专利名称：高亲和力ny－eso t细胞受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有结合SLLMWITQC-HLA-A*0201特性并含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或对该复合物的解离速率(off-rate)(koff)为1×10-3S-1或更慢。
背景技术：
SLLMWITQC肽衍生自各种肿瘤所表达的NY-ESO-1蛋白(Chen等，(1997)，PNAS USA 94 1914-1918)。这些癌性细胞的I类HLA分子呈递含有SLLMWITQC的该蛋白的肽。因此，例如为向癌细胞递送细胞毒性或免疫刺激性药物，SLLMWITQC-HLA-A2复合物提供了TCR所靶向的一种癌症标记。然而，对于该目的，如果TCR对肽-HLA复合物比对该复合物特异的天然TCR具有更高亲和力和/或更慢的解离速率则更理想。
发明简述本发明首次利用了与SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物相互作用的高亲和力小于或等于1μM(KD)和/或较慢解离速率(koff)为1×10-3S-1或更慢的TCR。这种TCR可单独使用或与治疗性药物联用来靶向癌细胞呈递该复合物。
发明详述本发明提供具有结合SLLMWITQC-HLA-A*0201特性并含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的解离速率(off-rate)(koff)为1×10-3S-1或更慢。可通过任何已知的方法测定KD和/或(koff)。优选方法是实施例5的表面等离振子共振(Biacore)方法。
为了比较，通过实施例5的Biacore方法测定天然1G4 TCR(TCRα链见SEQ ID NO9和TCRβ链见SEQ ID NO10)的二硫键连接的可溶性变体与SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物相互作用的KD约为10μM，解离速率(koff)为1.28×10-1S-1，半衰期为0.17分钟。
SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的特异性天然1G4 TCR具有以下常用的Vα链和Vβ链基因α链-TRAV21β链-TRBV6.5。
天然1G4 TCR可用作模板在其中引入各种突变从而产生本发明TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物之间相互作用的高亲和力和/或慢解离速率。因此，与天然1G4 TCR α链可变区(见附
图1a和SEQ ID No1)和/或β链可变区(见附图1b和SEQ ID No2)相比，本发明包括在其至少一个互补决定区(CDR)和/或可变区框架区中发生突变的TCR。本发明也考虑了本发明TCR可变区中的其它超变区，例如超变4(HV4)区发生突变从而产生高亲和力的突变体。
天然TCR存在异源二聚体αβ或γδ形式。然而，以前的报道显示一条TCRα链或TCRβ链构成的重组TCR即能与肽MHC分子结合。
在一个实施方案中，本发明的TCR同时包含α链可变区和TCRβ链可变区。
本领域技术人员明显可知TCRα链序列和/或TCRβ链序列中的突变可以是一个或多个取代、缺失或插入。可用任何合适的方法来产生这些突变，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶切克隆或不依赖于连接反应的克隆(LIC)方法。这些方法详述于许多标准的分子生物学教材中。关于聚合酶链式反应(PCR)诱变和限制性酶切克隆的其它细节可见(Sambrook和Russell，(2001)，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，(第三版)，CSHL Press)。LIC方法的其它信息可见(Rashtchian，(1995)，Curr OpinBiotechnol，6(1)30-6)。
应注意含有与天然1G4 TCR相似的常用Vα和Vβ基因和因此相同的氨基酸序列的任何αβTCR可用作方便的模板TCR。然后可能将产生本发明突变的高亲和力TCR所需的改变引入编码模板αβ TCR的一个或两个可变区的DNA中。本领域技术人员显然知道可通过许多方法，例如定点诱变引入所需的突变。
与图1a和SEQ ID No1的天然1G4 TCRα链可变区序列中这些位置的氨基酸相比，本发明TCR包含对应于以下所列发生突变的一个或多个TCRα链可变区的氨基酸。
除非另有相反陈述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)残基。本领域技术人员可知该残基在重组蛋白产生过程中可以除去。此外，除非另有相反陈述，可溶性TCR和TCR可变区序列可在其N-末端截短。(分别导致TCRα和β链序列中的N-末端“K”和“NA”丢失)。本领域技术人员显然可知这些“丢失”的N-末端TCR残基可以重新引入本发明TCR中。本领域技术人员也显然知道，可将其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5或更多个残基，而基本不影响该TCR的pMHC结合性能，本发明包括所有这些不重要的变体。
本文所用的术语“可变区”应理解为包括某给定TCR的所有不包含在TCRα链的TRAC基因或TCRβ链的TRBC1或TRBC2(基因)所编码的恒定区内的氨基酸(序列)。(《T细胞受体手册》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8)。
本领域技术人员可知，在如上定义的可变区和恒定区之间交界处密码子所编码的氨基酸中发生变异可导致TCR库的部分多样性。例如，存在于野生型IG4 TCR序列此交界处的密码子(突变)导致本文可变区序列的C-末端存在酪氨酸(Y)残基。该酪氨酸取代了图8A所示，TRAC基因编码的N-末端精氨酸(N)残基。
本发明的实施方案包括含有对应于以下一个或多个α链可变区氨基酸发生突变的突变性TCR20V、51Q、52S、53S、94P、95T、96S、97G、98G、99S、100Y、101I和103T，例如以下氨基酸20A51P/S/T或M52P/F或G53W/H或T94H或A95L/M/A/Q/Y/E/I/F/V/N/G/S/D或R96L/T/Y/I/Q/V/E/X/A/W/R/G/H/D或K97D/N/V/S/T或A98P/H/S/T/W或A99T/Y/D/H/V/N/E/G/Q/K/A/I或R100F/M或D101P/T/或M103A以上采用的编号与图1a和SEQ ID No1所示相同。
本发明的实施方案也包括对应于以下所列一个或多个TCRβ链可变区氨基酸相对于图1b和SEQ ID No2的天然1G4 TCRβ链可变区中这些位置的氨基酸发生突变的TCR。所指示的可发生突变的氨基酸是18M、50G、51A、52G、53I、55D、56Q、70T、94Y、95V和97N，例如18V50S或A51V或I52Q53T或M55R56R70I94N或F
95L97G或D以上采用的编号与图1b和SEQ ID No2所示相同。
本发明的其它优选实施方案是含有图6所示突变的α链可变区氨基酸序列的TCR(SEQ ID No11到83)。这类TCR的表型沉默(phenotypicallysilent)变体也构成本发明的一部分。
本发明的其它优选实施方案是含有图7或13所示突变的β链可变区氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No84到99或117到121)。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。
天然TCR存在异源二聚体αβ或γδ形式。然而，以前的报道显示αα或ββ同源二聚体构成的重组TCR才能与肽MHC分子结合。因此，本发明的一个实施方案是TCR αα或TCRββ同源二聚体。
本发明的其它优选实施方案是含有下列α链可变区氨基酸序列和β链可变区氨基酸序列组合的TCR，这类TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分
优选实施方案是含有以下部分的TCRSEQ ID NO49所示的α链可变区和SEQ ID NO94所示的β链可变区，或其表型沉默变体。
在另一优选实施方案中，含有以上详述的可变区组合的本发明TCR还含有图8a所示α链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO100)和图8b和8c所示β链氨基酸恒定区序列之一(SEQ ID NO101和102)或其表型沉默变体。
本文所用的术语“表型沉默变体”应理解为指对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或具有1×10-3S-1或更慢的解离速率(koff)的那些TCR。例如，与以上详述的那些TCR相比，本领域技术人员已知可能产生在其恒定和/或可变区中掺入了最小变化但不改变与SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物相互作用的亲和力和/或解离速率的TCR。本发明范围包括这类不重要的变体。其中含有一个或多个保守取代的那些TCR也构成本发明的一部分。
就广义而言，本发明TCR可以如WO 04/033685和WO 03/020763所述为单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)形式。
合适的scTCR形式包括由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。
或者，所述第一区段可由对应于TCRβ链可变区氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成。
以上scTCR在第一和第二链之间还含有二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，其中该接头序列的长度和该二硫键的位置应使第一和第二区段的可变区序列的相互取向基本上如天然αβT细胞受体中的那样。
更具体地说，第一区段可由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，第二区段可由对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，和在第一和第二链之间可以存在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键。
在以上scTCR形式中，接头基团可连接第一区段C末端和第二区段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO103)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID NO104)本发明TCR的合适dTCR形式含有其序列对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的N末端相融合的第一多肽，和其序列对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的N末端相融合的第二多肽，该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键相连。
所述第一多肽可含有与对应于TCRα链恒定区胞外序列的N末端相融合的TCRα链可变区序列，而第二多肽的序列对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间的二硫键相连。(“TRAC”等在本文根据《T细胞受体手册》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8命名)。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式可具有对应于人αβTCR胞外恒定和可变区序列的氨基酸序列，和在天然TCR中没有等价物的二硫键可连接所述恒定区序列的氨基酸残基。与在天然TCR中其β碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基相对应的半胱氨酸残基之间存在二硫键，例如在取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间。就TCRα链而言，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRAC*01外显子1中的以下残基，就TCRβ链而言，是TRBC1*01或TRBC2*01外显子1中的以下残基
除了以上提及的非天然二硫键以外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对应于天然TCR中通过二硫键连接的残基的残基之间含有二硫键。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式的序列优选不含有对应于天然TCR的跨膜或细胞质序列。
本发明的优选实施方案提供由以下部分构成的可溶性TCRSEQ ID NO122的α链氨基酸序列和SEQ ID NO123的β链氨基酸序列；SEQ ID NO122的α链氨基酸序列和SEQ ID NO124的β链氨基酸序列；SEQ ID NO122、123和124的形式分别包含TCRα和β链序列中的N-末端甲硫氨酸(M)和N-末端“K”和“NA”。
PEG化的TCR单体在一个具体的实施方案中，本发明的TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。本领域技术人员已知有许多方法可产生这种结合。在一优选的实施方案中，该聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在其它实施方案中，本发明该方面的聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。
多价TCR复合物本发明一方面提供含有至少两种本发明TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方案中，至少两种TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这些复合物优选水溶性的，所以应照此选择接头部分。此外，接头部分优选能与TCR分子上所确定的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方案所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列延伸于不位于TCR可变区序列中的每种TCR的氨基酸残基之间。
由于本发明复合物可用作药物，接头部分应该适当考虑它们的药学适用性，例如它们的免疫原性来选择。
例如，本领域已知符合以上所需标准的接头部分的例子有连接抗体片段的技术。
两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。其中TCR通过聚亚烷基二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方案。
第一类是亲水性聚合物，例如聚亚烷基二醇。最常用的该类聚合物是结构如下式所示的聚乙二醇或PEG。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物。
这种聚合物可用于处理或偶联治疗性药物，特别是多肽或蛋白质治疗剂来有益地改变该疗剂的PK分布，例如降低肾廓清率、提高血浆半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。据信，PEG分子在治疗剂周围形成的“外壳”能在立体上阻碍治疗剂与免疫系统反应并降低其蛋白酶降解从而导致PEG-治疗偶联物PK分布的这种改善。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用亲水性聚合物的分子大小可根据TCR复合物预定的治疗应用来具体选择。因此，例如当要该产品离开循环(系统)透过组织时，如用于治疗肿瘤时，宜利用5 KDa级别的低分子量聚合物。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，参见Harris，(1992)，《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》(Polyethylene GlycolChemistry-Biotechnical and Biomedical Applications)，Plenum，New York，NY或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》(Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books)，Washington，D.C.。
所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。
该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有化学反应活性基团而使该聚合物能与PCR中的靶位点相连。如下所示，这种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物或反应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)反应活性化学(基团)-间隔基团-亲水性聚合物-间隔基团-反应活性化学(基团)用于形成以上概述的该类型构建物的间隔基团可以是无反应活性、化学稳定的、链状任何有机部分。这种间隔基团包括但不限于以下基团-(CH2)n-，其中n＝2到5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与该复合物的TCR连接点之间的本发明TCR复合物是该方面的另一种实施方案。
其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明TCR复合物是该方面的其它实施方案。
本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物有许多商业供应商。这些供应商包括Nektar Therapeutics(CA，美国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韩国)和Enzon Pharmaceuticals(NJ，美国)。
本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物包括但不限于以下聚合物
可利用各种偶联化学(物质)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽治疗剂。选择最合适的偶联化学(物质)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(物质)已用于连接PEG分子(来源Nektar分子工程目录2003(Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003))的一个或多个末端N-马来酰亚胺乙烯砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)琥珀酰亚胺丁酸酯硫代酸酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适的接头。例如，可以利用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。
肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用为在TCR分子上产生可连接的简单接头或多聚化结构域。曾采用生物素/链霉亲和素系统来产生体外结合研究用的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于治疗剂不理想。
其中TCR通过源自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明TCR复合物提供了本发明的另一种实施方案。
有许多含多聚化结构域的人蛋白质可用于产生多价TCR复合物。例如，与单体scFV片段相比，已用于产生scFv抗体片段四聚体的p53四聚化结构域显示血清持久性增加和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可能用于该类应用的四聚化结构域。
含有至少两种TCR的本发明多价TCR复合物提供了该方面的最后一种实施方案，该复合物中所述TCR的至少一种与治疗性药物结合。
在一方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可在其α或β链的C-末端或N-末端包含反应活性半胱氨酸。
诊断和治疗应用一方面，本发明TCR可以与治疗性药物或可检测部分结合。例如，所述治疗性药物或可检测部分可与TCR共价相连。
在本发明的一个实施方案中，所述治疗性药物或可检测部分与一条或两条TCR链的C-末端共价相连。
一方面，可利用可检测部分，例如适用于诊断目的的标记物来标记本发明TCR的scTCR或一条或两条dTCR链。这种标记的TCR可用于检测SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的方法，该方法包括使TCR配体与该TCR配体特异性的TCR(或多聚高亲和力TCR复合物)接触；和检测与该TCR配体的结合情况。在例如利用生物素化的异源二聚体形成的四聚体TCR复合物(检测)中，可利用荧光链霉亲和素来提供可检测标记。这种荧光标记的TCR四聚体适用于FACS分析，例如来检测携带这些高亲和力TCR特异的SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的抗原呈递细胞。
可检测本发明可溶性TCR的另一种方法是利用TCR特异性抗体，特别是单克隆抗体。有许多商业可购得的抗-TCR抗体，例如αFl和βF1可分别识别α和β链的恒定区。
在其它方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可与治疗性药物结合(例如，以共价或其它方式相连)，所述药物可以是，例如用于杀伤细胞的毒性部分，或免疫效应分子，如白介素或细胞因子。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物对TCR配体的结合能力提高。因此，本发明的多价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用作中间体来产生具有这种用途的其它多价TCR复合物。因此，这些TCR或多价TCR复合物可以在体内应用的药学上可接受的制剂中提供。
本发明也提供将治疗性药物递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价TCR复合物对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物具有特异性并结合有治疗性药物。
具体地说，本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可用于将治疗性药物递送至呈递具体抗原的细胞。这可用于许多情况，特别是抵御肿瘤。治疗性药物的递送应可在局部起作用而非只对与其结合的细胞起作用。因此，一种具体方案设想可采用与肿瘤抗原特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连的抗肿瘤分子。
为此可利用许多治疗性药物，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化疗药物(例如，顺铂)。为保证在所需部位发挥毒性作用，可将毒素包裹在与链霉亲和素相连的脂质体内从而使该化合物缓慢释放。这防止了毒素在体内转运期间遭受破坏并且保证了TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。
其它合适的治疗性药物包括·小分子细胞毒性药物，即分子量小于700道尔顿，能杀伤哺乳动物细胞的化合物。这种化合物也可含有具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应该理解这些小分子细胞毒性药物也包括药物前体，即能在生理条件下分解或转变从而释放细胞毒性药物的化合物。这种药物的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西他赛(docetaxel)、鬼臼亚乙苷、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺、依利替康(irinotecan)、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer sodiumphotofrin II、替莫唑胺(temozolmide)、拓扑替康(topotecan)、trimetreate glucuronate、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，即能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。包括但不限于蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不稳定同位素，其在衰减同时发射一种或多种α或β粒子，或γ射线。包括但不限于；碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；也可利用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多聚体结合；·药物前体，包括但不限于抗体定向的酶前体药物；·免疫刺激剂，即能激活免疫应答的部分。包括但不限于细胞因子，例如IL-2和IFN；超抗原和其变体；TCR-HLA融合物和趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域；病毒/细菌蛋白肽和抗T细胞决定簇抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28)。
功能性抗体片段和变体适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/同类物包括但不限于以下。
抗体片段本领域技术人员已知可能产生基本上保留了亲代抗体相同结合特性的某给定抗体的片段。下文提供了这种片段的细节微小体(minibody)一这些构建物由具有截短的Fc部分的抗体组成。同样，它们保留了其所衍生抗体的完整结合结构域。
Fab片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白重链的一部分共价相连的一条免疫球蛋白轻链。同样，Fab片段包含一个抗原结合位点。Fab片段定义为用木瓜蛋白酶处理而释放的IgG的一部分。这种片段一般可经重组DNA技术生产。(Reeves等，(2000)，《免疫学讲稿》(Lecture Notes onImmunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)F(ab’)2片段-这些(构建物)包含一种抗体的二个抗原结合位点和绞链区。F(ab’)2片段定义为用胃蛋白酶处理而释放的IgG的一部分。这种片段一般可经重组DNA技术生产。(Reeves等，(2000)，《免疫学讲稿》(LectureNotes on Immunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)Fv片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白轻(链)可变区共价相连的免疫球蛋白重(链)可变区。已产生了许多Fv设计。这些(构建物)包含通过引入二硫键来增强两结构域之间缔合的dsFv。或者，可利用肽接头将两个结构域结合到一起成为一条多肽来形成scFv。也已产生了含有免疫球蛋白重链或轻链的可变区，并与相应的免疫球蛋白重链或轻链的可变或恒定区相结合的Fv构建物。Fv也可多聚化而形成二抗体或三抗体(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。
NanobodiesTM-由Ablynx(比利时)投入市场的这些构建物包含衍生自camelid(例如，骆驼或美洲驼)抗体的一个合成的免疫球蛋白重(链)可变区。
结构域抗体-由Domantis(比利时)投入市场的这些构建物包含亲和力成熟的一个免疫球蛋白重(链)可变区或免疫球蛋白轻(链)可变区。
抗体变体和同类物本发明抗体所定义的功能特性是它们能特异性结合靶配体。本领域技术人员已知可能工程改造许多其它蛋白质的这种结合特性。适用于本发明组合物和方法的抗体变体和同类物的例子包括但不限于以下。
基于蛋白质支架的多肽-该结合构建物家族包括含天然结合环的蛋白质的突变同类物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市场，基于衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的一个IgG结合结构域的三螺旋基序的Affibodies。另一例子是由EvoGenix(澳大利亚)投入市场，基于移植了类似于抗体结合环结构域的CTLA-4胞外结构域的Evibodies。最后一个例子是由Regeneron Pharmaceuticals(US)投入市场，将细胞因子受体结构域移植入抗体支架的Cytokine Traps。(Nygren等，(2000)Current Opinion inStructural biology，7 463-469)是利用支架来工程改造蛋白质中新结合位点的综述。该综述提及以下支架来源的蛋白质CP1锌指(结构)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z结构域(蛋白A同类物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和细胞色素b562。其它蛋白质支架研究报道了纤连蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和锚蛋白重复(单位)的应用。
本领域技术人员已知可以产生能与某给定蛋白配体不同部分结合的抗体或其片段，变体或同类物。例如，可产生针对形成CD3复合物多肽链(即，γ、δ、ε、ζ和η CD3链)之一的抗-CD3抗体。能与εCD3链结合的抗体是本发明组合物和方法所用的优选抗-CD3抗体。
本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将药物前体转化为药物的酶相连。这可使药物前体只在所需部位转化为药物(即，通过sTCR靶向)。
预计本文所述的高亲和力SLLMWITQC(SEQ ID NO125)-HLA-A*0201特异性TCR可用于癌症的诊断和治疗方法。
就癌症治疗而言，定位在肿瘤或转移(性肿瘤)的附近可提高毒素或免疫刺激剂的效力。就疫苗递送而言，可将疫苗抗原定位在抗原呈递细胞附近，从而提高该抗原的效力。该方法也可应用于摄像目的。
分离能呈递本发明TCR的细胞是实施方案之一。例如，所述细胞可以是T细胞。
本发明的其它实施方案是含有以下组分的药物组合物
本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗性药物相结合)，或能呈递至少一种本发明TCR的多个细胞与药学上可接受的运载体。
本发明也提供一种癌症治疗方法，包括给予患癌症的对象有效量的本发明TCR或多价TCR复合物(任选与治疗性药物相结合)，能呈递至少一种本发明TCR的多个细胞。在一相关实施方案中，本发明提供本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗性药物相结合)，或能呈递至少一种本发明TCR的多个细胞在制备治疗癌症组合物中的应用。
本发明的治疗性或摄像TCR一般可作为含有药学上可接受的运载体的无菌药物组合物的一部分提供。该药物组合物可采用任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。该药物组合物可以单位剂型提供，一般装在密封容器中或作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然不一定)装有使用说明书。该试剂盒可装有多个所述单位剂型。
该药物组合物可采用任何合适的途径给予，例如胃肠外、透皮或经吸入，优选胃肠外(包括皮下、肌肉内，或最优选静脉内)途径。可通过药学领域已知的任何方法，例如在无菌条件下混合活性成分与运载体或赋形剂来制备这种组合物。
取决于待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，本发明物质的剂量范围很广，医师可最终确定所用的合适剂量。
其它方面本发明的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构成)可以是基本纯形式、或作为纯化或分离的制剂提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。
本发明也提供与SLLMWITQC-HLA-A*0201结合特性具有高亲和力的TCR的制备方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，和(ii)对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的解离速率(koff)为1×10-3S-1或更慢，该方法包括(a)制备含有1G4 TCR的α和β链可变区的TCR，其中α和β链可变区的一个或两个在权利要求7和8中所鉴定的一个或多个氨基酸中含有突变；(b)在适合于TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201结合的条件下使所述突变的TCR与SLLMWITQC-HLA-A*0201接触；和测定该相互作用的KD和/或koff。
本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面的一样。本文提及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。
实施例以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
下文参考的附图是图1a和1b分别详细描述了天然1G4 TCR的α链可变区氨基酸序列和β链可变区氨基酸序列。
图2a和2b分别显示了可溶性天然1G4 TCRα链和β链的DNA序列。
图3a和3b分别显示了从图2a和2b的DNA序列产生的1G4 TCRα和β链胞外氨基酸序列。
图4a和4b分别显示了可溶性1G4 TCRα和β链的DNA序列经突变而含有额外的半胱氨酸残基从而形成非天然的二硫键。阴影表示突变的密码子。
图5a和5b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的1G4 TCRα和β链胞外氨基酸序列。阴影表示所引入的半胱氨酸。
图6详细描述了高亲和力1G4 TCR变体的α链可变区氨基酸序列。
图7详细描述了高亲和力1G4 TCR变体的β链可变区氨基酸序列。
图8a详细描述了可溶形式TRA的氨基酸序列。
图8b详细描述了可溶形式TRBC1的氨基酸序列。
图8c详细描述了可溶形式TRBC2的氨基酸序列。
图9详细描述了pEX954质粒的DNA序列。
图10详细描述了pEX821质粒的DNA序列。
图11详细描述了pEX202质粒的DNA序列。
图12详细描述了pEX205质粒的DNA序列。
图13详细描述了高亲和力1G4 TCR变体的其它β链可变区氨基酸序列。
图14a详细描述了优选的可溶性高亲和力1G4 TCR变体的α链氨基酸序列。
图14b详细描述了采用TRBC1恒定区的优选(c58c61)可溶性高亲和力1G4TCR变体的β链氨基酸序列。
图14c详细描述了采用TRBC2恒定区的优选(c58c61)可溶性高亲和力1G4TCR变体的β链氨基酸序列。
图14d详细描述了优选(c58c61)的可溶性高亲和力1G4 TCR的β链氨基酸序列，其采用了经肽接头与野生型人IL-2融合的TRBC2编码的恒定区。
图15a显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各种浓度范围的NY-ESO-同类物SLLMWITQV肽脉冲的T2细胞的FAC染色。
图15b显示了采用高亲和力c58c611G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各种浓度范围NY-ESO-衍生SLLMWITQV肽脉冲的T2细胞的FAC染色。
图16显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以产生SLLMWITQV肽的泛素小基因(±蛋白体抑制剂)转染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌细胞的FAC染色。
图17显示的ELISPOT数据证明可溶性高亲和力c58c61 1G4 TCR能抑制抗MEL-624癌细胞的CTL激活。
图18显示的ELISPOT数据证明可溶性高亲和力c58c61 1G4 TCR能抑制抗SK-MEL-37癌细胞的CTL激活。
图19显示了如IFNγ产生所检测的那样，可溶性c58c61高亲和力1G4 TCR抑制了抗肽脉冲T2细胞的T细胞激活。
图20显示如IFNγ产生所检测的那样，可溶性野生型1G4 TCR不能抑制抗肽脉冲T2细胞的T细胞激活。
图21显示了可溶性c58c61高亲和力1G4 TCR-IL-2免疫偶联物导致的肿瘤生长抑制。
图22显示了荧光显微术测定的Me1 526、Mel 624和SK-Mel-37癌细胞表面SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原的数目。通过与链霉亲和素-R-藻红蛋白(PE)偶联帮助目测与细胞结合的生物素化可溶性c58c61高亲和力1G4 TCR。
实施例1-制备含有天然1G4 TCR可变区的二硫键连接的可溶性TCRRNA分离将10000克隆的T细胞重悬在100μl三试剂(tri-reagent)(Sigma)中按照生产商使用说明进行裂解分离得到总RNA。最后沉淀后，将RNA再溶解于12.5μl无RNA酶的水中。
制备cDNA在以上RNA样品中加入2.5μl的10mM寡聚dT15(Promega)，60℃培育样品2分钟然后置于冰上。加入2μl RT缓冲液(10×)、2μl5mM dNTP、1μl Omniscript逆转录酶，用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen)进行逆转录。混合样品，37℃培育1小时。然后将cDNA保存在-80℃。
以上cDNA用作模板。采用含有所有可能的α和β可变链的一组正向引物来筛选并通过PCR扩增α和β链基因。利用得自《T细胞受体手册》(T cellreceptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN0-12-441352-8的登录号从NCBI网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)设计用于TCR链基因扩增的引物序列。设计α链正向引物含有ClaI限制性位点和通用的α链反向引物含有Sall限制性位点。设计β链正向引物含有AseI限制性位点和通用的β链反向引物含有AgeI限制性位点。
TCR基因片段的受体载体以含有能在大肠杆菌菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子的pGMT7亲代质粒为基础(Pan等，Biotechniques(2000)，29(6)1234-8)。
用ClaI和SalII消化α链纯化的PCR产物，连接入用ClaI和XhoI切割后的pEX954(见图9)中。
用AseI和AgeI消化β链纯化的PCR产物，连接入用NdeI/AgeI切割后的pEX821(见图10)中。
连接按照生产商使用说明利用快速DNA连接试剂盒(Roche)连接切割的PCR产物和切割的载体。
将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞中接种于含有100mg/ml氨苄西林的LB/琼脂板上。37℃培育过夜后，挑出单个菌落，37℃在含有100mg/ml氨苄西林的10ml LB中振荡培养过夜。用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化所克隆的质粒，用自动DNA测序仪(Lark Technologies)测序插入物。
图4a和4b分别显示了可溶性1G4 TCRα和β链的DNA序列经突变而含有额外的半胱氨酸残基所形成的非天然二硫键。
图5a和5b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的NY-ESO TCRα和β链的胞外氨基酸序列。
实施例2-制备二硫键连接的可溶性1G4 TCR的高亲和力变体如实施例1所述制备的二硫键连接的可溶性天然1G4 TCR可用作制备本发明的对SLLMWITQC(SEQ ID NO125)-HLA-A*0201复合物的亲和力增加的TCR的模板。
图6和7分别详细列出了显示对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物具有高亲和力的突变TCRα和β链可变区的氨基酸序列。(分别是SEQ ID No11-83和84-99)。本领域技术人员已知，可将制备这些突变链所需的密码子变化通过定点诱变引入编码这些链的DNA。(Stratagene的QuickChangeTM定点诱变试剂盒)。
简言之，这可通过利用掺入了所需密码子变化的引物和含有相关1G4 TCR链作为诱变模板的质粒来实现。
采用以下条件进行诱变50ng质粒模板、1μl的10mM dNTP、5μl生产商提供的10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1μl pfu DNA聚合酶，总体积50μl。2分钟95℃初始变性步骤后，反应经过变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，8分钟)，共25轮。用DpnI限制性内切酶消化得到的产物以除去模板质粒并将其转化入大肠杆菌XL1-蓝菌株。通过测序来验证诱变。
实施例3-制备可溶性“扣紧的”高亲和力TCRα链-c-jun亮氨酸拉链(结构)通过PCR缝合(stitching)制备此构建物。
就基因的5’-端而言，将编码高亲和力TCRα链和含有所引入的链间二硫键的密码子的质粒用作模板。用以下两对引物进行PCR产生所需的可变区。
5’-TRAV21正向引物tctctcattaatgaaacaggaggtgacgcagattcct(SEQ ID NO105)C-α反向引物CGGCAGGGTCAGGGTTCTGG(SEQ ID NO106)就基因的3’-端而言，将编码与人c-jun亮氨酸拉链区融合的野生型亲和力TCRα链和不含有所引入的链间二硫键的密码子的质粒用作模板。用以下引物对进行PCR产生所需的恒定区。
C-α正向引物CCAGAACCCTGACCCTGCCG(SEQ ID NO107)3’-α反向引物aagcttcccgggggaactttctgggctggg(SEQ ID NO108)混合两种产物并稀释1000倍，取1μl加入含5’-TRAV21正向引物和3’-α反向引物的50μl PCR(反应液)中用作模板。
用限制性内切酶AseI和XmaI消化得到的PCR产物，连接入用NdeI和XmaI切割后的pEX202中。
采用以下条件进行PCR50pg质粒模板、1μl的10mM dNTP、5μl生产商提供的10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1μl Pfu DNA聚合酶，总体积50μl。2分钟95℃初始变性步骤后，反应经过变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，2分钟)，共30轮。
β链-c-fos亮氨酸拉链(结构)通过PCR缝合制备此构建物。
就基因的5’-端而言，将编码高亲和力TCRβ链和含有所引入的链间二硫键(的密码子)的质粒用作模板。用以下两引物进行PCR产生所需的可变区基因片段。
TRBV6-5正向引物tctctcattaatgaatgctggtgtcactcagacccc(SEQ ID NO109)C-β反向引物CTTCTGATGGCTCAAACACAGC(SEQ ID NO110)就基因的3’-端而言，将编码与人c-fos亮氨酸拉链结构域融合的野生型亲和力TCRβ链和不含有所引入的链间二硫键的密码子的质粒用作模板。用以下两种引物进行PCR产生所需的恒定区基因片段。
C-β正向引物GCTGTGTTTGAGCCATCAGAAG(SEQ ID NO111)TRBC反向引物aagcttcccggggtctgctctaccccaggc(SEQ ID NO112)混合两种产物并稀释1000倍，取1μl加入含TRBV6-5正向引物和TRBC反向引物的50μl PCR(反应液)中用作模板。如上所述进行PCR。
利用限制性内切酶AseI和XmaI消化得到的PCR产物并用NdeI和XmaI连接入pEX205切口。
实施例4-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化将实施例1、2或3所制备的分别含有突变的α-链和β-链的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21pLysS，将氨苄西林抗性的单个菌落于37℃在TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基中生长至OD600为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时在Beckman J-6B中4000rpm离心30分钟收集细胞。细胞沉淀重悬于含有50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH 8.0的缓冲液中。冻融过夜后，在MilsonixXL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬细胞进行1分钟爆发性超声波处理，共约10分钟。在Beckman J2-21离心机中13000 rpm离心30分钟回收包涵体沉淀。然后用洗涤剂洗涤3次除去细胞碎片和膜组分。每次包涵体在Triton缓冲液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mM NaCI、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)中匀浆，然后在Beckman J2-21中以13000 rpm离心沉淀15分钟。然后用以下缓冲液进行类似的洗涤除去洗涤剂和盐50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分为30mg等份试样，-70℃冷冻。用6M胍-HCl溶解并用Bradford染料结合试验(PerBio)来定量测定包涵体蛋白产量。
从冷冻储备物中融解含约30mg TCRβ链和60mg TCRα链的溶解包涵体，然后混合样品，将混合物稀释在15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM乙酸钠、10mM EDTA)中以保证链完全变性。然后将含有完全还原变性的TCR链的胍溶液注入1升以下重折叠缓冲液中100mM Tris pH 8.5，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，5M脲，0.2mMPMSF。加入氧化还原对(2-巯基乙胺和胱胺(至终浓度分别为6.6mM和3.7mM))，约5分钟后加入变性的TCR链。溶液放置5小时±15分钟。重折叠的TCR在Spectrapor 1膜(Spectrum；产品号.132670)中用10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小时。然后将透析缓冲液更换为新鲜的10mMTris pH 8.1(10L)，继续5℃±3℃透析20-22小时。
将透析的重折叠物加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上，用Akta纯化仪(Pharmacia)以超过50个柱体积的0-500mM NaCl梯度液洗脱结合的蛋白质从而将sTCR与降解产物和杂质分开。将诸峰组分保存于4℃，考马斯染色SDS-PAGE分析，然后合并与浓缩。最后，用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.5 mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))中预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和特征鉴定sTCR。合并与浓缩相对分子量约50 kDa的洗脱峰后用Biacore表面等离振子共振分析来特征鉴定。
实施例5-Biacore表面等离振子共振特征鉴定与特异性pMHC结合的sTCR用表面等离振子共振生物传感器(Biacore 3000TM)分析sTCR与其肽-MHC配体的结合情况。制备以半定向方式固定在链霉亲和素包被的结合表面上的单种pMHC复合物(描述于下文)有助于该项分析，可同时有效地测试可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定在不同的流动小室上)的结合情况。手动注入HLA复合物可以方便地操控固定的I类分子的精确水平。
在体外重折叠含有组成型亚基蛋白和合成肽的细菌表达的包涵体的生物素化I类HLA-A*0201分子，然后纯化并进行体外酶(催化)生物素化(O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15)。表达的HLA-A*0201-重链含有以合适的结构取代了该蛋白质的跨膜和细胞质结构域的C-末端生物素化标签。得到的包涵体表达水平约为75mg/升细菌培养液。MHC轻链或β2-微球蛋白也在大肠杆菌中以约500mg/升细菌培养液的水平以合适的结构表达为包涵体。
裂解大肠杆菌，将包涵体纯化至约80％纯。包涵体的蛋白质用6M胍-HCl、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA变性，通过在＜5℃时将变性蛋白质一次脉冲加入重折叠缓冲液中，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度加样HLA-A*0201分子，需要在0.4ML-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml SLLMWITQC肽(溶液)中重折叠。重折叠在4℃至少进行1小时方达到完全。
用10倍体积的10mM Tris pH 8.1透析更换缓冲液。为充分降低溶液的离子强度，缓冲液需要更换两次。然后将蛋白质溶液通过1.5μm乙酸纤维素滤膜过滤，加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上(床体积8ml)。用0-500mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白。HLA-A*0201-肽复合物大约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，各组分冷藏于冰上。
用以相同缓冲液预平衡的Pharmacia快速脱盐柱将生物素化标记pMHC分子的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白质的组分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化试剂1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/mlBirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15纯化)。然后将混合物在室温培育过夜。
采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pHLA-A*0201分子。用已过滤的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加入1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5ml/分钟过柱。生物素化的pHLA-A*0201分子作为单峰洗脱约15ml。合并含有蛋白质的组分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白质浓度，生物素化的pHLA-A*0201分子等份试样保存在-20℃。采用标准的胺偶联方法固定链霉亲和素。
这种固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注射入溶液相。即使在低浓度(至少40μg/ml)也能获得TCR的特异性结合，提示该TCR较稳定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，观察到sTCR的pMHC结合特性在质量和数量上相似。这是控制可溶性TCR部分活性的重要方法，也提示生物素化pMHC复合物与非生物素化复合物生物活性相同。
在Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含有新的链间键的1G4 sTCR与其配体/MHC复合物或无关的HLA-肽混合物(制备方法如上所述)之间的相互作用。SPR检测到在小流动室中接近传感器表面的折射指数变化，以应答单位(RU)表示，此种原理可用于检测受体配体相互作用并分析它们的亲和力和动力学参数。通过交联于β2m上的生物素和链霉亲和素(二者用化学方法交联于流动小室的活化表面)之间的结合作用将各个HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中来制备探针流动小室。然后使sTCR以恒定流速流过不同流动小室的表面，再测定这样做时的SPR应答来进行该试验。
测定平衡结合常数制备WT IG4 sTCR的连续稀释液，以5μl每分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个小室用约1000 RU的特异性SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物包被，第二个用约1000 RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。用对照小室的测量值使每种浓度的应答标准化。将标准化数据应答对TCR样品的浓度作图并拟合为双曲线计算出平衡结合常数KD。(Price和Dwek，《生物化学家的物理化学原理与问题》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，Oxford)。
测定动力学参数通过实验性测定解离速率常数kd和结合速率常数ka来测定高亲和力TCR的KD。平衡常数KD计算为kd/ka。
将TCR注入两个不同的小室中，一个小室用约300 RU的特异性HLA-A2-nyeso肽复合物包被，第二个用约300 RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50μl/分钟。一般注入约3μM浓度的250μl TCR。然后使缓冲液流过直至应答(曲线)回归至基线。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离阶段拟合为能计算半衰期的单指数衰退方程。
结果用以上方法分析了二硫键连接的可溶性天然1G4 TCR(由SEQ ID NO9和10分别详细描述的α和βTCR链构成)和SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物之间的相互作用，显示KD为15μM，koff为1.28×10-1S-1。
下表所述的TCR的KD小于或等于1μM和/或koff为1×10-3S-1或更慢。
实施例6-用高亲和力c58c61 NY-ESO TCR-IL-2融合蛋白的体外细胞染色37℃用浓度范围10-5-10-10M的NY-ESO-衍生的SLLMWITQC、NY-ESO-同类物SLLMWITQV肽或无关肽，脉冲T2成淋巴细胞样细胞180分钟。利用NY-ESO-同类物SLLMWITQV肽(V-变体肽)是因已知该肽对HLA-A*0201复合物结合槽的亲和力高于天然NY-ESO-衍生的SLLMWITQC肽。脉冲后，用不含血清的RPMI洗涤细胞，将5×105个细胞室温与高亲和力c58c61 NY-ESO TCR-IL-2融合蛋白培育10分钟，然后室温与偶联PE的抗-IL-2 mAb(Serotec)二抗培育15分钟。洗涤后，用FACSVantage SE(BectonDickinson)作流式细胞术定量测定所结合的TCR-IL-2。也包括用肽-脉冲的T2细胞作对照，其中省去了TCR-IL-2。
图14a详细描述了c58c61 NY-ESO TCR的α链的氨基酸序列。(SEQ IDNO122)。
图14c详细描述了采用TRBC2编码恒定区的c58c61 NY-ESO TCRβ链的氨基酸序列。
图14d(SEQ ID NO125)详细描述了采用经肽接头与野生型人IL-2融合的TRBC2编码恒定区的c58c61 NY-ESO TCRβ链的氨基酸序列。
可溶性c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白中含有的α和β链可变区突变分别对应于SEQ ID NO49和SEQ ID NO94中详述的那些突变。应注意SEQ IDNO121-125提供的形式中包括在大多数其它TCRα链和β链氨基酸序列中已删除的N-末端甲硫氨酸(M)与“K”和“NA”残基。
在类似实验中，利用以表达NY-ESO-衍生的SLLMWITQC肽的泛素小基因构建物转染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌细胞。基本上采用(Rimoldi等，(2000)，J.Immunol.，165 7253-7261)所述的方法转染癌细胞。如上所述标记这些细胞。
结果图15a显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各种浓度范围的NY-ESO-同类物SLLMWITQV肽脉冲T2细胞的FAC染色。
图15a显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各种浓度范围的NY-ESO-同类物SLLMWITQV肽脉冲T2细胞的FAC染色。
图15b显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各种浓度范围的NY-ESO-衍生SLLMWITQV肽浓度脉冲T2细胞的FAC染色。
图16显示了采用高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以产生SLLMWITQV肽的泛素小基因(±蛋白体抑制剂)转染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌细胞的FAC染色。
实施例9-CTL激活的ELISPOT试验进行以下试验来证明可溶性高亲和力c58c61 NY-ESO TCR能抑制SLLMWITQC-HLA-A*0201特异性CTL克隆(1G4)的激活。利用IFN-γ产生作为CTL激活的读出值。
试剂R10试验培养基10％FCS(热灭活，Gibco，目录号10108-165)、88％RPMI1640(Gibco，目录号42401-018)、1％谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)和1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。
肽(得自各种来源)最初以4mg/ml溶解于DMSO(Sigma，目录号D2650)并冷冻。
洗涤缓冲液0.01M PBS/0.05％吐温20(将Sigma的1袋含吐温20的磷酸缓冲盐，pH7.4(目录号P-3563)溶解于1升蒸馏水中得到最终组成为0.01MPBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐温20)。
PBS(Gibco，目录号10010-015)。
EliSpot试剂盒含有所需的所有其它试剂，即捕获与检测抗体、脱脂奶粉、BSA、链霉亲和素碱性磷酸酶、BCIP/NBT溶液(人IFN-g PVDF Eli-spot 20×96孔板(IDS目录号DC-856.051.020，DC-856.000.000)。以下方法按照每个试剂盒提供但有所不同的使用说明书进行。
用胰蛋白酶37℃处理MEL-624和SK-MEL-37黑色素瘤细胞系5分钟。然后用R10培养基洗涤并重悬细胞。
然后以每孔50000个靶细胞(50μl R10培养基)接种在96孔ELISPOT板上(Diaclone)。
在以上靶细胞培养液加入以下组分
50μl R10培养基配制的1×10-7M高亲和力c58c61 TCR或无关TCR，50μl R10培养基配制的600个SLLMWITQC-HLA-A*0201特异性T细胞(克隆1G4)。
然后在37℃、5％CO2培育这些培养物24小时。按照生产商使用说明书处理ELISPOT板。
结果通过IFN-γ产生，检测到可溶性高亲和力c58c61 1G4 TCR强烈抑制了抗黑色素瘤细胞的1G4 T细胞克隆的激活。而无关的高亲和力TCR无此抑制作用。(MEL-624癌细胞系的结果见图17，SK-MEL-37癌细胞系的结果见图18)实施例10-CTL激活的ELISA测定进行以下试验证明了可溶性高亲和力c58c61 1G4 TCR能抑制SLLMWITQC-HLA-A*0201特异性CTL克隆(1G4)的激活。利用IFN-γ产生作为CTL激活的读出值。
试剂R10试验培养基10％FCS(热灭活，Gibco，目录号10108-165)、88％RPMI1640(Gibco，目录号42401-018)、1％谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)和1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。
肽(得自各种来源)最初以4mg/ml溶解于DMSO(Sigma，目录号D2650)并冷冻。
洗涤缓冲液0.01M PBS/0.05％吐温20(将Sigma的1袋含吐温20的磷酸缓冲盐，pH7.4(目录号P-3563)溶解于1升蒸馏水中得到最终组成为0.01MPBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐温20)。
PBS(Gibco，目录号10010-015)。
ELISA试剂盒装有除BSA(Sigma)以外的所需的所有其它试剂，即捕获与检测抗体、脱脂奶粉、链霉亲和素-HRP、TMB溶液(人IFN-g Eli-pair 20×96孔板。以下方法基本上依据每个试剂盒提供的使用说明书进行。
方法根据生产商使用说明准备ELISA板。(Diaclone试剂盒，免疫诊断系统，英国)用含或不含不同浓度(100nM-10pM)的SLLMWITQC肽的R10培养基洗涤并重悬T2细胞系靶细胞，然后在37℃、5％CO2培育1小时。
然后以每孔10,000个靶细胞接种入96孔ELISA板。
在这些板的相关孔中加入以下组分50μl R10培养基配制的1×10-6M到3×10-12M高亲和力c58c611G4TCR，50μl R10培养基配制的5000个效应细胞。
然后在37℃、5％CO2培育这些板48小时。按照生产商使用说明处理ELISA(板)。
结果通过IFN-γ产生，检测到可溶性高亲和力c58c61 1G4 TCR强烈抑制了抗肽脉冲靶细胞的1G4 T细胞克隆的激活。而野生型1G4 TCR无此抑制作用。(高亲和力c58c61 1G4 TCR的结果见图19，野生型1G4 TCR的结果见图20)实施例11-利用高亲和力c58c61 IG4 TCR-IL-2融合蛋白的体内靶向肿瘤进行该项工作研究了实施例6所述高亲和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白能否抑制裸鼠中植入的人肿瘤细胞生长。
55只雌性裸鼠(HARLAN，法国)用于该项试验。
所有动物皮下注射人黑色素瘤肿瘤形成细胞系(SK-MEL-37)，该细胞系稳定转染了NY-ESO肽/泛素小基因构建物以确保合适的I类靶肽在细胞表面的表达增加。肿瘤在动物中生长5天以使肿瘤发育然后开始治疗。
然后给大鼠以下静脉内注射药团剂量的c58c61高亲和力NY-ESOTCR/IL-2融合蛋白剂量范围为0.02-1.0mg/kg PBS配制的高亲和力1G4 TCR/IL-2融合蛋白，在肿瘤移植5、6、7、8、11、13、17、20、24、28和30天后给予。所有实验均包括单用PBS取代TCR/IL-2免疫偶联物作治疗的对照组。
然后用卡尺测定肿瘤大小，根据下式确定肿瘤体积(W2×L)/2，其中W＝肿瘤的最短直径，L＝最长的直径。
结果TCR/IL-2免疫偶联物对肿瘤生长抑制的治疗性效果见图21。
结论如图21所述的肿瘤生长曲线所示，TCR/IL-2免疫偶联物显示了明显的剂量依赖性抗肿瘤作用。
实施例12-用高亲和力c58c61 1G4 TCR进行荧光显微术定量测定细胞表面TCR配体用高亲和力c58c61 1G4 TCR通过单分子荧光显微术定量测定了癌细胞(Mel 526、Mel 624和SK-Mel-37细胞系)上SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原的数目(假定一种荧光信号与和靶细胞表面同源pMHC配体相结合的一种标记的TCR相关)。利用生物素化TCR靶向表达抗原的癌细胞以及随后用链霉亲和素-R藻红蛋白(PE)偶联物标记结合细胞的TCR有助于该定量测定。然后通过三维荧光显微术拍摄各种PE分子图像。
粘附细胞的染色。将癌细胞接种入含小室孔的载玻片(chamber wellslide)上，在培育箱中粘附过夜(37℃，5％CO2)。除去培养液换以新鲜的R10。除去培养液，用补加了400μM MgCl2的500μl PBS(PBS/Mg)洗涤细胞二次。细胞于4℃在200μl TCR溶液(含有0.5％BSA白蛋白的PBS/Mg配制的5μg/ml高亲和力c58c61 1G4 TCR，或5μg/ml“无关的”HLA-A2-tax肽特异性高亲和力TCR)中培育30分钟。除去TCR溶液，用500μl PBS/Mg洗涤细胞三次。细胞于室温在200μl链霉亲和素-PE溶液中(含有0.5％BSA的PBS/Mg配制的5μg/ml链霉亲和素-PE)黑暗培育20分钟。除去链霉亲和素-PE溶液，用500μl PBS/Mg洗涤细胞5次。除去洗涤培养液，将细胞维持在400μl摄像培养液中，然后通过荧光显微术摄像。
荧光显微术。用配有63×油镜(Zeiss)的Axiovert 200M(Zeiss)显微镜进行荧光显微术。装有300W氙弧光灯(Sutter)的λLS光源用于照明，在光路中放置0.3到0.6的中性密度滤光片(neutral density filter)将光强度降低至最佳水平。用TRITC/DiI滤光片组(filter set)(Chroma)分开激发和发射光光谱。通过z-层(stack)采样(21个平面，间隔1μm)三维摄像细胞。如(Irvine等，Nature，(419)，第845-9页和Purbhoo等，Nature Immunology，(5)，第524-30页)所述用Metamorph软件(通用成像)进行图像采集和分析。
结果如图22所示，用以上方法成功地拍摄到与Mel 526、Mel 624和SK-Mel-37癌细胞表面SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原相结合的高亲和力1G4 TCR的图像。
权利要求
1.一种T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体对SLLMWITQC-HLA-A*0201具有结合特性并含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，其特征在于，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于1μM和/或对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的解离速率(koff)为1×10-3S-1或更慢。
2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR同时含有α链可变区和TCRβ链可变区。
3.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αα或ββ同源二聚体。
4.如以上权利要求中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述KD和/或koff通过表面等离振子共振测定。
5.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，与天然1G4TCRα链可变区(SEQ ID No1)和/或β链可变区(SEQ ID NO2)相比，所述TCR在至少一个互补决定区中发生了突变。
6.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，与天然1G4TCRα链可变区(SEQ ID No1)和/或β链可变区(SEQ ID NO2)相比，所述TCR在其至少一个可变区的框架区中发生了突变。
7.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNO1所示编号的以下一个或多个α链可变区氨基酸发生了突变20V、51Q、52S、53S、94P、95T、96S、97G、98G、99S、100Y、101I和103T。
8.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNO2所示编号的以下一个或多个β链可变区氨基酸发生了突变18M、50G、51A、52G、53I、55D、56Q、70T、94Y、95V和97N。
9.如权利要求1到6中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR中含有采用SEQ ID NO1所示编号的一个或多个α链可变区氨基酸20A、51P、51S、51T、51M、52P、52F、52G、53W、53H、53T、94H、94A、95L、95M、95A、95Q、95Y、95E、95I、95F、95V、95N、95G、95S、95R、95D、96L、96T、96Y、96I、96Q、96V、96E、96X、96A、96W、96R、96G、96H、96K、96D、97D、97N、97V、97S、97A、97T、98P、98H、98S、98T、98W、98A、99T、99Y、99D、99H、99V、99N、99E、99G、99Q、99K、99A、99I、99R、100F、100M、100D、101P、101T、101M或103A。
10.如权利要求1到6或9中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR中含有采用SEQ ID NO2所示编号的一个或多个β链可变区氨基酸18V、50S、50A、51V、51I、52Q、53T、53M、55R、56R、70I、94N或94F、95L、97G或97D。
11.如权利要求1到6中任一项所述的TCR，所述TCR包含(SEQ ID No11到83)所示α链可变区氨基酸序列之一，所述TCR任选含有一个或多个表型沉默取代。
12.如权利要求1到6或11中任一项所述的TCR，所述TCR包含(SEQID No84到99，或117到121)所示的β链可变区氨基酸序列之一，所述TCR任选含有一个或多个表型沉默取代。
13.如权利要求2所述的TCR，所述TCR包含下表所示的α和β链可变区配对物，所述TCR任选含有一个或多个表型沉默取代
14.如权利要求2所述的TCR，所述TCR包含SEQ ID NO49所示α链可变区和SEQ ID NO94所示β链可变区，所述TCR任选含有一个或多个表型沉默取代。
15.如以上任一项权利要求所述的TCR，所述TCR还包含SEQ ID NO100所示α链恒定区氨基酸序列和/或SEQ ID NO101和102所示β链氨基酸恒定区序列之一，所述TCR任选含有一个或多个表型沉默取代。
16.如以上任一项权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR是二聚体T细胞受体(dTCR)或单链T细胞受体(scTCR)。
17.如权利要求4到16中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的scTCR由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。
18.如权利要求4到16中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的scTCR由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。
19.如权利要求17或18所述的TCR，其特征在于，所述TCR在第一和第二链之间还含有二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，该接头序列的长度和该二硫键的位置使第一和第二区段的可变区序列的相互取向基本上如天然αβT细胞受体中那样。
20.如权利要求17到19中任一项所述的scTCR，其特征在于，在连接部分中，接头序列连接该第一区段C末端和该第二区段N末端。
21.如权利要求17到20中任一项所述的scTCR，其特征在于，在结合部分中，接头序列如下式所示-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO103)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ ID NO104)，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。
22.如权利要求1、2或4到6中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的dTCR第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，和第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键相连。
23.如权利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫键连接所述恒定区序列的氨基酸残基，所述二硫键在天然TCR中无等价物。
24.如权利要求23所述的TCR，其特征在于，所述二二硫键位于对应于天然TCR中β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸残基的半胱氨酸残基之间。
25.如权利要求23所述的TCR，其特征在于，所述二硫键位于取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57或它们的非人等价物的半胱氨酸残基之间。
26.如权利要求16到25中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR的结合部分在与天然TCR中通过二硫键连接的残基相对应的残基之间含有二硫键。
27.如权利要求14到24中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR结合部分不含与天然TCR的跨膜或胞质序列相对应的序列。
28.一种可溶性TCR，所述可溶性TCR由SEQ ID NO122的α链氨基酸序列和SEQ ID NO123的β链氨基酸序列构成。
29.一种可溶性TCR，所述可溶性TCR由SEQ ID NO122的α链氨基酸序列和SEQ ID NO124的β链氨基酸序列构成。
30.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，该TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。
31.如权利要求30所述的TCR，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链与所述TCR共价相连。
32.如权利要求30或31所述的TCR，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位。
33.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR在其α或β链的C末端或N-末端还包含反应活性半胱氨酸。
34.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR与治疗性药物或可检测部分结合。
35.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述TCR与治疗性药物或可检测部分共价相连。
36.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述治疗性药物或可检测部分与一条或两条TCR链共价相连。
37.如权利要求34到36中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR与是免疫效应分子的治疗性药物结合。
38.如权利要求37所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是细胞因子。
39.如权利要求37所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是IL-2，或其功能性变体或片段。
40.如权利要求34到36中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗性药物是细胞毒性药物。
41.如权利要求34到36中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗性药物是放射性核素。
42.一种多价TCR复合物，所述多价TCR复合物含有至少两个如以上权利要求中任一项所述的TCR。
43.一种多价TCR复合物，所述多价TCR复合物含有至少两个如以上权利要求中任一项所述的TCR并通过非肽聚合物链或肽接头序列相连。
44.如权利要求43所述的TCR复合物，其特征在于，该聚合物链或肽接头序列延伸在各TCR中不位于TCR可变区序列中的氨基酸残基之间。
45.如权利要求43或44中任一项所述的TCR复合物，其特征在于，所述TCR通过聚亚烷基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头相连。
46.如权利要求45所述的TCR复合物，其特征在于，二价亚烷基间隔基团位于所述聚亚烷基二醇链和其与该复合物的TCR连接点之间。
47.如权利要求43或44所述的TCR复合物，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位。
48.一种多价TCR复合物，所述多价TCR复合物含有至少两个如权利要求1到33中任一项所述的TCR，其中，(i)至少一个所述TCR如权利要求31到38中任一项所述地与治疗性药物结合。
49.一种分离的细胞，所述分离的细胞呈递如权利要求1到26中任一项所述TCR。
50.一种药物组合物，所述药物组合物含有如权利要求1到48中任一项所述的TCR或多价TCR复合物，或含有如权利要求49所述多个细胞，以及药学上可接受的运载体。
51.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予患这种癌症的对象有效量的权利要求1到48中任一项所述的TCR或多价TCR复合物，或给予权利要求49所述多个细胞。
52.权利要求1到48中任一项所述的TCR或多价TCR复合物，或权利要求49所述多个细胞在制备治疗癌症的组合物中的用途。
53.一种制备对SLLMWITQC-HLA-A*0201具有结合特性的高亲和性TCR的方法，其特征在于，该TCR(i)含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，和(ii)对所述SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的KD小于1μM和/或对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的解离速率(koff)低于1×10-3，所述方法包括(a)制备含有1G4 TCR的α和β链可变区的TCR，其中α和β链可变区的一个或两个在权利要求7和8所鉴定的一个或多个氨基酸中含有突变；(b)在适合于TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201结合的条件下使所述突变的TCR与SLLMWITQC-HLA-A*0201接触；并测定该相互作用的KD和/或koff。
全文摘要
本发明提供具有对SLLMWITQC－HLA－A*0201的结合特性的T细胞受体(TCR)，该SLLMWITQC肽衍生自许多癌细胞表达的NY－ESO－1蛋白。所述TCR对所述肽－HLA复合物的K
文档编号A61K38/16GK1989153SQ200580016449
公开日2007年6月27日 申请日期2005年5月18日 优先权日2004年5月19日
发明者J·M·伯尔特, B·K·雅各布森, 李懿, P·E·莫洛伊, S·M·邓恩 申请人:阿维德克斯有限公司