一种抑制基因表达的方法

专利名称：一种抑制基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及用能产生小干扰RNA(siRNA)的双链核糖核酸(dsRNA)进行的基因特异性抑制。构建的dsRNA的数量和序列的选择依据本发明所阐述的标准。此外，选择的能产生siRNA的dsRNA的特定导入方法将可能解决目前在预防和治疗SARS和HIV感染中存在的困难。
背景技术：
近年来，RNA的干涉作用在生物学领域带来了很多惊喜。早在1990年，生物学家Rich Jorgensen在试图使紫色牵牛花变得更紫时，就首次观察到了这种干涉作用。他插入了另一拷贝的限速酶基因，但结果牵牛花不是变紫，反而变白了。他称这种反常作用为“共抑制”，但在当时，没有人知道为什么在加入了更多促使特定颜色显现的基因后反而会使该基因关闭。5年后，实验研究表明，使用单链的对照“有义”链RNA与“反义”链一样能抑制靶基因。1998年，Andrew Fire和Craig Mello通过证实双链RNA是真正的沉默物质而揭露了其中的奥秘。他们称之为“RNA干涉”，并由此诞生了一个新的领域(Blocker B.RNA interference dazzles researchcommunity.Journal of the National Cancer InstitueVol.95，No.7，April2，2003)。Tuschl小组将该技术延伸至哺乳动物细胞，并产生了RNA干涉或现称的RNAi(Elbashir S.M.，Harborth J.，Weber K.，Tuschl T.Analysis ofgent function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Academic PressMethods 26(2002)199-213)。
在哺乳动物中，双链RNA或dsRNA主要是通过转录后机制靶向降解mRNA发生作用，同时已知这种序列特异性靶向识别的介质是由大约21个核苷酸组成的小干涉RNA(siRNA)。这些小的siRNA通常是由一种较长的dsRNA在天然状态下与Dicer RNA酶III发生反应产生，当这种siRNAs形成后，它们又与另一种称为RNA-诱导沉默复合体(RISC)结合。
发明概要如上文所述，所述的RISC siRNA复合体还未明确定义。选择用作起始dsRNA或siRNAp模板的正确序列的工作目前还未标准化。实际上，可以有许多的序列组合都适合19-23个核苷酸(nt)dsRNA或siRNAp的标准，即使可能，决心从中选择出正确的一个序列仍将十分困难。
为了试图构建更好的siRNAp或dsRNA，本发明将其与核糖核酸酶蛋白结合，该RISC蛋白最终使siRNA展开形成单链，这将引导RISC复合体使细胞质靶mRNA发生降解(Hannon GJ.RNA interference.NatureVol.418，July 11，2002)。在某些物种中，siRNA RISC复合体也可以通过染色质或其它能有效地改变基因遗传表达的位点插入到序列特异性DNA中。如果这些siRNA与其它相同或不同靶向的RNA互补，则能产生可转移RNAi。在一些有机体中，以靶mRNA为模板，RNA依赖或指导的RNA聚合酶(RdRP)也能启动siRNA的合成，然后通过非RISC的Dicer RNA裂解作用使靶mRNA失活。有时，即使在微量的dsRNA的引发下，siRNA使靶mRNA沉默的一些效果也能扩大并扩散至整个机体。然而，迄今为止，这种效果并没有在哺乳动物中观察到。
来源于双链或其它前体的SiRNA复合体，目前被广泛地用于使培养细胞中的哺乳动物基因沉默。这些功能性siRNAs的导入和形成目前可以采用不同方法来实现，如转染，电穿孔，以及基于质粒和基于病毒的表达系统。
迄今为止，将siRNAs直接导入动物局限于仅有的几例。当注射到动物的尾部静脉或脑纹状体区域时，在CMV启动子调控下表达siRNAs的重组腺病毒降低了小鼠肝脏或大脑中的靶基因表达。迄今为止，只有Lieberman实现了真正的疾病预防他们将相当于动物血液总体积一半的3倍高压注射液注射给小鼠，从而迫使siRNA指导Fas基因定向进入肝脏(Couzin J.RNAi to the liver’s rescueScience NOW-Couzin 2003(210)1)，大约有80％至90％的肝细胞整合了该RNA分子。第二天，给予动物一种抗体而使Fas过量，导致肝脏坏死。结果显示，绝大多数的对照组小鼠死亡，然而82％的受治疗小鼠存活。
该动物研究的首次成功毫无疑问会引导进一步研究而将该项技术用于治疗人类疾病。
定义靶基因中的上述序列。
向某种疾病的普通的目的白细胞或者特别的淋巴细胞中导入siRNA也是困难的。在本发明中，向呼吸系统和体外干细胞中直接导入这些特别设计的siRNAs将有助于绕开治疗SARS和HIV病毒感染中存在的一些困难。
发明的详细描述选择dsRNA或siRNAp正确序列的方法基于几种已知的标准从基因序列中选择候选目标区域。我们查找了转录起始位点下游的至少50bp，确定符合AA(n19)TT模式的区域，其中n可以为任何碱基。但是如果不存在这种模式，则选择其它的次优选序列(如nA(n19)Tn、nA(n19)nn)，它们必须具有大约50％的GC比率，且不含长串的核苷重复。虽然该选择得到一种21-nt的dsRNA寡核苷酸，但该项技术还可用于获得任何长度的寡核苷酸。
然后针对能产生天然发夹结构或其它mRNA二级折叠的上游或下游同源区筛选这些siRNA候选区域(AA(n19)TT区域)。按3’-5’的方向阅读包含(表1)或不包含(表2)第一个和最后两个碱基的上述候选区域的5’端10个碱基或3’端的10个碱基，并确定位于同一mRNA上的任何这些区域的互补区域。基于下游碱基对的配对数量，对起始候选区域打分，并选出最互补同源序列(表1-3)。
构建互补dsRNA寡核苷酸，使反义链互补于其19bp的中心区域。每一链都具有3’dTdT的突出，其全部或仅仅是其中的5’dT互补于靶序列(mRNA上外显子序列，人们试图对其序列翻译进行抑制)相应的5’端区域。对候选序列进行筛选并用相关的BLAST数据库(htttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行配对以系统地检测非特异性同源部分，排除那些同源性超过75％的序列。通过商业的寡核苷酸合成公司(Proligo)或其它可用的生产方式对siRNA寡核苷酸进行测序和合成。


表1以人端粒酶RNA(hTR)的23-nt区域为靶的潜在siRNA。除3’dTdT突出的配对碱基外，最终的区域基于19-nt识别序列。除其它标准外，最终siRNA的选择是基于同源配对数量。下游互补同系物从其碱基计数起点开始计数。

表2以人端粒酶反转录酶亚基基因(hTERT)为靶区域的潜在siRNA。仅在19nt内部识别序列的基础上选择区域。除其它标准外，最终siRNA的选择是基于同源配对数量。互补同系物从其碱基计数起点开始计数。

表3以SARS复制酶(pol)编码区的为靶区域的潜在siRNA。在21bp内部同源序列(每一突出端的第一个碱基)的基础上选择区域。除其它标准外，最终siRNA的选择是基于同源配对数量。互补同系物从其碱基计数起点开始计数。
计算机辅助序列选择采用能识别这些特定、简单标准的计算机软件可以迅速的识别siRNA-靶区域。目前可用的软件如Primer Express(Applied Biosystems)，BLAST(National Centre for Biotechnology Information)，Gene-ToolLite(Bio Tools Inc.)能实现非常简单的功能，但是我们需要寻找一种能搜索短的下游反向互补序列的软件工具。据预测这种软件工具在不久的将来就会问世。
如果不止一个区域具有相似的配对序列和下文计算公式部分定义的RNA偏好指数(RPI)，则可以通过序列比较和本领域公知的排列算法(参见Gribskov and Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991)和采用各种算法和软件包(例如Gene Tool lite)计算在不同程度同源性下的可能的结合结果来进行进一步的区域性筛选。
发明所用的计算公式除了其它确定的优点以外，本发明既提高了结果siRNA的效果又提高了其特异性。至今还没有在任何一种有机体中精确地展现RNA干涉和基因沉默的确切性质，在哺乳动物中则更没有。RISC蛋白的结构和功能以及所采用的有义或反义RNA的特定链都仍在研究中。本发明的目的是从成百上千的可用于所给目的的组合中筛选出最可能的序列组合。
对上游或下游互补区域或对沿5’-3’或3’-5’方向(也可以为5’-5’，3’-3’)具有尽可能多的与siRNA核苷酸碱基理想配对的区域进行选择，然后通过标准比较和排列算法对其余的区域进行选择，这能实现多种理论上的重要意图。
最初的想法是选择出尽可能多的互补核酸碱基。理想情况是19nt全部都配对，如果该情况不可能，则尽最大可能地选择一种具有最多核苷酸碱基配对的情况。例如，对一组19nt dsRNA(也可为其它长度的核苷酸)进行选择将获得具有最多核苷酸配对数量的一组。理论上，具有8个核苷酸配对的组将比只有6个或7个配对的更好。虽然不是绝对必要条件，但配对的核苷酸应从该链的第一个或第三个核苷酸开始。可选择地，可以在一个区域中存在多个配对片段，例如，配对可以是1-12，或2-7和9-14等等。
第二种想法是假如存在互补区域，则从同一组核苷酸序列中尽可能多地选择出这种互补区域。例如，可以发现存在有3组19nt的dsRNA，且其都存在6nt的配对。其中的一组有一个还与上游或下游配对的额外6nt区域，而剩下的两组仅有1个6nt区域。因此，从逻辑上应选择具有多于一个6nt配对区域的第一组。这种想法通常会获得多个区域配对的组。这种区域越多越好。
有时，从一组具有更多的配对碱基和另一组具有更多的配对区域的两组中进行选择可能是困难的。目前，我们优先选择那些至少有4-5个核苷酸配对且具有最多配对区域的一组。这种选择背后的原因可能是因为RISC蛋白可以操纵由至少4-5个核苷酸的单链RNA组成的无缺口片断以引导其进入基因沉默模式。在这种情况下，配对区域越多，则基因沉默的机会越大。然而，后来证实RISC蛋白操纵一更长链的RNA作为引导。因此相对于更多的配对区域，更多的核苷酸配对将为最优选的选择。在任何情况下，采用本发明的决定主要集中于siRNA功能更多的奥秘是如何开始揭示的。
简单计算公式如下1.首先优选寻找最高的序列互补指数(Sc)，其定义如下Sc＝M/Risc其中Sc为序列互补指数M为配对的序列片段的核苷酸总数，其中该片断超过了作为RISC蛋白的引导单链RNA的操纵序列所要求的最低长度。例如，如一选定区域具有3个配对片断，其中的2个超过了5个连续的核苷酸，如1-6，8-15，而另一片段只有连续的4个核苷酸，如17-20；而RISC蛋白要求的最低链长度为5，因此，仅最初的2个片段符合计算要求。
M＝(1-6)+(8-15)M＝6+8M＝14
Risc为在特定系统中操纵的最小的有效核苷酸长度。在不同的物种或不同系统中，如在RdRP中其可能有变化。在上述情况下其设定为5。
Sc＝14/5Sc＝2.82.第二个标准是选择那些含有至少一个片段的区域数量，其中该片断的序列超过了RISC蛋白要求的最小操纵单链长度。
N＝含有至少一个片段的区域数量，其中该片断的配对情况超过Risc的要求3.该工作公式的最终结果为RPI＝Sc×NRPI为RNA偏好指数，用于选择dsRNA或siRNAp，其中指数越高，则选择更优化。
4.如果不同RNA组具有相同或非常相似的RPI，则选择具有最优比较和排列算法结果的组。
本领域的技术人员应明确，上述公式只是实现本发明众多方式中的一种。选择更多特定靶目标和更多互补区域的重要标准，平衡选择的siRNA系统的工作限制，将促使本领域技术人员最大程度上的运用本发明。
发明所涉理论的简要说明基于本发明的选择的优点是多方面的。由于RISC蛋白最终将使dsRNA展开为单链形式，并可能修饰该链上一定数量的核苷酸，因此，使引导RISC蛋白到达靶基因的特定核苷酸暴露于尽可能多的靶将十分重要。如果在靶基因上存在多个这种配对核苷酸，则在存在可能阻止该过程的其它细胞内因子的宿主中将增加这种基因沉默的可能性。另一方面，那些通常无功能的RISC蛋白的有义核苷酸链可以与选择的配对区域互补，因此，特定选择的siRNA的效果至少为以前随机选择方法的两倍。除了siRNA分子和靶目标的效果增加了2倍或更多倍的事实外，本发明得出一个推论，即哺乳动物系统实际上是一个更复杂的系统，在沉默明确前当然地需要更多的确认信息，不能象阅读理想系统那样阅读由带有RISC蛋白的单链siRNA片段产生的单链靶区域。例如，如果用通过本发明的方法获得的两个或多个区域使靶RNA沉默，那么就可以确定这种靶沉默信号。在RNA干涉在哺乳动物细胞中产生长期效果或永久地转移至其它细胞系统前，这种更明确的确认系统可能会十分重要。对于预防和治疗疾病，转染或导入siRNA的能力十分重要，该siRNA能长期抑制哺乳动物细胞遗传表达且产生获得上述沉默效果的系统细胞。为什么会这样？在观察中发现一个有趣的现象，即在RNA沉默中发现天然的环状RNA。该环状RNA呈发夹结构，产生dsRNA，由Dicer酶剪切成小片段，然后由RISC蛋白重新装配形成单链引导siRNA。研究表明，dicer和RISC蛋白的RNA链的结构和转化存在相似性(Hammond S.M.，Boettcher S.，Caudy A.A.，Kobayashi R.，Hammon G.J.Argonaute2，a link between geneticand biochemical analyses of RNAi.ScienceMAG-Hammond etal.293(5532)1146)。该理论表明，系统是通过必须具有特异性的小链发生作用。由于其在天然情况下产生环状结构，因此天然形式的靶基因中必须存在互补区域。如果系统是按照“小片段链”理论发生作用的，则最好的确认是能有2个或更多的区域沉默以确定发生这种特异性行为的受影响细胞。如果这种确认强烈，则信号应该会一直存在并会传递至机体的其它细胞。尽管这只是一种假设，但自然界中存在许多例子都能证实该理论。例如，基因是由仅有的两组互补的核苷酸组成的，而不是由更多的不同核苷酸组成。因此，很可能是为了天然识别一种明确重要的行为如发生的，或在较长一段时间内发生的或在整个机体中发生的基因沉默，确认必须通过2个或更多(虽然较短)组的指令同时传达，而不是仅通过一组较长的指令(虽然更特异和复杂)。本发明因此是基于上述理论的。
转染，电穿孔的方法或载体表达系统导入siRNA介导的基因沉默的不同方法包括但不仅限于导入裸露的双链siRNA；导入单链RNA以形成双链的发夹结构；导入一种含有合适启动序列的DNA质粒以诱导合成RNA的2条互补链，该链在转录位点或其它位点杂交而形成一双链RNA结构；导入构建的重组病毒以转录得到2条互补RNA链，转录后该链杂交而形成一双链RNA结构；导入含有遗传元件的重组细菌，其中的遗传元件在转录位点或其它位点能产生互补的双链RNA结构以及任何上述系统，于是产生合适序列的单链RNA，从而形成影响转录的双链发夹结构或其它双链结构。
根据上述设定的标准，采用选择的siRNA在体外转染细胞系或其它细胞(干细胞，淋巴细胞等)。用于各种目的的细胞详述于美国专利申请20020114784，20020173478，20030056235和20020132788。
为了进行细胞系转染，向24孔板中的每孔中加入总量为60pM的siRNA(3μl的20μM的溶液)。对于每孔，将siRNA加到50μl的Opti-MEM还原血清培养基中(Invitrogen)，轻轻混合。在一单独试管中，将3μl的Oligofectamine转染试剂(Invitrogen)与12μl的Opti-MEM轻轻混合，随后室温温育5分钟。混合管中的内容物并在室温下并温育20分钟使之能形成siRNA-Oligofectamine复合体。向每孔中加入68μl。根据其最终用途，在37℃下温育24孔板不同时间。如果需要进一步的转染，可以进行细胞传代，并在72小时或更长的时间后进行再转染。
向特定疾病导入的方法将这种的特别设计的dsRNA或siRNAp导入的方法包括本领域的普通技术人员公知的所有常用方法。
RNA可以直接导入细胞，细胞内。它还可以导入组织的腔中，如呼吸系统，胸膜腔或组织间隙。它还可以通过不同的注射形式，如静脉注射，动脉内注射或肌肉内注射的方式导入到机体的循环系统。血管或血管外循环系统，血液或淋巴系统，根部，以及脑脊髓液均为这种特别设计的RNA的导入位点。可以采用口服或将机体直接浸浴的方式将其导入。也可以将其喷洒于植物。它可以通过主要的或目标的有机体的遗传修饰来表达，或通过导入经过遗传修饰而使该RNA表达到主要或目标有机体中的另一有机体或载体来表达。可以通过向来源于合适有机体的受精卵、胚胎干细胞或其它多能干细胞中导入一种重组构建体，从而产生一种由这种构建体表达上述特定设计的RNA的转基因有机体。
导入这种特定设计的RNA的物理方法包括注射含有RNA的溶液，或用覆盖有或含有RNA的小颗粒来轰击，将细胞或有机体浸泡在含有RNA的溶液中或在RNA存在的条件下电穿孔细胞膜。其它本领域常用的方法还包括采用脂质体介导的载体运输和化学物质介导的运输系统。假如导入到有机体的细胞中，可以将病毒构建体包装成为病毒粒子而实现表达构建体的有效导入，该构建体引导上述特定设计的RNA。这些特定设计的RNA还可以与其它这些组分一起导入增强细胞对RNA的吸收的组分，促进双链变性的组分，使链稳定以及增强靶基因抑制的组分。
本发明还包括一种导入方法，该方法可用于治疗肺部感染，如SARS病毒或其它感染的疫苗。采用常用技术例如雾化器可以将所述的RNA导入人体的上和下呼吸系统。将这种RNA产生的遗传抑制导入到呼吸系统细胞和该系统中存在的免疫细胞中能预防特定的传染性疾病，因而形成疫苗。
本发明还包括一种导入方法，该方法将RNA体外导入到干细胞或免疫功能性细胞中。在导入产生遗传抑制的RNA后，所述的细胞被重新导回到有机体或人体以预防和治疗疾病。虽然很可能在机体中扩增和分化，但该细胞决不会改变所述有机体的遗传表达。如何应用上述导入方法的一个主要实施例是治疗HIV感染。
使用领域本发明以及用于遗传抑制的选择的特定RNA可以用于治疗和预防疾病。例如，如果此siRNA是用来治疗原癌基因Kras，那么原癌基因引发的癌症，如结肠癌，可以通过siRNA特异性的抗Kras而得以预防。一个实施例是采用这种RNA并将其导入癌细胞或肿瘤细胞中，从而抑制启动或保持所述癌症表型的基因的遗传表达。这还可应用于预防癌症，其通过选择性抑制致癌基因或使起始表型转化为癌症表型所必须的基因来实现。这种治疗可以应用于几乎所有类型的癌症，其本身或与其它治疗方式，例如化学治疗，放射治疗和手术治疗等一起联合使用。
本发明还可以以来源于任何病原体的基因为靶。例如，该基因可直接导致宿主免疫抑制或对病原体的复制、感染的传播和扩散十分重要。另外，可以将所述RNA导入到潜在感染细胞，如离体的免疫细胞和干细胞，并随后将其重新导回宿主从而预防或治疗疾病。可选择地，RNA可以采用不同的方法导入至危险细胞，例如通过雾化器导入到SARS病人的呼吸系统。仍有活力的呼吸细胞对SARS病毒基因组的抑制将能预防病毒的进一步的扩散，从而达到治疗的目的。
本发明不局限于任何类型的靶基因或核酸序列。出于说明目的，如下列出可能的靶基因类别发育基因，致癌基因，肿瘤抑制基因，酶基因等。
本发明还可用作方法学以生产对气候损伤、昆虫侵扰、病原体感染和成熟特性具有较小敏感性的植物。事实上，任何在农业中有用的基因都可能是这种特定选择的RNA的潜在靶。
本发明还可用于确定有机体的基因功能，包括采用RNA抑制以前未知其功能的靶基因的活性。反过来，本发明还可用于研究敲除(knock down)某一已知功能的基因对有机体的影响。本发明可用于鉴定药物形成的潜在靶和确定发育与衰老等的信号传递途径。可以预计本发明的方法可以用于形成预防和治疗各种疾病，包括感染和癌症的方法。
本发明的方法还可用于不同诊断方法和基因作图研究。它可用于高通量的筛选。它可作为试剂盒的组分。该试剂盒还可以包括指导试剂盒的使用者实施本发明的说明。
虽然本发明采用标准的和可实施的方法和实施方案来描述，但应当理解为本发明并不局限于或限制于这些已公开的内容。相反地，本发明涵盖了在所附权利要求的主旨和范围内的不同改进和类似的处理和方法。
应当明确，没有偏离本发明的新颖性概念的所描述发明的改进对本领域的技术人员来说是显而易见的，且这种改变被认为包含在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种抑制细胞中靶基因表达的方法，包括向细胞中导入能产生小干涉核糖核酸(siRNA)的dsRNA或siRNA前体，其中dsRNA或siRNA前体具有与靶基因的靶向被选择区域序列一致或接近一致的双链结构或单链发夹结构，该靶向被选择区域为在靶基因同一链中具有另一互补或接近互补区域而使该链形成双链的天然发夹结构或多种相同或不同发夹dsRNA的区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在靶基因同一链中具有另一个或数个互补区域，该互补区域与其具有19-23个核苷酸的最佳配对，该核苷酸具有siRNA功能选择性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在同一靶基因中具有另一个或数个互补区域，该互补区域与其具有少于全长19-23个核苷酸的任何数目的配对，该核苷酸具有siRNA功能选择性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在靶基因同一链中具有另一个或数个互补区域，该互补区域与其具有从第一个核苷酸开始的配对。
5.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在靶基因同一链中具有另一个或数个互补区域，该互补区域与其具有从任何位点开始的配对。
6.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在靶基因同一链中具有另一个或数个互补区域，该互补区域具有多个与其配对的片段，该片断具有9-23个核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在同一靶基因中只有一个互补区域。
8.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在同一靶基因中具有多个互补区域。
9.根据权利要求1所述的方法，其中靶向被选择区域在多个基因中具有互补区域，因而能使多个靶基因沉默。
10.根据权利要求1所述的方法，其中产生siRNA的dsRNA和siRNA前体的长度不超过23个核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中产生RNAi的dsRNA和siRNA前体含有24个或更多的核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中的靶基因为细胞基因。
13.根据权利要求1所述的方法，其中的靶基因为内源基因
14.根据权利要求1所述的方法，其中的靶基因为转基因。
15.根据权利要求1所述的方法，其中的靶基因为天然来源或人工来源的病毒基因。
16.根据权利要求1所述的方法，其中的细胞来源于人。
17.根据权利要求1所述的方法，其中的细胞来源于任何其他的动物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中的细胞来源于植物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中的siRNA前体或dsRNA含有一条自身互补的链。
20.根据权利要求1所述的方法，其中的siRNA前体或dsRNA含有两条独立的互补链。
21.根据权利要求1所述的方法，其中向细胞中导入是将dsRNA或siRNA前体导入到从有机体分离出的细胞中从而在体外完成目的抑制，然后将该细胞导回到同一或不同的有机体中从而实现基因抑制。
22.根据权利要求1所述的方法，其中的细胞存在于第一有机体中，所述向细胞中导入是通过将含dsRNA或siRNA前体的第二有机体导入到第一有机体中来实现对第一机体的导入。
23.根据权利要求1所述的方法，其中向细胞中导入是导入含有siRNA前体或dsRNA的表达构建体。
24.根据权利要求1所述的方法，其中的细胞选自良性或恶性的肿瘤细胞和在有机体中具有预防和治疗作用的肿瘤细胞。
全文摘要
本发明公开了一种抑制细胞中靶基因表达的方法，包括将从目标基因中特定选择的序列用于设计能产生本发明小干涉RNA(siRNA)的双链或其它形式RNA(siRNA前体或siRNAp)，导入该RNA，从而抑制细胞基因的表达。采用这种方法可以预防和治疗疾病，例如严重急性呼吸道综合症(SARS)和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。该方法可以在体内或体外进行。虽然生产的小干涉RNA通常为长23个核苷酸或更短的序列，但是，本发明的从目标基因中选择序列的方法可适用于任何长度的双链RNA。
文档编号A61K48/00GK1721530SQ20041006907
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月16日 优先权日2004年7月16日
发明者杨华显 申请人:杨华显