疗剂制成任何剂型如片剂、胶囊、粒剂、粉剂、丸剂、锭剂、内服液剂、悬浮液、乳化液或糖浆。或者，所述治疗剂可以制成使用前才再次溶解的干燥产品。如果本发明的治疗剂是非肠道给药，则可将该治疗剂配制成静脉注射液(包括点滴液)、肌内注射液、腹膜注射液、皮下注射液、栓剂等。注射液可以单位剂量安瓿或多剂量容器的形式提供。
通过传统方法采用医药制剂中通常使用的合适赋形剂、填充剂、结合剂、增湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、分散剂、缓冲液、保藏剂、溶解辅佐剂、抗菌剂、调味剂/香料、止痛剂、稳定剂、等渗剂等来制备这些配方药。
上述每一种配方药可含有药学上可接受的载体或添加剂。这种载体或添加剂的特定实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯乙醇、聚乙烯吡咯酮、羧基乙烯聚合物、藻酸钠、水溶葡聚糖、羧甲(基)淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙烯甘醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨醇和乳糖。根据制剂的剂型可以选择一种或多种这些添加剂或适当地进行结合。
本发明治疗剂的剂量大小取决于如对象的年龄、给药途径和给药次数这样因素，并且变化幅度很大。当本发明的有效量的所述蛋白与合适的稀释剂和药学上可接受的载体一起给药时，每次给药时的蛋白有效量范围为0.0001至1000mg/体重。治疗剂可以一天给药一次或每天几个剂量。
当本发明的基因被用作基因治疗的药剂时，则本发明的基因可以通过注射直接给药。或者，以结合了本发明基因的载体的形式给药。用于这一目的的合适载体的特定实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和反转录病毒载体。通过采用这一病毒载体，本发明的基因可以有效的给药。或者，本发明的基因可以包裹在磷脂泡囊如脂质体中，并且得到的脂质体能够对对象进行给药。由于脂质体是含有生物降解物质的封闭泡囊，所以将本发明的基因和脂质体混合以便基因保留在脂质体的内液层和双层脂膜中(形成了脂质体-基因复合物)。接着，当这一复合物与细胞一起培养时，复合物中的基因就被细胞吸收(脂转染)。然后，得到的细胞通过下述方法进行给药。
作为本发明的基因治疗剂的给药方法，除了传统系统给药如静脉或动脉内给药外，还可以对神经中枢系统(如大脑、脊髓)、血管系统(如动脉、静脉、心脏)、呼吸系统(如气管、肺)、消化系统(如唾液腺、胃、肠、肝、胰)、淋巴系统(如淋巴结、脾、胸腺)、泌尿系统(如肾)、生殖系统(如睾丸、卵巢、子宫)等进行局部给药。而且，还可以采用结合导管技术和外科手术的方法。
本发明基因治疗剂的使用剂量根据诸如对象的年龄、性别和条件、给药的途径、给药的次数和配方的类型这些因素而变化。通常，本发明基因的合适使用剂量是每天0.1-100mg/成人。
6．抗编程性细胞死亡活性的检测测定本发明适用于细胞或组织内抗编程性细胞死亡活性的检测。主要是，那些作为MAGE-3的检测结果显示出高效表达MAGE-3(包括其截短的形式)的细胞或组织被判断为具有抗编程性细胞死亡活性。MAGE-3或其截短形式的检测和定量可以通过将其与特异识别MAGE-3或其截短形式的抗体(多克隆或单克隆)进行反应来进行。将从细胞或组织制备的提取物点在一张膜如硝酸纤维素膜上以便制备斑点印迹，或将提取物进行电泳并转移到一张膜如硝酸纤维素膜上以便制备蛋白印迹。然后，抗MAGE-3的抗体和第二抗体与印迹进行反应以便检测MAGE-3。或者，采用如ELISA(酶联免疫亲合测定)这种技术对提取物直接进行MAGE-3定量检测。也可以用抗MAGE-3的抗体直接对细胞或组织进行免疫染色来检测那些具有获得性抗编程性细胞死亡活性的细胞或组织。
而且，还可以通过检测组织或细胞中编码MAGE-3或其截短形式的mRNA来检测组织或细胞的抗编程性细胞死亡活性。可以通过对组织采用原位杂交或位点PT-PCR(反转录/聚合酶链反应)来检测mRNA或通过对从组织或细胞中得到的提取物采用RNA印迹法或PT-PCR来进行mRNA的检测。
以下将参照实施例更加详细地描述本发明。然而，本发明的技术范围并不限于这些实施例。这些实施例中使用的核苷酸相关试剂和酶是从Takara生物化学公司(Takara Biochemicals(日本))和新英格兰生物试验室(New England Biolabs(美国))购买的。培养大肠杆菌的培养基物质是从Difco(美国)购买的。培养哺乳动物细胞的培养基物质是从Gibco-BRL(美国)购买的。除非另有说明，其它试剂是由Sigma-Aldrich(美国)生产的。
实施例1MAGE-3的克隆以人睾丸cDNA文库(Clontech，美国)为模板进行PCR(聚合酶链反应)来获得用于大规模表达实验的MAGE-3蛋白的编码区。整个操作过程如下所述。不仅是本实施例中，后面的实施例中DNA和RNA的整个处理过程都按照Sambrook等描述的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F,和Maniatis,T.，等编写的分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，美国，纽约，冷泉港(1989))进行。
尽管在包括黑素瘤的许多癌细胞中观察到了MAGE-3的高表达，但是，MAGE-3在正常细胞中的表达只限于睾丸(Van Pel,A，等，免疫周报(Immunol.Rev.)145,229-250(1995))。PCR中使用的引物(例如，NTOP77,NBOT68,NTOP79和NBOT65)具有下述序列。为了便于以下克隆，5’引物(NTOP79)含有可被EcoRV酶切割的GATATC序列，3’引物(NBOT65)含有可被XhoI酶切割的CTCGAG序列。
NTOP77:GCCCAGCTCCTGCCCACACT(SEQ ID NO:5)NBOT68:GGATGCGGCCCCGGAAGGT(SEQ ID NO:6)NTOP79:CTCGATATCGCACCATGCCTCTTGAGCAGAGG(SEQID NO:7)NBOT65:CTCCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCT(SEQ ID NO:8)用于PCR的一套DNA聚合酶和反应缓冲液(扩展的高保真PCR系统)是从Boehringer Mannheim(德国)购买的。PCR的反应条件如下所述。主要是，以1ng的睾丸cDNA为模板和采用引物NTOP77进行第一次PCR。这第一次反应循环40次，一个循环过程由变性(94℃保持1分钟)，引物退火(56℃保持1分钟)和DNA延伸(72℃保持1分钟)组成。一千分之一的PCR产物用于第二次PCR。采用引物NTOP79和NBOT65，第二次PCR循环35次，一个循环过程由变性(94℃保持1分钟)，引物退火(50℃保持1分钟)和DNA延伸(72℃保持1分钟)组成。
PCR反应结果，大约900bp的DNA片断被特异扩增。采用EcoRV和XhoI酶(两者购自于Takara Biochemicals)切割该片断的两端后，经琼脂凝胶电泳，再提取DNA(采用美国的Bio101生产的Geneclean试剂盒)来纯化所述片断。将纯化的DNA片断插入到普通载体pBluescriptSK(-)的EcoRV和XhoI位点来得到质粒pBN178。
实施例2MAGE-3的大规模生产采用大肠杆菌大规模生产MAGE-3首先，通过PCR扩增克隆在pBN178中的MAGE-3。将可被限制性酶NheI切割的序列加到5’引物，将可被限制性酶XhoI切割的序列加到3’引物。反应循环25次，一个循环过程由变性(94℃保持1分钟)，引物退火(51℃保持1分钟)和DNA延伸(72℃保持1分钟)组成。
以实施例1中所述的相同方式纯化扩增DNA片断，然后，插入到大肠杆菌表达质粒载体pRSET-A(Invitrogen，美国)的EcoRV和XhoI位点来得到质粒pBN202。使用pRSET-A载体在克隆基因的5’端加上含有His-His-His-His-His-His(Met-Arg-Gly-His-His-His-His-His-His-Gly-Met-Ala-Ser:SEQ ID NO:9)的标记序列。这样能够利用带有镍离子的亲合树脂(例如，Probond；Invitorogen)进行表达蛋白的亲合纯化。
用pNB202转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株。采用含有氨苄青霉素(100ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB培养基培养所得到的转化体(Sambrook,J.,Fritsch,E.F，和Maniatis,T.，等编写的分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，美国，纽约，冷泉港(1989))。通过向含有处于对数生长期的转化体的培养基中加入0.2mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导MAGE-3的表达。按照Novagen的说明书(美国)采用Probond亲合树脂(Invitrogen)纯化通过强制性表达产生的MAGE-3蛋白。
结果，从1升培养液中获得了大约100ug的纯MAGE-3。通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳证实了该纯MAGE-3的纯度很高(图1)。
实施例3MAGE-3和Caspase-12前体之间的结合实验在COS-1细胞中超表达Caspase-12前体和MAGE-3蛋白。然后，通过免疫沉淀技术检测源自于COS-1细胞的提取物中它们的结合。
通过免疫兔子来制备用于免疫沉淀检测的抗MAGE-3的抗体。主要是，将代表MAGE-3的C-末端序列的多肽(CHISYPPLHEWVLREGEE；SEQ ID NO:10；Tana Laboratories，美国)连接到载体蛋白(活化的血蓝蛋白；Pierce，美国)上，然后与佐剂一起给兔子注射。在上述多肽的氨基末端人工加上“C”以便多肽与载体蛋白和所使用的亲合树脂结合。另一方面，将与上述序列相同的多肽偶联到活化的FMP-Cellulofine树脂上(Seikagaku公司，日本)来制备多肽柱，该多肽柱用于以下的亲合纯化。将从免疫兔中得到的抗血清上样到多肽柱以使特异抗体与多肽结合。用甘氨酸溶液(PH2.6)从所述柱上洗脱特异抗体。通过加入1M的Tris将洗脱液的PH值提高到中性。这样获得的特异抗体被用于下面的实验。
编码caspase-12前体的cDNA和编码MAGE-3的cDNA分别被克隆到哺乳动物细胞表达质粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen，美国)中，然后通过瞬时共转染被转移到COS-1细胞中。基因工程基因被用于Caspase-12前体，其中将FLAG序列(Hopp,T.P．等，生物/技术6,1204-1210(1988))插入表达产物的氨基末端。为了将这些基因转移到COS-1细胞中，使用了优质转染试剂盒(Superfect Transfection Kit)(Qiagen,德国)。
转染两天后，回收COS-1细胞来制备细胞提取物。通过采用抗FLAG亲合凝胶(Sigma-Aldrich，美国)，将插入了FLAG的Caspase-12有选择地从细胞提取物中免疫沉淀出来。采用ELC-plus试剂盒(Amersham-Phamacia)通过蛋白印迹检测蛋白(Harlow,E.和Lane,D.,抗体实验手册，冷泉港实验室出版社，美国，纽约，冷泉港(1989))。
结果如图2所示。图2中，泳道1表示MAGE-3共存于免疫沉淀中。这一结果的发生是由于MAGE-3通过抗FLAG亲合凝胶与Caspase-12前体进行了结合。如果以在COS-1细胞中只有MAGE-3超表达作为对照实验，就不能通过抗FLAG亲合凝胶来免疫沉淀MAGE-3(泳道2)。
因而表明在培养的哺乳动物细胞中MAGE-3蛋白和Caspase-12前体形成了一种稳定的复合物。
实施例4Caspase-12中的MAGE-3结合区域和其特异性的检测按照美国的R.Brent等建立的酵母两次杂交方法(Gyuris,J．等，细胞75,791-803(1993))检测Caspase-12中的MAGE-3结合区域。按照这一方法，当含有这两种蛋白基因的酵母菌株显示β-半乳糖苷酶活性时，则可检测到两种蛋白的结合。
主要是，将编码MAGE-3的cDNA克隆到载体pJG4-5中以便构建一种由MAGE-3和编码基因表达-活化蛋白B42的基因组成的融合基因。含有这种融合基因的质粒被命名为pNB321。
将对应于含在成熟Caspase-12中的p10亚基(Thornberry,N.A．和Lazebnik,Y.，科学281,1312-1316(1998))的cDNA片断克隆到载体Peg202中以便构建一种由p10和LexA的DNA-结合区域组成的融合基因。含有这种融合基因的质粒被命名为pNB316。
将质粒pNB321和pNB316以及含有一个β-半乳糖苷酶报道基因的pSH18-34引入一株用于分析目的的芽殖酵母菌株EGY48来构建NMY307菌株。用合成培养基(0.67％的酵母氮源(Difco，美国)；组氨酸-，色氨酸-和不含尿嘧啶的氨基酸/核苷酸混合物(Bio-101，美国)，2％的半乳糖)培养NMY307。然后，按照Gyuris等的方法(Gyuris等，细胞75,791-803(1993))检测NMY307中的β-半乳糖苷酶活性。
另外，以所述同样的方法检测这样一些酵母菌株中的β-半乳糖苷酶活性，该酵母菌株中含有编码其它Caspase(即，Caspase-1,、-2、-3和-8)的p10区域(单独克隆到pEG202中)和MAGE-3(克隆到pJG4-5)的基因片断。
结果如图3所示。图3中，“1”,“2”,“3”,“8”和“12”分别代表含有编码Caspase-1、-2、-3-8和-12的p10区域和MAGE-3的基因片断的酵母菌株。“P”代表通过将编码活化转录因子的基因(克隆到pSH17-4)和β-半乳糖苷酶报道基因(克隆到pSH18-34)引进EGY48所制备的阳性对照菌株。“N”代表通过将编码Caspase-12的p10区域的基因片断和β-半乳糖苷酶报道基因(克隆到pSH18-34)引进EGY48所制备的阴性对照菌株。
结果表明，其中具有β-半乳糖苷酶活性的酵母细胞产生了一种来源于物质X-Gal的有色物质(5-溴-4-氯-3-吲哆-β-D-硫代半乳糖苷)(下面板图中的“12”)。这意味着成熟Caspase-12的p10区域结合了MAGE-3蛋白。这一β-半乳糖苷酶活性几乎与在阳性对照菌株(下面板图中的“P”)中观察到的活性在强度上相同。然而，在阴性对照菌株(下面板图中的“N”)中没有观察到颜色的产生。并且，在任何其它进行试验的Caspase(即，Caspase-1、-2、-3和-8)中象阴性对照菌株“N”一样没有产生颜色(图3，下面的板图)。因此，没有检测到这些Caspase与MAGE-3的结合。
因此表明定位于Caspase-12的C-末端侧链上的p10区域(在成熟Caspase-12中其变为大约10kDa的亚基)对于Caspase-12与MAGE-3的结合是必需的，并且还表明MAGE-3与Caspase-12的结合是特异的。
实施例5Caspase-12和截短形式的MAGE-3之间的结合实验采用HeLa细胞cDNA文库对能与Caspase-12前体的p10区域结合的因子进行研究。
将编码Caspase-12前体的p10区域的基因片断克隆到pEG202中并采用由R.Brent等建立的相互作用捕获技术(Gyuris,J．等，细胞75，791-803(1993))进行处理。得到的全部结合蛋白都是截短形式的MAGE-3。这些截短形式如下所述。最短的截短形式(截短形式1)由跨越全长MAGE-3蛋白的位点94的Gly残基到C-末端的Glu残基的氨基酸序列组成(以SEQ ID NO:2表示)。
截短形式1由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-93位点的氨基酸截短形式2由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-90位点的氨基酸截短形式3由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-88位点的氨基酸截短形式4由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的MAGE-3蛋白，其中缺失1-81位点的氨基酸按照上述Gyuris等的方法检测每一种截短形式与Caspase-12的结合。主要是，将一种编码Caspase-12前体的p10区域的基因片断和一种编码截短的MAGE-3的基因片断和一种lacZ报道基因转化到芽殖酵母菌株EGY48中。在半乳糖合成培养基平板上培养所得到的转化体。将平板上形成的克隆转移到一张尼龙膜上(Hybond-N+；Amersham-Pharmacia)，然后浸入液氮中来裂解酵母细胞。将上面载有裂解细胞的尼龙膜浸入一种含有X-Gal的磷酸缓冲液中(Gyuris,J．等，细胞75,791-803(1993))并在30℃下保持4-6小时。结果，证实了通过Caspase-12前体的p10区域与截短的MAGE-3的结合导致了lacZ基因在酵母细胞中进行表达时产生了半乳糖苷酶的酶活性，膜表面则发生了产生蓝色的反应。
所有截短的形式呈现出很强的颜色反应。因此表明即使是跨越Gly94到Glu314的MAGE-3的部分长度的多肽(C-末端)[图4中的所示区域跨越“”标记(位点94)到C-末端(位点314)]也具有结合Caspase-12的能力。
实施例6MAGE-3蛋白和Caspase-12之间的结合实验(成熟Caspase-12的结合)在这个实施例中，通过GST-融合蛋白结合试验分别测定Caspase-12的前体和活化形式与MAGE-3蛋白的结合程度。
用于这些试验的成熟Caspase-12(下文常称作“p30”)是通过从Caspase-12前体中去除不含在成熟(活化)Caspase-12中的N-末端结构域序列前体，然后将His-His-His-His-His-His-序列插入到N-末端来制备的。将一种编码这个p30蛋白的eDNA片段克隆到大肠杆菌质粒载体pRSET-A中(Invitrogen)。当p30在大肠杆菌中大规模表达时，通过自我加工，该蛋白被转化为成熟的形式。
另外，用在这些试验中的未成熟Caspase-12如下制备。主要是，为了稳定未成熟Caspase-12(即，防止自我加工)，采用Ser残基替换定位在Caspase-12的活化位点的Cys残基以便构建一个突变体p30(命名为“p30C/S”)。单独在大肠杆菌中大规模地表达这一突变体。根据Invitrogen的说明书进行大肠杆菌的培养和p30蛋白的诱导合成。利用N-末端6x(His)序列、通过镍柱亲合色谱(Probond亲合树脂；Invitrogen)来纯化p30和p30C/S。
为了容易地回收Caspase-12-回收产物，制备了编码由MAGE-3和融合到其末端的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)组成的融合蛋白的cDNA(pNB341)。主要是，将编码MAGE-3的cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒载体pGEX-4T-3(Amersham-Pharmacia；瑞典)中以便前者的读框与后者的读框重合，因而构建一个融合基因。将pNB341引进大肠杆菌XL-2Blue MRF’，按照Amersham-Pharmacia的说明书进行细胞培养和GST-MAGE-3融合蛋白的诱导合成。使用谷胱甘肽树脂(谷胱甘肽Sepharose4B；Amersham-Pharmacia)从大肠杆菌细胞的提取物中纯化GST-MAGE-3融合蛋白。按照Amersham-Pharmacia的说明书进行纯化。
将纯化的GST-MAGE-3蛋白与p30(成熟Caspase-12)或p30C/S(未成熟Caspase-12)混合，然后利用谷胱甘肽树脂从溶液中进行回收。通过蛋白印迹分析与GST-MAGE-3蛋白共沉淀的蛋白。
结果见图5。本图中的每条泳道如下说明泳道1其中成熟Caspase-12与GST进行了混合的对照实验(不含MAGE-3)泳道2与GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的成熟Caspase-12泳道3其中Caspase-12前体与GST进行了混合的对照实验(不含MAGE-3)泳道4与GST-MAGE-3一起以沉淀的形式回收的未成熟Caspase-12从图5所见，尽管认为p30(成熟Caspase-12)和p30C/S(未成熟Caspase-12)是共沉淀的，但认为p30C/S比p30的沉淀要早得多。因此，尽管两者都能进行结合，但发现未成熟Caspase-12比成熟Caspase-12更能有效地与GST-MAGE-3蛋白结合。
实施例7MAGE-3抑制Caspase的活化本实施例中，体外合成的Caspase-12前体(48kDa)被裂解为成熟的Caspase-12，从而在体外再现体内活性。
Caspase-12的前体裂解为成熟Caspase-12的位点是特异的。这个裂解位点是一个特定Asp残基，该Asp残基定位在成熟Caspase-12中的大约20kDa到10kDa亚基(分别称作p20和p10)之间的边缘上(图6；泳道2，图7)。这一特异裂解可能会通过向裂解反应中加入MAGE-3蛋白而被抑制。实验如下进行。
主要是，采用编码Caspase-12前体的cDNA和体外蛋白合成试剂盒(TNT体外转录/转译试剂盒；Promega，美国)合成Caspase-12前体。合成反应中加入35S-标记的甲硫氨酸(Amersham-Pharmacia)以使产生的酶原被放射性标记。
在含有20mM Tris-HCl(PH7.0)和10mM二硫苏糖醇的缓冲液中将放射性标记的Caspase-12前体、成熟Caspase-12和MAGE-3蛋白进行混合。然后，在37℃下进行45分钟的裂解反应。通过加入等体积的2X电泳样品缓冲液[100mM Tris-HCl(PH6.8),2％月桂基硫酸钠，10％巯基乙醇，0.2％溴酚蓝，20％甘油]并在100℃下将溶液加热4分钟来终止反应。
将该反应溶液制成SDS-聚丙酰胺凝胶(14％)。所得到的凝胶采用致敏物(Ampify；Amersham-Pharmacia)进行处理、干燥并进行放射自显影。采用BAS2500检测系统(Fuji膜，日本)检测干胶含有的放射性蛋白。
结果见表7。每一泳道说明如下。
(1)板图A泳道1在有放射性甲硫氨酸存在的条件下体外合成的Caspase-12前体泳道2-7由Caspase-12前体裂解为的成熟Caspase-12(0.28μg)。裂解反应是在MAGE-3蛋白存在的条件下进行的，MAGE-3蛋白的用量如下所示泳道2(0μg)，泳道3(0.3μg)，泳道4(1.5μg)，泳道5(3μg)，泳道6(6μg)，泳道7(12μg)。
泳道8由Caspase-12前体裂解为的成熟Caspase-12(1.1μg)。裂解反应是在有12μgMAGE-3蛋白存在的条件下进行的。
泳道9由Caspase-12前体裂解成的成熟Caspase-12(1.1μg)。对照样品。裂解反应是在以12μg牛血清清蛋白替换MAGE-3蛋白的条件下进行的。
(2)板图B泳道1类似于板图A中泳道7的样品的样品(即，反应混合物中加入两倍量的底物(Caspase-12前体))泳道2类似于板图A中泳道7的样品的样品(即，裂解反应在有24μgMAGE-3存在的条件下进行的)泳道3与板图A中的泳道9的样品相同的样品图7A中的泳道2至7显示了实验的结果，该实验中逐渐增大存在于反应中的MAGE-3蛋白的量(0到12μg)。加入12μg的MAGE-3几乎能够完全抑制生成Caspase-12的裂解反应。当以加入12μg的牛血清清蛋白替换MAGE-3作为对照实验时，没有观察到抑制作用(泳道9，图7A)。抑制作用主要是由MAGE-3与Caspase-12结合导致的结果。
而且，在12μg的MAGE-3就能几乎完全抑制裂解反应的条件下加入过量的成熟Caspase-12(即，1.1μg；4倍于用于泳道2-7的量，图7A)并不能恢复裂解反应(泳道8，图7A)。然而，在相同的条件下，加入过量(即，0.4μl的体外翻译蛋白溶液；两倍于用于泳道1，板图B和泳道1至9，板图A的量)的底物(Caspase-12前体)，则又可检测到特异性的裂解(泳道2，图7B)。
这些结果表明Caspase是通过特异性分子内的裂解被活化的。还表明MAGE-3与Caspase-12前体的有力结合抑制了Caspase-12的活化。
实施例8培养细胞中MAGE-3的抗编程性细胞死亡效应这个实施例证实了MAGE-3在细胞中的高表达增强了细胞对内质网(ER)应力-依赖编程性细胞死亡的抗性。
为了检测在细胞水平上MAGE-3对Caspase-12活化的抑制，构建了能高表达MAGE-3的细胞克隆。然后，检测细胞对于编程性细胞死亡刺激物的反应。在除睾丸以外的组织中测定MAGE-3的表达水平(Van,Pel,A.等，免疫周报(Immunol.Rev.145,229-250(1995))。
主要是，采用优质转染试剂盒(Superfect Transfection Kit)，将含有编码MAGE-3的cDNA的质粒pNB179引入鼠成肌细胞株C2C12中。由于pNB179含有抗药基因neo，所以含有这个组合到染色体中的质粒的转化细胞选择性地生长在含有抗菌素Geneticin(Gibco-BRL)的培养基中。经过两个星期的选择培养，挑出培养平板上形成的抗性细胞的菌落，分别进行培养，然后进行克隆。通过蛋白印迹检测每个克隆中表达量(采用抗MAGE-3蛋白的抗体)。
Caspase-12被细胞中的ER-依赖、编程性细胞死亡-诱导刺激物所活化(Nakagawa,T.，等，自然403,98-103(2000))。然后本发明发明人以0.4μM的浓度向上述高表达克隆的培养基中加入了毒胡萝卜素(24小时)，所述毒胡萝卜素是ER-特异性钙ATP酶的抑制剂，(Calbiochem，美国；Thastrup,O．等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2466-2470(1990))。
结果，胞内钙平衡被打破，促进了Caspase-12的活化。因此，诱导了细胞内的编程性细胞死亡。更特别地是，当用0.4μM浓度的毒胡萝卜素对C12C12细胞进行(亲本株)24小时处理时，50％或更多的细胞死亡，并显示出编程性细胞死亡的形态(图8中的右上板图)。
另外，当以相同方式、采用毒胡萝卜素处理C2/MA13和C2MA21克隆时，细胞显示出抗性。据显微镜观察，这些克隆的90％或更多的细胞保持正常形态(图8中的右中板图和右下板图)。左侧板图显示了对照实验的结果，其中细胞是用0.1％的二甲基磺酸处理的。
因此，为了定量分析对毒胡萝卜素处理的抗性，计算了每个细胞克隆的存活率。采用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司，日本)测定的结果表明在用毒胡萝卜素处理24小时后，C12C12的存活率降低到50％，而C2/MA13和C2MA21的存活率仍保持在很高水平(75％)。因而表明在MAGE-3高表达的情况下，细胞对ER-特异性应力具有抗性。这意味着MAGE-3抑制编程性细胞死亡的发生和发展。
本说明书中的所有出版物、专利和申请都是以全文的形式在本说明书中引用参考。
根据本发明，提供了一种蛋白和含有该蛋白的细胞死亡抑制因子，该蛋白通过与Caspase-12特异结合来抑制Caspase-12的活化。该蛋白被用作抑制细胞死亡如编程性细胞死亡的药物。
正文中没有提到的序列表SEQ ID NO:5合成DNASEQ ID NO:6合成DNASEQ ID NO:7合成DNASEQ ID NO:8合成DNASEQ ID NO:9合成多肽SEQ ID NO:10合成多肽序列表<110>RIKEN<120>细胞死亡抑制蛋白质<130>PH-1154<140><141><150>JP2000-41927<151>18-FEB-2000<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4204<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(2465)..(3409)<400>1acgcaggcag tgatgtcacc cagaccacac cccttccccc aatgccactt cagggggtac 60tcagagtcag agacttggtc tgaggggagc agaagcaatc tgcagaggat ggcggtccag 120gctcagccag gcatcaactt caggaccctg agggatgacc gaaggccccg cccacccacc 180cccaactccc ccgaccccac caggatctac agcctcagga cccccgtccc aatccttacc 240ccttgcccca tcaccatctt catgcttacc tccaccccca tccgatcccc atccaggcag 300aatccagttc cacccctgcc cggaacccag ggtagtaccg ttgccaggat gtgacgccac 360tgacttgcgc attggaggtc agaagaccgc gagattctcg ccctgagcaa cgagcgacgg 420cctgacgtcg gcggagggaa gccggcccag gctcggtgag gaggcaaggt aagacgctga 480gggaggactg aggcgggcct cacctcagac agagggcctc aaataatcca gtgctgcctc 540tgctgccggg cctgggccac cccgcagggg aagacttcca ggctgggtcg ccactacctc 600accccgccga cccccgccgc tttagccacg gggaactctg gggacagagc ttaatgtggc 660cagggcaggg ctggttagaa gaggtcaggg cccacgctgt ggcaggaatc aaggtcagga 720ccccgagagg gaactgaggg cagcctaacc accaccctca ccaccattcc cgtcccccaa 780cacccaaccc cacccccatc ccccattccc atccccaccc ccacccctat cctggcagaa 840tccgggcttt gcccctggta tcaagtcacg gaagctccgg gaatggcggc caggcacgtg 900agtcctgagg ttcacatcta cggctaaggg agggaagggg ttcggtatcg cgagtatggc 960cgttgggagg cagcgaaagg gcccaggcct cctggaagac agtggagtcc tgaggggacc 1020cagcatgcca ggacaggggg cccactgtac ccctgtctca aaccgaggca ccttttcatt 1080cggctacggg aatcctaggg atgcagaccc acttcagcag ggggttgggg cccagccctg 1140cgaggagtca tggggaggaa gaagagggag gactgagggg accttggagt ccagatcagt 1200ggcaaccttg ggctggggga tgctgggcac agtggccaaa tgtgctctgt gctcattgcg 1260ccttcagggt gaccagagag ttgagggctg tggtctgaag agtgggactt caggtcagca 1320gagggaggaa tcccaggatc tgcagggccc aaggtgtacc cccaaggggc ccctatgtgg 1380tggacagatg cagtggtcct aggatctgcc aagcatccag gtgaagagac tgagggagga 1440ttgagggtac ccctgggaca gaatgcggac tgggggcccc ataaaaatct gccctgctcc 1500tgctgttacc tcagagagcc tgggcagggc tgtcagctga ggtccctcca ttatcctagg 1560atcactgatg tcagggaagg ggaagccttg gtctgagggg gctgcactca gggcagtaga 1620gggaggctct cagaccctac taggagtgga ggtgaggacc aagcagtctc ctcacccagg 1680gtacatggac ttcaataaat ttggacatct ctcgttgtcc tttccgggag gacctgggaa 1740tgtatggcca gatgtgggtc ccctcatgtt tttctgtacc atatcaggta tgtgagttct 1800tgacatgaga gattctcagg ccagcagaag ggagggatta ggccctataa ggagaaaggt 1860gagggccctg agtgagcaca gaggggatcc tccaccccag tagagtgggg acctcacaga 1920gtctggccaa ccctcctgac agttctggga atccgtggct gcgtttgctg tctgcacatt 1980gggggcccgt ggattcctct cccaggaatc aggagctcca ggaacaaggc agtgaggact 2040tggtctgagg cagtgtcctc aggtcacaga gtagaggggg ctcagatagt gccaacggtg 2100aaggtttgcc ttggattcaa accaagggcc ccacctgccc cagaacacat ggactccaga 2160gcgcctggcc tcaccctcaa tactttcagt cctgcagcct cagcatgcgc tggccggatg 2220taccctgagg tgccctctca cttcctcctt caggttctga ggggacaggc tgacctggag 2280gaccagaggc ccccggagga gcactgaagg agaagatctg taagtaagcc tttgttagag 2340cctccaaggt tccattcagt actcagctga ggtctctcac atgctccctc tctccccagg 2400ccagtgggtc tccattgccc agctcctgcc cacactcccg cctgttgccc tgaccagagt 2460catc atg cct ctt gag cag agg agt cag cac tgc aag cct gaa gaa ggc 2509Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly1 5 10 15ctt gag gcc cga gga gag gcc ctg ggc ctg gtg ggt gcg cag gct cct 2557Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro
20 25 30gct act gag gag cag gag gct gcc tcc tcc tct tct act cta gtt gaa 2605Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu35 40 45gtc acc ctg ggg gag gtg cct gct gcc gag tca cca gat cct ccc cag 2653Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln50 55 60agt cct cag gga gcc tcc agc ctc ccc act acc atg aac tac cct ctc 2701Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu65 70 75tgg agc caa tcc tat gag gac tcc agc aac caa gaa gag gag ggg cca 2749Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro80 85 90 95agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc agt agg 2797Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg100 105 110aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga gcc agg 2845Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg115 120 125gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga aat tgg 2893Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp130 135 140cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc ttg cag 2941Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Sar Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln145 150 155ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc cac ttg 2989Leu Val Phe Gly Ile Glu Lau Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu160 165 170 175tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg ctg ggt 3037Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly180 185 190gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc ctg gcc 3085Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala195 200 205ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc tgg gag 3133Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu210 215 220gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt atc ttg 3181Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu225 230 235ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa aac tac 3229Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr240 245 250 255ctg gag tac cgg cag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat gaa ttc 3277Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe260 265 270ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa gtc ctg 3325Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu275 280 285cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac cca ccc 3373His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro290 295 300ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga gtctgagcac3419Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310 315gagttgcagc cagggccagt gggagggggt ctgggccagt gcaccttccg gggccgcatc 3479ccttagtttc cactgcctcc tgtgacgtga ggcccattct tcactctttg aagcgagcag 3539tcagcattct tagtagtggg tttctgttct gttggatgac tttgagatta ttctttgttt 3599cctgttggag ttgttcaaat gttcctttta acggatggtt gaatgagcgt cagcatccag 3659gtttatgaat gacagtagtc acacatagtg ctgtttatat agtttaggag taagagtctt 3719gttttttact caaattggga aatccattcc attttgtgaa ttgtgacata ataatagcag 3779tggtaaaagt atttgcttaa aattgtgagc gaattagcaa taacatacat gagataactc 3839aagaaatcaa aagatagttg attcttgcct tgtacctcaa tctattctgt aaaattaaac 3899aaatatgcaa accaggattt ccttgacttc tttgagaatg caagcgaaat taaatctgaa 3959taaataattc ttcctcttca ctggctcgtt tcttttccgt tcactcagca tctgctctgt 4019gggaggccct gggttagtag tggggatgct aaggtaagcc agactcacgc ctacccatag 4079ggctgtagag cctaggacct gcagtcatat aattaaggtg gtgagaagtc ctgtaagatg 4139tagaggaaat gtaagagagg ggtgagggtg tggcgctccg ggtgagagta gtggagtgtc 4199agtgc 4204<210>2<211>314<212>PRT<213>人类<400> 2Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu1 5 10 15Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala20 25 30Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
35 40 45Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser50 55 60Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp65 70 75 80Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser85 90 95Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys100 105 110Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu115 120 125Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln130 135 140Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu145 150 155 160Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr165 170 175Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp180 185 190Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile195 200 205Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu210 215 220Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly225 230 235 240Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu245 250 255Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu260 265 270Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His275 280 285His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu290 295 300His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310<210>3<211>666<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(1)..(666)<400>3ggg cca agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc 48Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15agt agg aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga 96Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30gcc agg gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga 144Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45aat tgg cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc 192Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60ttg cag ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc 240Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80cac ttg tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg 288His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95ctg ggt gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc 336Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110ctg gcc ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc 384Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125tgg gag gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt 432Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140atc ttg ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa 480Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160aac tac ctg gag tac cgg Gag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat 528Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175gaa ttc ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa 576Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190gtc ctg cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac 624Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205cca ccc ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga 666Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>4<211>221<212>PRT<213>人类<400>4Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu1 5 10 15Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg20 25 30Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly35 40 45Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser50 55 60Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly65 70 75 80His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu85 90 95Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val100 105 110Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile115 120 125Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser130 135 140Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu145 150 155 160Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr165 170 175Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys180 185 190Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr195 200 205Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu210 215 220<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述分成DNA<400>5gcccagctcc tgcccacact20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>6ggatgcggcc ccggaaggt19<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>7ctcgatatcg caccatgcct cttgagcaga gg32<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400> 8ctcctcgagt cactcttccc cctctct 27<210>9<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400> 9Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser1 5 10<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>10Cys His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly1 5 10 15Glu Glu
权利要求
1．一种选自下列(a)和(b)的重组蛋白(a)一种由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白。
2．一种编码选自下列(a)和(b)的重组蛋白的基因(a)一种由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白。
3．一种由选自下列(c)和(d)的DNA组成的基因(c)一种由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成的DNA，(d)一种在严格条件下与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列杂交并编码抑制caspase-12活化的蛋白的DNA。
4．一种含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5．一种含有权利要求4所述的重组载体的转化体。
6．一种生产抑制caspase-12活化的蛋白的方法，包括在培养基中培养权利要求5所述转化体并从所得到的培养物中回收所述蛋白。
7．一种由MAGE-3蛋白和/或其截短形式结合caspase-12或其前体所形成的复合物。
8．一种含有作为活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式的细胞死亡抑制剂。
9．一种如权利要求8所述的细胞死亡抑制剂，其中MAGE-3蛋白是一种选自下列(e)和(f)的重组蛋白(e)一种由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白，(f)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白。
10．一种如权利要求8所述的细胞死亡抑制剂，其中MAGE-3蛋白的截短形式是一种选自下列(a)和(b)的重组蛋白(a)一种由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白。
11．一种如权利要求8至10中任意一项权利要求所述的细胞死亡抑制剂，其中细胞死亡至少是一种选自编程性细胞死亡、坏死、预定细胞死亡、程序细胞死亡和细胞损伤的细胞死亡。
12．一种用于细胞死亡相关疾病的治疗剂，含有作为活性成分的MAGE-3蛋白和/或其截短形式。
13．如权利要求12所述的治疗剂，其中MAGE-3蛋白是一种选自下列(e)和(f)的重组蛋白(e)一种由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白，(f)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白。
14．如权利要求12所述的治疗剂，其中截短形式的MAGE-3蛋白是一种选自下列(a)和(b)的重组蛋白(a)一种由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase-12活化的SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白。
15．如权利要求12至14中的任何一项权利要求所述的治疗剂，其中与细胞死亡有关的疾病是至少一种选自阿尔茨海默疾病、神经变性疾病、自体免疫疾病、肌萎缩和器官紊乱的疾病。
16．一种抑制caspase-12活化的方法，包括将MAGE-3蛋白和/或其截短形式结合到caspase-12或其前体上。
17．一种检测组织或细胞内的抗编程性细胞死亡活性的方法，包括采用特异识别MAGE-3蛋白或其截短形式的抗体来处理所述组织或细胞，并检测所述MAGE-3蛋白或所述截短形式在所述组织或细胞中的表达，其中检测到所述MAGE-3蛋白或其截短形式的高度表达表明所述细胞组织具有抗编程性细胞死亡的活性。
18．一种检测组织或细胞内的抗编程性细胞死亡活性的方法，包括检测编码MAGE-3蛋白或其截短形式的mRNA在组织或细胞内的表达。
全文摘要
本发明提供了一种抑制caspase－12活化的蛋白以及该蛋白的用途。本发明涉及一种选自下列(a)和(b)的重组蛋白(a)一种由SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列组成的蛋白，(b)一种由具有缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸并且抑制caspase－12活化的SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列组成的蛋白。
文档编号A61P37/00GK1316432SQ0111651
公开日2001年10月10日 申请日期2001年2月18日 优先权日2000年2月18日
发明者森岛信裕, 柴田武彦 申请人:理化学研究所