专利名称：作为血小板adp受体抑制剂的化合物的组合疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用化合物A和联合用药成分的组合产品在哺乳动物中预防或治疗血栓形成和与血栓形成相关疾病的方法和组合物。在更详细地描述本发明之前，对下列术语进行定义。
I.定义 需要注意，除非在文中另外明确说明，本文中和权利要求中所使用的单数形式包括复数形式。例如，在组合物中提及“可药用载体”包括两种或多种可药用载体，以此类推。
还需要注意，某些治疗成分根据其预期用途或作用机制的分类可以本领域技术人员的常用知识进行并仅用于分类目的。除非文中另外说明，声称的机制不应当用于限定治疗成分。某些治疗成分可以通过两种或多种机制起作用，或者能够用于治疗两种或多种疾病。也应当理解，在每一个类别中所给出的特定成分仅仅用于示例，不应当限定本发明的范围。
“包含”是指组合物和方法包括所述要素但是不排除其它。当用于定义组合物和方法时，“主要包含”是指排除对预期用途的组合有重要意义的其它要素。因此，主要包含本文中所定义的要素的组合物不排除由分离和纯化方法所产生的痕量杂质和可药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”是指不仅仅排除其它成分的痕量残留和给予本发明组合物的主要方法步骤。通过每一个这些过渡术语所定义的实施方案均在本发明的范围内。
术语“治疗”是指对个体例如哺乳动物中疾病或病症的任何治疗，包括1)对疾病或病症的预防或防御，即使得临床症状不再发展；2)抑制疾病或病症，即阻止或压制临床症状的发展；和/或3)消除疾病或病症，即使得临床症状减退。
本文中使用的术语“预防”是指对有需要的患者的预防性治疗。预防性治疗可以通过给处于患病风险的个体提供适当量的治疗成分而完成，从而基本上避免疾病的发作。
本领域技术人员可以理解，在人用药中，并不总是能够区分“预防”或“防止”，因为最终的诱发事件可能是未知的、潜在的，或者直到事件发生后很久患者尚不清楚。因此，本文中使用的术语“预防”应当作为“治疗”的要素，包括本文中所定义的“防止”或“抑制”。本文中使用的术语“保护”是指包括“预防”。
术语“哺乳动物”包括但不限于人类、猴、兔、鼠、家畜(例如犬和猫)、农场动物(例如牛、马或猪)和实验室动物。
术语“病症”是指采用本发明方法和组合物对抗的疾病状态。
本文中使用的术语“血栓形成和与血栓形成相关的病症”可以是下列任何一种(但不限于)任何血栓形成(特别是血小板依赖型血栓形成指征)，包括但不限于急性心肌梗塞、不稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、短暂性脑缺血发作、中风、外周血管病、先兆子痫/子痫、深部静脉血栓形成、栓塞、弥散性血管内凝血和血栓性血小板减少性紫癜、侵入性操作后血栓形成性和再狭窄性并发症，所述侵入性操作例如血管成形术、颈动脉内膜切除术、CABG(冠状动脉旁路移植)手术后、血管移植、支架放置以及血管内装置和假体的植入，还包括与遗传性易患病体质或癌症有关的高凝状态。
“[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲”或“化合物A”是指具有下列结构的化合物及其互变异构体
“治疗有效量”是指化合物A或本发明的联合给药成分的量，当其联合给药时该量能够有效治疗靶疾病或病症。治疗有效量取决于特定组合、个体和待治疗的疾病病症、个体的体重和年龄、疾病状态的严重性、采用的治疗方案、给药的时间选择、给药的方式等，所有这些都可以由本领域技术人员容易地确定。
在某些实施方案中，可以预期，治疗有效量的化合物A或在组合中联合给药的成分可以小于其作为单一成分使用时各自的有效量。在此情况下，治疗有效量是指“亚治疗量”。因此，术语“亚治疗量”是指低于治疗成分作为单一成分使用时的最佳剂量的剂量，但是当以本文中所述的组合产品使用时它可以提供治疗效果。
“抗凝剂”是能够防止血块形成的成分。抗凝剂的实例包括但不限于凝血酶、因子IXa、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XIIa或因子VIIa的特异性抑制剂，肝素及其衍生物，维生素K拮抗剂和抗组织因子以及P-选择素和PSGL-1的抑制剂。凝血酶的特异性抑制剂的实例包括水蛭素、比伐卢定(Angiomax
)、阿加曲班、希美加群(ximelagatran)(Exanta
，参见下面结构)、达比加群(参见下面结构)、AZD0837(在口服直接凝血酶抑制剂AZD0837的对照、随机、平行、多中心可行性研究临床试验A中进行了研究，以ER制剂给药，预防房颤患者中风和心脏收缩栓塞事件，所述患者适合但是不能/不愿意采用美国临床试验标识(ClincalTrials.govIdentifier)为NCT00623779的VKA疗法)、RB2006(单股核酸适体，由Regado Biosciences，Durham，NC提供，描述于Dyke，C.K.等，采用RNA适体技术进行的解毒剂对照的抗凝剂的首次人类实验(First-in-HumanExperience of an Antidote-Controlled Anticoagulant Using RNA AptamerTechnology)，Circulation 2006；1142490-2497)和重组水蛭素(lepiru din)(Reflu dan
)。肝素及其衍生物的实例包括普通肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)，例如依诺肝素(Lovenox
)、达肝素(法安明
)和达那肝素(Orgaran
)；和合成的五糖，例如磺达肝癸(Fondaparinux)(Arixtra
)、依达肝素和生物素化的依达肝素。维生素K拮抗剂的实例包括华法林(Coumadin
)、phenocoumarol、醋硝香豆素(Sintrom
)、氯茚二酮(clorindione)、双香豆素、二苯茚酮、双香豆素乙酯、苯丙香豆素、苯茚二酮和噻氯香豆醇(tioclomarol)。
术语“因子Xa抑制剂”是指在体外和/或体内能够抑制催化凝血酶原向凝血酶转化的凝血因子Xa活性的化合物。因子Xa是凝血途径中的酶，是凝血酶原复合物中的活性成分，它能够催化凝血酶原向凝血酶的转化。凝血酶使得血纤维蛋白原向纤维蛋白转化，导致血块的形成。因此，因子Xa的抑制有可能是治疗和预防血栓性疾病的有效策略。优选的因子Xa抑制剂能够在体外和体内抑制凝血酶的形成。更优选的因子Xa抑制剂显示体内的抗凝效能。术语“因子Xa的特异性抑制剂”是指在相同哺乳动物中对抗因子Xa较对抗其它酶或受体具有明显较高的抑制活性的因子Xa抑制剂。优选，特异性因子Xa抑制剂在其治疗有效浓度的情况下在相同的哺乳动物系统中对其它酶或受体不具有明显的已知抑制活性。
已知的因子Xa抑制剂的实例包括但不限于磺达肝癸、依达肝素、生物素化的依达肝素、依诺肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、组织因子通道抑制剂、LY517717(由Eli Lilly & Co.，Indianapolis，Indiana，USA提供，结构为N-{(1R)-2-[4-(1-甲基-4-哌啶基)-1-哌嗪基]-2-氧代-1-苯基乙基}-1H-吲哚-6-甲酰胺，参见例如用于髋关节和膝关节置换后静脉血栓栓塞预防的口服因子Xa抑制剂LY517717的第二阶段研究(A Phase II Study of theOral Factor Xa Inhibitor LY517717 for the Prevention of VenousThromboembolism after Hip or Knee Replacement)，Agnelli G.等，J.Thromb.Haemost.2007，5(4)746-53，在临床试验中，例如口服抗凝剂LY517717二富马酸盐与皮下用依诺肝素用于预防全髋关节置换(THR)术后和全膝关节置换(TKR)术后静脉血栓栓塞事件(VTE)的比较研究(AComparison of the Oral Anticoagulant LY517717 Difumarate toSubcutaneous Enoxaparin for the Prevention of Venous ThromboembolicEvents(VTE)Post-Total Hip Replacement(THR)and Post-Total KneeReplacementy(TKR)Surgery)，采用美国临床试验标识NCT00074828)、YM-150(参见例如Eriksson，B.I.等，J.Thromb.Haemost.2007，51660-65和临床试验中的研究例如用于预防选择性全髋关节置换患者的静脉血栓栓塞的直接因子Xa抑制剂YM150(Direct Factor Xa Inhibitor YM150 forPrevention of Venous Thromboembolism in Patients Undergoing ElectiveTotal Hip Replacement)。采用开放标签的依诺肝素与美国临床试验标识NCT00353678进行对比的双盲、平行、剂量确定研究)、Daiichi DU-176b(参见例如E.Hylek，DU-176b，一种口服、直接因子Xa拮抗剂(An Oral，Direct Factor Xa Antagonist)，Current Opinion in Investigational Drugs2007 8778-783，在临床试验中进行了研究，例如，在选择性单侧全髋关节置换患者中，进行了IIb阶段、随机、平行组、双盲、双模拟、多中心、多种族、多剂量的DU-176b与达肝素对比的临床研究，采用美国临床试验标识NCT00398216)、倍曲沙班(如下所示)和表1中所示化合物及其衍生物。
表1
术语“[2-({4-[(二甲基氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯代(2-吡啶基))甲酰胺”是指具有下列结构的化合物或其互变异构体，本文中也称为倍曲沙班
倍曲沙班 倍曲沙班描述于美国专利申请公开US2007/0112039中，它要求于2005年11月8日提交的美国临时申请序列号60/735,224的权益，其全部内容在此引入作为参考。倍曲沙班也已知为因子Xa的特异性抑制剂。
术语“因子XI抑制剂”是指能够抑制凝血因子XI的化合物。当被水解蛋白激活后，因子XI转化为活性酶因子XIa，它将因子IX裂解为因子IXa。然后，因子IXa将因子X水解为因子Xa，它能够启动导致如上所述的血块形成的凝血反应。抗因子XI抗体是由免疫响应所产生的蛋白，它能够特异性地与因子XI结合，从而抑制其活性。某些抗因子XI抗体能够获自商业，例如Haematologic Technologies，Essex Junction，VT，USA。
“注射用抗凝剂”是可以通过注射给药于哺乳动物的抗凝剂。注射用抗凝剂的实例为普通肝素、低分子量肝素和合成的五糖。
“抗血小板药物”是能够通过阻止血小板聚集而阻断血块形成的成分。根据其活性，有多类抗血小板药物，包括GP IIb/IIIa拮抗剂，例如阿昔单抗(ReoPro
)、依非巴特(Integrilin
)和替罗非班(Aggrastat
)；P2Y12受体拮抗剂，例如氯吡格雷(Plavix
)、噻氯匹定(Ticlid
)、cangrelor、替卡格雷和普拉格雷；磷酸二酯酶III(PDE III)抑制剂，例如西洛它唑(Pletal
)、双嘧达莫(Persantine
)和Aggrenox
(阿司匹林/缓释双嘧达莫)；血栓素合酶(thromboxane synthase)抑制剂，例如呋格雷酸、奥扎格雷、利多格雷和伊波格雷；血栓素A2受体拮抗剂(TP拮抗剂)，例如伊非曲班、雷马曲班、特波格雷、(3-{6-[(4-氯代苯基磺酰基)氨基]-2-甲基-5，6，7，8-四氢萘-1-基}丙酸(也称为Servier S 18886，由de Recherches InternationalesServier，Courbevoie，法国提供)；凝血酶受体拮抗剂，例如SCH530348(化学名为(1R，3aR，4aR，6R，8aR，9S，9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2，3-C]呋喃-6-基氨基甲酸乙酯，由Schering Plough Corp.，新泽西，USA提供，描述于US20040192753A1和US2004/0176418A1，在临床试验中进行研究，例如在非急诊经皮冠脉介入患者中进行的多中心、随机、双盲、安慰剂对照研究，对SCH 530348的安全性进行评价，美国临床试验标识NCT00132912)；P-选择素抑制剂，例如2-(4-氯代苄基)-3-羟基-7，8，9，10-四氢苯并[H]喹啉-4-甲酸(也称为PSI-697，由惠氏，新泽西，USA提供)；非甾体抗炎药(NSAIDS)，例如乙酰水杨酸(Aspirin
)、白藜芦醇(resveratrol)、布洛芬(Advil
、Motrin
)、萘普生(Aleve
、Naprosyn
)、舒林酸(Clinoril
)、吲哚美辛(Indocin
)、mefenamate、屈昔康、双氯芬酸(Cataflam
、Voltaren
)、磺吡酮(Anturane
)和吡罗昔康(Feldene
)。在NSAIDS中，优选乙酰水杨酸(ASA)、白藜芦醇和吡罗昔康。某些NSAIDS能够同时抑制环氧酶-1(cox-1)和环氧酶-2(cox-2)，例如阿司匹林和布洛芬。某些能够选择性抑制cox-1，例如白藜芦醇，它是可逆的cox-1抑制剂，只能微弱地抑制cox-2。后面描述的β阻滞剂和钙通道阻滞剂也具有血小板抑制作用。
术语“可药用盐”是指包括根据本文所述特定治疗成分上存在的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明所述治疗成分包含相对酸性的官能团时，可以通过使该类化合物的中性形式与足够量的所需碱接触来获得碱加成盐，可以不使用溶剂或在适宜的惰性溶剂中进行所述接触。由可药用的无机碱衍生的盐的实例包括铝、铵、钙、铜、三价铁、二价铁、锂、镁、三价锰、二价锰、钾、钠、锌等。由可药用的有机碱衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N’-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本发明所述治疗成分包含相对碱性的官能团时，可以通过使该类化合物的中性形式与足够量的所需酸接触来获得酸加成盐，可以不使用溶剂或在适宜的惰性溶剂中进行所述接触。可药用的酸加成盐包括那些衍生自下列无机酸的盐盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢盐、磷酸、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硫酸、硫酸一氢盐、氢碘酸或亚磷酸等，还包括那些衍生自下列的相对无毒的有机酸的盐乙酸、丙酸、异丁酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，如精氨酸盐等，还包括有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸(galactunoric acids)等的盐(参见例如Berge，S.M.等人，“药用盐(Pharmaceutical Salts)”，Journal ofPharmaceutical Science，1977，661-19)。某些具体治疗成分既包括碱性官能团又包括酸性官能团，这使得该化合物既可以被转化成碱加成盐，又可以被转化成酸加成盐。
化合物A的某些优选的盐形式描述于于2006年11月3日提交的美国专利申请公开US 2007/0123547，发明名称为“[4-(6-卤代-7-取代的-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲及其相关形式和方法”，要求于2005年11月3日提交的临时申请60/733,650的优先权，以上两个专利均以其全部内容在此引入作为参考。优选，化合物A形成钾盐(式I)
或形成钠盐(式II)
钾盐式I和钠盐式II的多种结晶固体形式或无定形形式也描述于美国专利申请公开US 2007/0123547。钾盐式I的某些优选的结晶固体形式具有至少一种下列特征(1)红外光谱在约3389cm-1和约1698cm-1处有峰；(2)X-射线粉末衍射图谱在约9.5和约25.5°2θ处有峰；和(3)DSC最大吸热于约246℃。在这些形式中，某些的红外光谱包含的吸收峰位于约3559，3389，3324，1698，1623，1563，1510，1448，1431，1403，1383，1308，1269，1206，1174，1123，1091，1072，1030，987，939，909，871，842，787，780，769，747，718，701，690和667cm-1。钾盐式I的其它优选的结晶固体形式具有至少一种下列特征(1)红外光谱在约3327cm-1和约1630cm-1处有峰；(2)X-射线粉末衍射图谱在约20.3和约25.1°2θ处有峰；和(3)DSC DSC最大吸热于约293℃。在这些形式中，某些的红外光谱包含的吸收峰位于约3584，3327，3189，2935，2257，2067，1979，1903，1703，1654，1630，1590，1557，1512，1444，1429，1406，1375，1317，1346，1317，1288，1276，1243，1217，1182，1133，1182，1133，1093，1072，1033，987，943，907，883，845，831，805，776，727，694和674cm-1。钠盐式II的某些优选的无定形形式具有至少一种下列特征(1)红外光谱在约3360，1711，1632，1512，1227，1133和770cm-1；和(2)X-射线粉末衍射图谱包含的宽峰主要在约15和约30°2θ之间。在这些形式中，某些的红外光谱包含的吸收峰位于约3360，1711，1632，1556，1512，1445，1407，1375，1309，1280，1227，1133，1092，1032，987，905，781，770和691cm-1。
倍曲沙班的某些优选的盐公开于美国专利申请公开US2007/0112039。特别的是，该申请公开了倍曲沙班与酸形成盐。所述酸优选选自盐酸、乳酸、马来酸、苯氧乙酸、丙酸、琥珀酸、己二酸、抗坏血酸、樟脑酸、葡糖酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、富马酸、乙醇酸、萘-1，5-二磺酸、龙胆酸和苯磺酸。优选所述酸选自盐酸、乳酸、马来酸、苯氧乙酸、丙酸和琥珀酸。最优选所述酸为马来酸，形成倍曲沙班的马来酸盐。倍曲沙班的马来酸盐的一个实施方案如式III所示
式III的其它盐可以以结晶多晶型物存在，公开于美国专利申请公开US2007/0112039。式III的一种结晶多晶型的粉末X-射线衍射图谱具有至少4个并优选8个下列近似特征峰位4.9，9.7，13.8，14.1，15.2，17.6，18.5，20.8，21.6，22.7，24.1，26.3，26.8度2θ。在更优选的结晶多晶型中，粉末X-射线衍射图谱的近似特征峰位为4.9，9.7，11.8，13.8，14.1，15.2，17.6，18.5，19.9，20.8，21.6，22.7，24.1，25.0，26.3，26.8度2θ。
通过使得盐与碱或酸接触，然后根据常规方法分离母体治疗成分，可以再生治疗成分的中性形式。治疗成分的母体形式在某些物理特性方面不同于其各种盐形式，例如在极性溶剂中的溶解度不同，但是对于本发明的目的而言，盐等同于化合物的母体形式。
除盐形式外，某些治疗成分为前体药物形式。治疗成分的前体药物是在生理条件下易于经过化学变化从而提供具有治疗活性的化合物的那些化合物。此外，在体外环境中，前体药物也可以通过化学或生物化学方法被转化成活性化合物。例如，当与适宜的酶或化学试剂一起被置于经皮贴剂储库中时，前体药物可以被缓慢转化成本发明中所述的活性化合物。
某些治疗成分可以以未被溶剂化的形式以及溶剂化的形式(包括水合物形式)存在。一般而言，溶剂化的形式等同于未被溶剂化的形式，都包含在本发明的范围中。某些治疗成分可以以多种结晶或无定形形式存在。一般而言，对于本发明的应用而言，所有的物理形式都是等同的并且都包含在本发明的范围内。
“可药用载体”是指可以在本发明组合物中使用的任何稀释剂、赋形剂或载体。可药用载体包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸精蛋白)、磷酸氢钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯类、蜡类、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。适当的可药用载体描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，这是一本本领域中的标准参考书。它们优选根据预期的给药形式(即口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆剂等)进行选择并与常规药学实践一致。
II.实施方案 a.治疗方法 本发明提供了在哺乳动物中治疗以不受欢迎的血栓形成为特征的病症的新方法，它包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列治疗成分 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)选自抗凝剂、抗血小板药物或其组合的第二种治疗成分。
一方面，本发明提供了在哺乳动物中预防或治疗血栓形成和/或与血栓形成相关的病症的新方法，它包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列两种治疗成分 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)抗凝剂。
在某些实施方案中，抗凝剂为因子Xa的抑制剂。在某些实施方案中，所述因子Xa抑制剂为特异性因子Xa抑制剂。
在某些实施方案中，所述因子Xa抑制剂为YM-150、Daiichi DU-176b、LY517717或选自表1的化合物。
在某些实施方案中，所述因子Xa抑制剂为利伐沙班(rivaroxaban)。
在某些实施方案中，因子Xa的特异性抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。在某些实施方案中，倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐盐。
在另一个实施方案中，抗凝剂选自凝血酶因子IXa、因子XI、因子XIa或因子VIIa的特异性抑制剂。在某些实施方案中，抗凝剂选自比伐卢定、阿加曲班、水蛭素、华法林、希美加群、AZD0837、RB2006、达比加群和phenocoumarol。
在另一个实施方案中，抗凝剂为注射用抗凝剂。在某些实施方案中，抗凝剂选自合成的五糖类和低分子量肝素。在某些实施方案中，抗凝剂选自磺达肝癸、达那肝素、依诺肝素、达肝素和普通肝素。
在另一个实施方案中，抗凝剂为抗因子XI抗体。在另一个实施方案中，抗凝剂为比伐卢定。
另一方面，本发明提供了在哺乳动物中治疗以不受欢迎的血栓形成为特征的病症的方法，它包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列两种治疗成分 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)其它抗血小板药物。
在某些实施方案中，抗血小板药物为TP受体的拮抗剂。在某些实施方案中，TP受体的拮抗剂为伊非曲班。在另一个实施方案中，抗血小板药物为环氧酶抑制剂。在某些实施方案中，环氧酶抑制剂为乙酰水杨酸。在某些实施方案中，抗血小板药物为可逆的环氧酶-1抑制剂。在某些实施方案中，可逆的环氧酶-1抑制剂为白藜芦醇。
在某些实施方案中，其它抗血小板药物选自阿昔单抗、依非巴特、替罗非班、双嘧达莫、阿司匹林和缓释双嘧达制剂(aggrenox)、西洛它唑、伊波格雷、呋格雷酸和奥扎格雷。
在某些实施方案中，治疗成分中至少一种以亚治疗剂量给药。
在某些实施方案中，两种治疗成分均以亚治疗剂量给药。
在某些实施方案中，两种治疗成分同时给药。
在某些实施方案中，两种治疗成分按顺序给药。
另一方面，本发明提供了在哺乳动物中预防或治疗血栓形成和/或与血栓形成相关的病症的方法，它包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列三种治疗成分 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐； (2)其它抗血小板药物；和 (3)抗凝剂。
在某些实施方案中，抗血小板药物为环氧酶抑制剂。在某些实施方案中，抗血小板药物为乙酰水杨酸。在另一个实施方案中，抗血小板药物为TP受体拮抗剂。在某些实施方案中，它为伊非曲班。在某些实施方案中，抗凝剂为因子Xa抑制剂。在某些实施方案中，它为倍曲沙班。
在某些实施方案中，治疗成分中至少一种以亚治疗剂量给药。在某些实施方案中，所有治疗成分均以亚治疗剂量给药。
在某些实施方案中，三种治疗成分同时给药。在某些实施方案中，三种治疗成分顺序给药。
在某些实施方案中，[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用的盐为钾盐。
在某些实施方案中，[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用的盐为钠盐。
在某些实施方案中，与血栓形成相关的病症选自急性心肌梗塞、不稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、短暂性脑缺血发作、中风、外周血管病、先兆子痫/子痫、深部静脉血栓形成、栓塞、弥散性血管内凝血和血栓性血小板减少性紫癜、下列侵入性操作导致的血栓形成性和再狭窄性并发症血管成形术、颈动脉内膜切除术、CABG(冠状动脉旁路移植)手术后、血管移植、支架放置以及血管内装置和假体的植入。
b.药用组合物 本发明也提供了药用组合物，它包含可药用载体、[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐和至少另一种选自抗凝剂、抗血小板药物及其组合的治疗成分。
一方面，本发明提供了药用组合物，它包含下列两种治疗成分和可药用载体 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)抗凝剂。
在某些实施方案中，抗凝剂为因子Xa抑制剂。
在某些实施方案中，因子Xa抑制剂为特异性因子Xa抑制剂。
在某些实施方案中，因子Xa抑制剂为YM-150、Daiichi DU-176b、LY517717或选自表1的化合物。
在某些实施方案中，因子Xa抑制剂为利伐沙班。
在某些实施方案中，特异性因子Xa抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。在某些实施方案中，倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐盐。
在另一个实施方案中，抗凝剂选自凝血酶，因子IXa、因子XI、因子XIa或因子VIIa的特异性抑制剂。在某些实施方案中，抗凝剂选自比伐卢定、阿加曲班、水蛭素、华法林和phenocoumarol。
在另一个实施方案中，抗凝剂为注射用抗凝剂。
在某些实施方案中，抗凝剂选自合成的五糖类和低分子量肝素。
在某些实施方案中，抗凝剂选自磺达肝癸、达那肝素、依诺肝素、达肝素和普通肝素。
在另一个实施方案中，抗凝剂为因子XI的抑制剂。在某些实施方案中，因子XI抑制剂为抗因子XI抗体。
在另一个实施方案中，抗凝剂为比伐卢定。
在某些实施方案中，抗凝剂为希美加群、AZD0837或达比加群。
另一方面，本发明提供了药用组合物，它包含下列两种治疗成分和可药用载体 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)其它抗血小板药物。
在某些实施方案中，抗血小板药物为TP受体拮抗剂。在某些实施方案中，TP受体拮抗剂为伊非曲班。
在另一个实施方案中，抗血小板药物为环氧酶抑制剂。在某些实施方案中，环氧酶抑制剂为乙酰水杨酸。在某些实施方案中，抗血小板药物为可逆的环氧酶-1抑制剂。在某些实施方案中，可逆的环氧酶-1抑制剂为白藜芦醇。
在某些实施方案中，抗血小板药物选自阿昔单抗、依非巴特、替罗非班、双嘧达莫、阿司匹林和缓释双嘧达制剂、西洛它唑、伊波格雷、呋格雷酸和奥扎格雷。
另一方面，本发明提供了药用组合物，它包含可药用载体和下列三种治疗成分 (1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐； (2)其它抗血小板药物；和 (3)抗凝剂。
在某些实施方案中，抗血小板药物为环氧酶抑制剂。在某些实施方案中，抗血小板药物为乙酰水杨酸。在另一个实施方案中，抗血小板药物为TP受体拮抗剂。在某些实施方案中，它为伊非曲班。在某些实施方案中，抗凝剂为因子Xa抑制剂。在某些实施方案中，它为倍曲沙班。
在某些实施方案中，治疗成分中至少一种以亚治疗剂量存在。
在某些实施方案中，使用的治疗成分均以亚治疗剂量存在。
在某些实施方案中，[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用的盐为钾盐。
在某些实施方案中，[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用盐为钠盐。
c.试剂盒 本发明也提供了新的试剂盒，它包含 (1)第一个容器，其中所述第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)第二个容器，其中所述第二个容器含有选自抗凝剂、抗血小板药物及其组合的第二种治疗成分。
一方面，本发明提供了试剂盒，它包含 (1)第一个容器，其中所述第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)第二个容器，其中所述第二个容器含有抗凝剂。
另一方面，本发明提供了试剂盒，它包含 (1)第一个容器，其中所述第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和 (2)第二个容器，其中所述第二个容器含有其它抗血小板药物。
在某些实施方案中，治疗成分中至少一种以亚治疗剂量存在。
在某些实施方案中，两种治疗成分均以亚治疗剂量存在。
在某些实施方案中，试剂盒还含有包装插页，它说明两种治疗成分可以一起使用。
另一方面，本发明提供了试剂盒，它包含 (1)第一个容器，其中所述第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐； (2)第二个容器，其中所述第二个容器含有抗凝剂；和 (3)第三个容器，其中所述第三个容器含有其它抗血小板药物。
在某些实施方案中，第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲钾盐。
在某些实施方案中，第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲钠盐。
在某些实施方案中，第二个容器含有倍曲沙班或其可药用盐。
在某些实施方案中，第二个容器含有倍曲沙班马来酸盐盐。
III.联合疗法 预期化合物A与因子Xa抑制剂(例如倍曲沙班)的组合使用较两种成分单独使用能够增加额外的抗血栓作用。实施例3显示，在灌流槽实验中，向1.1μM化合物A中加入不同浓度的倍曲沙班能够以剂量响应模式提供额外的血栓形成抑制作用。同样，如实施例4所示，向固定量的倍曲沙班中加入不同量的化合物A也能够以剂量响应模式产生额外的血栓形成抑制作用。在实施例5中所示的血小板-启动的凝血酶产生实验中，获得相似的添加结果，其中化合物A和倍曲沙班的组合使用较任一种化合物单独使用提供了更强的抑制作用。
其它凝结酶抑制剂(例如因子XI抑制剂或直接凝血酶抑制剂)也可以与化合物A组合以改善抗血栓形成效能。实施例6说明，因子XI抗体与化合物A的组合在实验条件下能够抑制血栓形成，其中化合物A或因子XI抗体单独使用都不能产生可检测的血栓形成抑制。实施例7说明，在灌流实验中，化合物A与因子XI抗体的组合使用较化合物A单独使用或者较化合物A和倍曲沙班的组合使用能够产生更强的血栓形成抑制作用。实施例8说明，当化合物A与直接凝血酶抑制剂(例如比伐卢定(Angiomax
))组合使用时，可以观察到组合的抗血栓形成作用。
不仅化合物A与抗凝剂组合能够提供额外的抗血栓形成益处，也预期化合物A、通过P2Y12拮抗而作用的抗血小板药物也可以与其它类型的抗血小板药物组合产生额外的抗血栓形成益处。如实施例9和10所示，在因子Xa抑制剂存在下，当化合物A与环氧酶抑制剂(例如乙酰水杨酸(实施例9))或TP拮抗剂(例如伊非曲班(实施例10))组合使用时，可以获得额外的抗血栓形成益处。
预期采用化合物A和联合给药成分的组合产品的治疗方法不会产生超过这些成分单独使用所产生的不受欢迎的药物-药物相互作用或其它另外的副作用。优选组合产品较各成分单独使用能够改善效能和/或提高安全性，特别是当需要较小的剂量以获得治疗效果时。在此情况下，组合疗法中各成分的治疗有效量可以低于当各成分单独使用时所需要的有效或最佳量。预期较低的量可以将成分可能存在的副作用较低至最小程度，因此使得安全性得到改善。所以，组合产品优选使得所使用的治疗成分之一以亚治疗剂量存在。更优选，组合产品使得所使用的两种治疗成分均以亚治疗剂量存在。
同样，预期采用化合物A、抗凝剂和其它抗血小板药物的组合产品的治疗方法不会产生超过任何一种成分单独使用所产生的不受欢迎的药物-药物相互作用或其它额外的副作用。优选三种成分的组合产品能够提供超过任何一种成分单独使用所产生的效能或安全性。更优选组合产品使得所使用的治疗成分之一的剂量低于该治疗成分单独使用所需要的剂量，即亚治疗剂量。还更优选组合产品使得所有使用的治疗成分以亚治疗剂量使用。
化合物A和联合给药成分可以制成两种独立的药用组合物。它们可以同时给药或者以任何顺序给药。优选，当按顺序给药时，两种成分给药的时间非常接近从而可以获得需要的治疗效果。化合物A和联合给药成分也可以制成单一的药用组合物。化合物A、抗凝剂和其它抗血小板药物也可以同时给药或者以任何顺序给药。优选，当按顺序给药时，三种成分给药的时间非常接近从而可以获得需要的治疗效果。它们也可以制成单一的药用组合物，或者它们中的任何两种可以制成单一的药用组合物。
含有有效量的任何上述剂型均在常规实验的范围内，也都包含在本发明的范围内。治疗有效剂量取决于给药途径和剂型。本发明优选的组合产品为具有高治疗指数的制剂。治疗指数是指毒性作用和治疗作用之间的剂量比，可以以LD50和ED50之间的比表示。LD50为种群死亡达50％时的剂量，ED50是50％的种群有治疗效果的剂量。LD50和ED50可以通过标准药学方法在动物细胞培养或实验动物中进行测定。本发明的联合疗法可以每日给药一次或数次，也可以采用其它剂量方案。优选，本发明的联合疗法可以以单次日剂量给药，或者每天给药2次、3次或4次。更优选，本发明的联合疗法每日给药一次或二次。
通常，根据公认的药学实践的要求，将约0.5至约500mg化合物A或化合物A的盐或盐混合物与生理学上可接受的赋形剂、载体、辅料、粘合剂、防腐剂、稳定剂、染料、矫味剂混合。一方面，将化合物A制备为适用于静脉给药的制剂。在某些实施方案中，静脉制剂的单位剂量含有1-50mg的化合物A或其可药用的盐。在另一个实施方案中，单位剂量含有5至40mg、10至30mg、15至25mg、25至45mg或约20mg、30、40或50mg的化合物A或其盐。
另一方面，可以将化合物A制成适用于口服给药的制剂。在某些实施方案中，组合物的单位剂量含有1至800mg、20至200mg、50至150mg、10至50mg或20至40mg的化合物A或其盐。在某些实施方案中，组合物为单位剂型，含有约30、50、75、100、125、150、175或200mg化合物A或其盐。
当化合物A和联合给药成分制成单一药用组合物时，可以将约0.5至500mg的联合给药成分加至上述组合物中。优选，当化合物A和其它成分制成静脉制剂时，化合物A或其盐在其中的量为1至50mg、5至40mg、10至30mg、15至25mg、25至45mg或约20mg、30、40或50mg。当化合物A和其它成分制成口服制剂时，化合物A或其盐的量为1至800mg、20至200mg、50至150mg、10至50mg或20至40mg，或为约30、50、75、100、125、150、175或200mg。在含有化合物A和倍曲沙班的组合产品中，根据公认的药学实践的要求，可以将化合物A或者化合物A的盐或盐混合物的任何上述单位剂量和约0.5至500mg的倍曲沙班或者倍曲沙班的盐或盐混合物与生理学上可接受的赋形剂、载体、辅料、粘合剂、防腐剂、稳定剂、染料、矫味剂等混合。在这些组合物中的活性成分的量应当为获得位于所示范围内的适宜剂量的量。
预期联合疗法中化合物A的典型剂量范围为约0.001mg/kg至约100mg/kg，优选约0.01mg/kg至约11.4mg/kg，更优选约0.01mg/kg至约2.85mg/kg，甚至更优选约0.01mg/kg至约1.43mg/kg。在含有化合物A和倍曲沙班的组合疗法中，预期倍曲沙班的典型剂量范围为约0.001mg/kg至约1000mg/kg，优选约0.01mg/kg至约2.0mg/kg，更优选约0.1mg/kg至约1.5mg/kg或约0.4mg/kg至约1.2mg/kg，甚至更优选约0.5mg/kg至约1.0mg/kg。还更优选，组合产品中倍曲沙班的剂量低于0.5mg/kg。
当作为单一成分使用时，本文中所述的其它联合给药成分的典型剂量是本领域技术人员所熟知的。当在组合产品中与化合物A一起使用时，预期这些成分的剂量不会超过各个成分的最大剂量。优选联合疗法中的剂量低于最大剂量，更优选联合疗法中的剂量为亚治疗剂量。预期可以对剂量进行调整从而反映出联合疗法所获得的提高的疗效，这可以由本领域技术人员根据本文中所给出的信息进行判断。
IV.组合物 本发明还提供了新的组合物，它包含化合物A或其可药用盐、抗凝剂或其它抗血小板药物和可药用载体。
本发明的药用组合物可以根据本领域中众所周知的方法生产，其中例如常规的制粒、混合、溶解、包衣、冷冻干燥或乳化方法。组合物可以生产为各种形式，包括颗粒剂、沉淀物或颗粒物、粉末(包括冻干粉、旋转蒸发干燥粉或喷雾干燥粉)、无定形粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬液或溶液。制剂可以任选含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度改善剂和这些添加剂的组合。
药物制剂可以采用无菌液体例如油、水、醇及其组合制备为液体混悬液或溶液。对于口服或胃肠外给药而言，可以加入可药用的适当的表面活性剂、混悬剂或乳化剂。混悬剂可以包括油类，例如花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬液制剂也可以含有脂肪酸的酯类，例如油酸乙酯、豆蔻酸异丙基酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化的脂肪酸甘油酯。混悬液制剂可以包括醇类，例如乙醇、异丙醇、鲸蜡醇、丙三醇和丙二醇。在混悬液制剂中，也可以采用醚类(例如聚(乙二醇))、石油烃类(例如矿物油和矿脂)和水。
本发明的组合物可以制备为药物给药于哺乳动物，优选人类。本发明的此类药用组合物可以通过口服、胃肠外、喷雾吸入、局部、直肠、鼻腔、颊内、阴道或通过植入的储库给药。本文中使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸腔内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选组合物可以通过口服或静脉内给药。本发明的制剂可以设计为短效、速释、长效、缓释制剂。另外，化合物可以局部方式给药而非全身方式给药，例如以缓释制剂的形式给药(例如注射)。
本发明组合物的无菌注射用制剂可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可以根据本领域已知技术采用适当的分散剂或润湿剂和混悬剂制备。无菌注射用制剂也可以是在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如1，3-丁烷二醇)中的无菌注射用溶液或混悬液。在这些可接受的载体和溶剂中，可以使用的包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌固定油通常也可以用作溶剂或混悬介质。为此，可以采用任何品牌的固定油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物作为天然的药学上可接受的油类，可以用于制备注射剂，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙基化的形式。这些油溶液或混悬液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂例如羧甲基纤维素或类似的在可药用剂型(包括乳剂和混悬液)的制备中常用的分散剂。为了制剂的目的，也可以采用在可药用固体、液体或其它剂型的生产中常规使用的其它常用表面活性剂(例如Tweens、Spans和其它乳化剂)或生物利用度促进剂。化合物可以制备为用于胃肠外注射给药的形式，例如通过快速浓注或连续输注。用于注射的单位剂型可以是安瓿或多剂量容器。
本发明药用组合物可以是口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。在口服使用的片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊而言，使用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要口服使用的水性混悬液时，活性成分可以与乳化剂和混悬剂混合。如果需要，也可以加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
另外，本发明的药用组合物可以是用于直肠给药的栓剂。它们可以通过将成分与适当的非刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在室温下为固体但是在直肠温度下为液体，因此它们在直肠中能够融化从而释放药物。此类材料包括可可油、蜂蜡和聚乙二醇类。
本发明的药用组合物也可以是局部给药形式，特别是当治疗的靶点包括通过局部应用可以较容易到达的部位或器官时，包括眼睛、皮肤或肠道低端的疾病。用于所有这些部位或器官的适当的局部制剂易于制备。
肠道低端的局部应用可以通过直肠栓剂(见上)或适当的灌肠剂进行。也可以采用局部透皮贴剂。对于局部应用而言，可以将药用组合物制备为适当的软膏，它含有混悬于或溶于一或多种载体中的活性成分。用于本发明化合物局部给药的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。另外，药用组合物可以制备为适当的洗剂或霜剂，它们含有混悬于或溶于一或多种可药用载体中的活性成分。适当的载体包括矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯、蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苄基醇和水。
对于眼科用药而言，药用组合物可以制备为等渗、pH调节好的无菌盐水中的微粉化的混悬液，或者优选等渗、pH调节好的无菌盐水中的溶液，可以加入或不加入防腐剂，例如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)。另外，对于眼科用药而言，药用组合物可以制备为软膏，例如凡士林软膏。
本发明药用组合物也可以通过鼻用气雾剂或吸入剂给药。此类组合物可以根据药物制剂领域中已知技术制备，可以制备为盐溶液，采用苄醇或其它适当的防腐剂、能够增加生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂。
除了上述剂型外，可药用的赋形剂和载体以及剂型通常是本领域技术人员所已知的，均包含在本发明中。应当理解，对于特定患者而言，特定的剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食、患者的肾功能和肝功能、给药时间、排泄率、合并用药情况、主治医师或兽医师的判断以及待治疗特定疾病的严重程度。活性成分的量也取决于与化合物A联合使用的治疗成分。
V.试剂套盒 本发明还提供了新的试剂盒或包装。在某些实施方案中，本发明的试剂盒含有(a)含有化合物A或其可药用的盐的第一个容器；和(b)含有抗凝剂或其它抗血小板药物的第二个容器。在另一个实施方案中，试剂盒含有(a)含有化合物A或其可药用的盐的第一个容器；(b)含有抗凝剂的第二个容器；和(c)含有其它抗血小板药物的第三个容器。在某些实施方案中，试剂盒还含有药品说明书，它说明了两种药物成分可以一起使用以治疗特征在于不受欢迎的血栓形成的疾病。
第一、第二或第三个容器可以是瓶、罐、小瓶、长颈瓶、注射筒、软管、袋或任何其它在药品生产、储存或运输中所使用的容器。药品说明书可以是标签、挂签、标记等，它记载了与试剂盒中的药用组合物有关的信息。所说明的信息通常由负责药用组合物销售领域的管理机构确定，例如美国食品药品管理局。优选药品说明书特别记载了药用组合物被批准使用的适应症。药品说明书可以由任何材料制成，其中记载了人可以阅读的信息。优选药品说明书为印刷材料，例如纸张、胶被纸版、铝箔或塑料制品等，其中印刷了需要的信息。
VI.实施例 除非另外说明，本说明书中采用的缩写具有如下意义 ACN＝乙腈 API＝活性药物成分 aq.＝水的 Boc＝叔-丁氧基羰基 DCM＝二氯甲烷 DMSO＝二甲基亚砜 eq.＝当量 EtOH＝乙醇 g＝克 HPLC＝高效液相色谱 hr＝小时 kg ＝ 千克 KOH ＝ 氢氧化钾 L＝ 升 LOD ＝ 检测限 M＝ 摩尔 Me ＝ 甲基 MeO ＝ 甲氧基 MeOH ＝ 甲醇 mg ＝ 毫克 min ＝ 分钟 mL ＝ 毫升 mm ＝ 毫米 N＝ 当量浓度 ng ＝ 毫微克 nM ＝ 纳摩尔 NMR ＝ 核磁共振 pg ＝ 微微克 pM ＝ 微微摩尔 psi 每平方英寸磅 sec ＝ 秒 THF ＝ 四氢呋喃 TLC ＝ 薄层色谱 WFI ＝ 注射用水 μM ＝ 微摩尔 μg ＝ 微克 Z-gly-gly-arg-AMC ＝ 羧苄基氧基(carbobenzyloxy)-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-4-氨基甲基香豆素 VC ＝ 载体对照 NS ＝ 不显著 实施例1 化合物A及其钾盐式I的制备 流程1
步骤1 将2-氨基-4，5-二氟苯甲酸甲酯(1)(38kg，1.0eq.)和二氯甲烷(560kg，8X，ACS＞99.5％)加至2000L GL反应器中。将反应混合物搅拌5分钟。将4-硝基苯基氯代甲酸酯(49.1kg，1.2eq.)加至200L反应器中，随后加入二氯甲烷(185kg)，将内容物搅拌5分钟。将200L反应器加压后，将4-硝基苯基氯代甲酸酯转移至含有化合物1的二氯甲烷溶液的2000L反应器中。在氮气环境中，将反应混合物加热至40±5℃(回流)3hrs。代表性的TLC分析显示反应完成(同进程(In-process)TLC，没有化合物1剩余；99∶1CHCl3-MeOH)。将溶液冷却至30℃，真空蒸馏除去460kg二氯甲烷。向2000L反应器中加入520kg己烷，将反应器中的内容物冷却至0±5℃并搅拌4hrs。获得的固体通过GF Nutsche滤器过滤，滤器衬有T-515LFTypar滤器和Mel-Tuf 1149-12滤纸。滤饼用20kg己烷洗涤，于35℃真空干燥直到达到恒重。获得干燥产物(70.15kg)，收率98％。产物2通过1HNMR和TLC分析确认。
步骤2 向2000L GL反应器中加入化合物2(64.4kg，1.0eq.)、无水四氢呋喃(557kg)和三乙胺(2.2kg，0.1eq.)。2000L GL反应器的加料管采用四氢呋喃(10kg)冲洗。将反应器的内容物搅拌25分钟，在此期间获得完全的溶液。向200L HP反应器中加入N-Boc-对-亚苯基二胺(38kg，1.0eq.)、四氢呋喃(89kg)，搅拌30分钟直到获得完全的溶液。将200L HP反应器中的内容物转移至含有化合物2的2000L GL反应器中，然后于65±5℃加热2hrs。当反应混合物中化合物2的量＜1％，通过HPLC确认原料2消耗完毕，确认反应完成。
将2000L GL反应器中的内容物冷却至20±5℃，然后在20分钟内加入甲醇钠(25％的甲醇溶液，41.5kg，1.05eq.)，同时保持温度低于30℃。加料管采用四氢呋喃(10kg)冲洗。将内容物于25±5℃搅拌4hrs。同进程HPLC分析确认反应完成，此时反应混合物中化合物3a的量＜1％。向该反应混合物中加入过滤处理水(500kg)，将2000L GL反应器中的内容物真空下蒸馏到干净的200L GL接收器中直到300kg溶剂被蒸馏出来。获得的固体采用GL Nutsche滤器过滤，采用过滤水洗涤直到固体3b的颜色由白变浅灰。
向2000L GL反应器中加入湿的化合物3b滤饼、二氧六环(340kg)，将内容物搅拌1hr。获得的可过滤固体通过衬垫有T-515 LF Typar滤纸的GL Nutsche滤器过滤。将固体滤饼吹干2hrs，然后将二氧六环(200kg)加至2000L GL反应器中。将内容物搅拌10分钟，然后在3小时内加入4NHCl的二氧六环溶液(914kg)，同时保持内部温度低于30℃。加料管采用另外的二氧六环(10kg)冲洗，将反应器的内容物于25±5℃搅拌6小时。通过HPLC监测反应完成，化合物3b转化为化合物3(同进程对照显示反应混合物中的化合物3b＜1％)。将反应器中的内容物冷却至5+5℃2hr，获得的固体通过GL Nutsche滤器过滤，随后采用二氧六环(50kg)洗涤。滤饼采用8±7psi氮吹干30分钟，通过HPLC分析纯度。过滤的固体在真空箱中于45℃干燥48hrs至恒重。获得化合物3(65.8kg，实际收率110.6％)，通过1HNMR和HPLC分析。1H NMR(DMSO)δ11.75(s，1H)，7.88(dd，1H)，7.32(m，4H)，7.21(dd，1H)。
步骤3 向200L HP反应器中加入化合物3(18kg，1.0eq.)，采用100±5psi氮加压。反应器中的氮通过气体排出管排出，打开冷凝器阀门。然后在氩气环境中将二甲基亚砜加至反应器中(＞99.7％，105kg)。将反应器内容物于22℃(19-25℃)搅拌15分钟，然后将200L HP反应器加上最大真空，关闭所有阀门。采用已建立的真空，将甲基胺(33wt％的无水乙醇溶液，37.2kg)加至200L HP反应器中，加入的速度应当保持内部温度在25±5℃。在加入期间保持反应物溶液上的氮气环境。加料管采用二甲基亚砜(5kg)冲洗后，关闭200L HP反应器的冷凝阀，将反应器内容物加热至110±5℃。将反应器中的内容物于110±5℃搅拌至少5hrs。5小时40分钟后同进程HPLC显示化合物3含量为0.09％，说明反应完成(同进程标准(specification)要求化合物3的量≤1％)。将200L HP反应器中的内容物冷却至25±5℃。将200L反应器冷却，关闭2000L GL反应器的所有阀门，加入过滤水(550kg)。15分钟内将200L HP反应器中的内容物转移至2000L GL反应器中，随后采用过滤水(50kg)冲洗加料管。将2000L GL反应器中的内容物于5±5℃搅拌2小时。将获得的可过滤固体在配有Mel-Tuf 1149-12滤纸的GLnutsche滤器上真空过滤。获得湿的滤饼，将其转移至配有Dupont氟碳膜(Kind 100A)和特殊烘箱纸(KAVON 992)的预真空内衬托盘上，放置到真空烘箱托盘干燥器上。烘箱温度设置为55℃，将化合物4干燥12hrs至恒重。获得产物(12.70kg)，收率为76.5％(预计85-95％)。HPLC显示纯度为98.96％，1H NMR确认化合物4的结构。1H NMR(DMSO)δ11.10(s，1H)，7.36(d，1H)，6.78(d，2H)，6.75(m，1H)，6.56(d，2H)，6.20(d，1H)，5.18(d，2H)，2.76(d，3H)。
步骤4 向200L HP反应器中加入化合物4(20.7kg，1.0eq.)、5-氯代噻吩-2-基磺酰基氨基甲酸乙酯(37.5kg，2.0eq.＞95％)、二甲基亚砜(＞99％，75kg)，搅拌15分钟。加上最大真空，将200L HP反应器于65±5℃加热15hrs。反应器中具有代表性的样品的同进程HPLC分析显示反应混合物中剩余的化合物4＜0.9％(反应完成的同进程标准为化合物4＜1％)。向800L反应器加入过滤水(650kg)，然后将200L HP反应器中的内容物转移至800L反应器中，同时保持内部温度低于25℃。将200L HP反应器采用二甲基亚砜(15kg)冲洗，将其转移至800L反应器中，然后于5±5℃搅拌2hrs。形成的固体通过滤器真空过滤至200L GL接收器中，滤饼采用过滤水(60kg)洗涤。滤饼的具有代表性的样品的HPLC分析显示化合物A的纯度＜95％，根据同进程对照表明需要采用二氯甲烷研磨。向800L GL反应器中加入湿的化合物A、二氯甲烷(315kg)，将内容物搅拌3hrs。固体通过衬垫有T515 LF TYPAR滤纸的GL nutsche滤器真空过滤。滤饼采用二氯甲烷(50kg)洗涤，然后滤饼采用8±7psi氮气吹干15分钟。将滤饼转移至配有Dupont氟碳膜(Kind 100A)的预真空内衬托盘上，在真空烘箱托盘干燥器中于60℃干燥12hrs。分离干燥的化合物A(33.6kg，收率93％)，HPLC其纯度为93.5％，磺酰胺含量为4.3％。1H NMR确认化合物A的结构。1H NMR(DMSO)δ11.20(s，1H)，9.15(s，1H)，7.68(d，1H)，7.42(d，2H)，7.36(d，1H)，7.26(m，1H)，7.16(d，2H)，6.78(m，1H)，6.24(d，1H)，2.78(d，3H)。
步骤5 向800L GL反应器中加入乙腈(134kg)、WFI质量的水(156kg)，将内容物搅拌5分钟。然后向其中加入化合物A(33.6kg，1.0eq.)，此时反应混合物为混悬液。向该混悬液中加入氢氧化钾(4.14kg，1.15eq.，＞85％)的水(WFI水，35kg)溶液，保持内部温度低于30℃。加料管采用WFI水(2kg)冲洗，将800L GL反应器的内容物于50±5℃加热1hr。然后将内容物通过袋滤器趁热过滤，再通过一个7筒0.2μ抛光滤器过滤至干净的HDPE筒中。在整个过滤过程中保持过滤系统温热，从而使得没有物质自溶液中析出。将800L GL反应器保温套冷却至25±5℃，然后将800L GL反应器采用乙腈(8.5kg)和WFI水(10kg)的预混合溶液冲洗，经过滤系统冲洗到标记为化合物A热滤液的筒中。采用压力容器，将800L GL反应器采用WFI水(20kg)冲洗，然后采用丙酮(20kg)冲洗，再采用氮气(3+2psi)吹干。关闭800L GL反应器底部阀门，加上20+10英寸Hg真空，然后将标记为化合物A热滤液的筒的内容物加至反应器中。将800L GL反应器内容物冷却至20±5℃，然后采用抛光滤器，向反应器中加入甲醇(373kg，＞99％)，同时保持内部温度低于30℃。将800L GL反应器内容物冷却至15±5℃，随后将内容物于此温度下搅拌12hrs。此时，将可过滤的固体通过干净的过滤装置过滤到干净的200L GL接收器中，随后将反应器加压，在滤器/接收器上加上20+10英寸Hg真空，过滤内容物。滤饼采用甲醇(30kg)洗涤，采用8+7psi氮气吹干10分钟。真空箱托盘干燥器温度设定为80℃，盐式I的湿滤饼置于其上。将湿滤饼转移至配有Dupont氟碳膜(Kind 100A)和特殊烘箱纸(Kavon Mel Tuf纸)的预真空内衬托盘上，在真空箱托盘干燥器上于80℃干燥至恒重(恒重定义为至少1小时间隔的托盘读数显示+50g范围内具有相同的重量)。分析具有代表性的样品(API残留溶剂标准)，显示残留溶剂符合标准。最终的API采用水(5-6％)平衡12hrs，保留一盘WFI水，然后完全翻转，将其再静置12hrs，最后经KF(Karl Fischer)水分析(5.5％水含量)。将盐式I(21.80kg，收率60.6％)转移至双重型聚乙烯袋(double heavy-duty poly bag)中，在第二防护层(secondary containment)中储存。HPLC显示纯度为99.7％，1H NMR确认化合物A的结构。1H NMR(DMSO)δ11.14(s，1H)，8.60(s，1H)，7.48(m，2H)，7.35(d，1H)，7.22(d，1H)，6.95(m，3H)，6.75(m，1H)，6.22(d，1H)，2.78(d，3H)。
化合物A及其盐的其它制备方法和分析描述于于2006年11月3日提交的美国专利申请公开US 2007/0123547，其全部内容在此引入作为参考。
实施例2 倍曲沙班的制备 流程2
步骤1 将5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(5)(25.0kg，1.0eq.)、2-氨基-5-氯代吡啶(6)(16.3kg，1.0eq.)和乙腈(87.5kg，3.5份)加至380L GLMS反应器中。将反应混合物调节至22℃(19至25℃)，加入无水吡啶(30.0kg，3.0eq.)。泵和管采用乙腈(22.5kg，0.9份)向前冲洗，将反应器内容物调节至19-22℃。通过计量泵将磷酰氯(23.3kg，1.20eq.)加至反应器的内容物中，同时保持温度为25℃(22-28℃)。计量泵和管采用乙腈(12.5kg，0.5份)向前冲洗，保持温度为25℃(22-28℃)。加入约1/3的POCl3后，反应混合物通常由浆状物转变为澄清溶液。加入结束时，变混浊。加入完成后，将反应混合物于25℃(22-28℃)搅拌约1hr，此时HPLC分析确认反应完成。将溶液冷却至15℃(12-18℃)，缓慢加入饮用水(156.3kg，6.25份)，同时保持反应温度在12至30℃之间。然后将反应混合物调节至22℃(19至25℃)，搅拌约5hrs直到放热停止。目测可见浆状物形成，反应器内容物在配有滤布的压力nutsche上过滤。反应器、泵和管在压力nutsche上采用两份饮用水(62.5kg，每次2.5份)洗涤。滤液的pH值为7。采用最高50℃的水浴(加热干燥器保温套)将产物(41.8kg)真空干燥。约12hrs后，同进程LOD分析显示溶剂量为0.72％。获得干燥的产物7(34.4kg)，收率为88.2％，HPLC测定纯度为99.1％。
步骤2 向780L Hastelloy反应器中加入化合物7(33kg，1.0eq)、5％钯炭(经硫化的，0.33kg，0.010份)和二氯甲烷(578kg，17.5份)。开始搅拌，将反应器内容物调节至22℃(19-25℃)。将反应器采用约30psi氢气加压，将反应混合物缓慢加热至28℃(25-31℃)。在约30psi、于28℃(25-31℃；最高31℃)，将反应器内容物氢化直到HPLC检测反应完成。16.5hrs后，确认原料消耗完毕(0.472％)后，证明反应完成。将反应器中的内容物通过在8”sparkler滤器中制备的处理的硅藻土垫(0.2-0.5kg硅藻土，采用20-55kg二氯甲烷处理)循环以除去钯催化剂。反应器和硅藻土垫采用两份二氯甲烷(83kg，每次2.5份)洗涤。将滤液转移至570L GLMS反应器中，在大气压下浓缩至约132L(4份体积)。加入乙醇(69kg，2.1份)，在大气压下继续浓缩至约99L(3份体积)。同进程NMR显示二氯甲烷量为39％。再次加入乙醇(69kg，2.1份)，继续浓缩至约99L(3份体积)。同进程NMR显示二氯甲烷量为5％。然后将反应混合物调节至3℃(0-6℃)，搅拌约1hr，获得的浆状物在配有滤布的保温的加压nutsche上过滤。反应器、泵和管采用冷的(3℃(0-6℃))乙醇(26kg，0.8份)洗涤。采用最高温度为50℃的水浴(加热干燥器保温套)，将湿滤饼(36.6kg)于40-50℃真空干燥。12.5hrs后，LOD分析显示溶剂含量为0.1％。获得干燥产物8(26.4kg)，收率89.5％。HPLC显示纯度为98.4％，脱氯化的杂质含量为0.083％。
步骤3 向780L Hastelloy反应器中加入4-氰基苯甲酰氯(9)(17.2kg，1.1eq.)和THF(92kg，3.5份)。将反应器内容物于22℃(19-25℃)搅拌直到所有的固体溶解。将获得的溶液转移至较低处的接收器中，反应器用THF(26kg，1份)冲洗。向干净的反应器中加入化合物8(26.4kg，1eq.)、THF(396kg，15份)和吡啶(2.90kg，0.4eq.)。泵和管用THF(34kg，1.3份)冲洗。通过计量泵向反应器中加入4-氰基苯甲酰氯/THF溶液，保持温度≤30℃，用THF(约10kg)冲洗。将获得的黄色浆状物于22℃(19-25℃)搅拌约2hrs。2hrs后，同进程HPLC显示化合物8含量0％，说明反应完成。将浆状物在配有滤布的加压nutsche上过滤。反应器、泵、管和湿滤饼采用三份乙醇(每份约15kg)冲洗。获得湿滤饼(65.4kg)，将其转移至反应器，浆状物于22℃(19-25℃)在乙醇(317kg，12份)中洗涤约1hr。将浆状物在加压nutsche上过滤，反应器、泵、管和湿滤饼采用三份乙醇(每份约15kg)冲洗，再用二份THF(每份约15kg)冲洗。湿滤饼在最高温度为40℃的热乙二醇浴(加热反应器的保温套)中真空干燥。干燥14.5hrs后，LOD含量为0.75％。研磨粉碎干燥产物(筛0.125”)获得31.8kg化合物10，将其再真空干燥10.5hrs。干燥后，LOD为1.8％，获得产物(31.5kg)，收率74.8％(预计60-90％)。HPLC显示纯度为100％。
步骤4 制备化合物10(455g，1.0eq.)在THF(4.67kg，10.3份)中的浆状物，将其调节至＜10℃。如下制备二甲基氨化锂将己基锂(2.3N/己烷，2.45L，5.5eq.)加至二甲基胺溶液(2N/THF，2.8L，5.5eq.)，保持温度＜10℃。将二甲基氨化锂溶液加至含有化合物10的浆状物中，保持罐温度＜10℃。通过同进程HPLC监测反应进程，确认化合物10的含量＜1.0％。制备NaHCO3(490g，1.1份，5.7eq.)和Na2CO3(490g，1.1份，4.5eq.)在去离子水(6.6kg，14.51份)中的缓冲溶液，将上述反应混合物转移至该水溶液中，保持温度＜5℃。产物沉淀出来，将获得的浆状物在12hrs内调节至20℃。过滤固体，获得的滤饼用3.5kg(7.7份)去离子水洗涤。采用粗熔玻璃料过滤器滤出固体，用冷(0-5℃)无水乙醇(628g，1.4份)洗涤。产物倍曲沙班于30-35℃干燥。获得干燥产物458g(收率73％)。
实施例3 在灌流槽血栓形成分析(I)中的化合物A和倍曲沙班的联合应用 实时灌流槽分析将使用体内显微镜的动物血栓形成模型的特征与灌流槽技术的特征联系起来，从而获得适合于在临床试验中监测药物活性的分析方法。该分析方法以动脉切变率通过毛细血管灌注全血，将血液暴露于血栓III型胶原。血小板采用荧光染料(若丹明6G)标记，然后灌注，从而通过测定灌流槽中的荧光强度进行血栓沉积物的分析。通过血栓高度(荧光强度(像素数)/总面积(μm2))分析进行定量。
在该分析中，测试能够在作为氯吡格雷靶点的人血小板富集血浆中产生相当水平的ADP诱导的血小板积聚的抑制的化合物A的浓度，氯吡格雷是广泛应用的抗血小板药物，其抗血栓活性通过抑制血小板P2Y12受体介导。如
图1所示，采用1.1μM的化合物A(能够显著抑制血小板积聚)进行血液处理，至能够部分抑制血栓形成(23％±14％，p＞0.05，n＝4)。向已经采用化合物A处理的血液中加入倍曲沙班能够产生显著的血栓形成抑制作用(1μM、300nM和100nM的倍曲沙班分别产生68％±3％、59％±14％和57％±11％的抑制，p＜0.01，n＝4)。图2显示倍曲沙班浓度在1μM和3nM之间为剂量依赖性的血栓形成抑制。
实施例4 在实时血栓形成分析(II)中的化合物A和倍曲沙班的联合应用 通过静脉穿刺自健康志愿者收集血液，加入5μM倍曲沙班。体外加入渐增浓度的化合物A。温育20分钟后，通过胶原包被的毛细管(III胶原，1600sec-1)灌注血液。如图3所示，渐增浓度的化合物A显示剂量响应性的血栓形成抑制，采用10μM化合物A获得单一的单层血小板。
实施例5 在凝血酶生成分析中的化合物A和倍曲沙班的联合应用 通过静脉穿刺自健康志愿者收集全血，加入3.2％柠檬酸三钠(Vacutainer，Becton Dickinson)用于抗凝血。通过离心制备血小板富集血浆，将血小板数调节至150,000/μL。在96孔板中，通过加入convulxin(200ng/mL)将血小板活化，于37℃温育3分钟。血小板活化后，通过加入23pM组织因子(Innovin，Dade Behring)和15mM钙使得凝血酶开始生成。在荧光板读数仪中通过特异性荧光底物(Z-gly-gly-arg-AMC，Bachem)的裂解监测凝血酶活性。
在获自人类供体的血小板中，当化合物A浓度为4.7±5.1μM时，获得ADP诱导的血小板积聚的最大抑制的半数(n＝19)。对于因子Xa抑制剂倍曲沙班而言，31.25nM的浓度足以对凝血酶生成产生相当于治疗性抗凝剂(五糖磺达肝癸)相同的抑制。如图4所示，即使当化合物A以能够产生血小板最大抑制的浓度(10μM)使用时，在该离体外系统中仍然有较高水平的凝血酶生成。采用治疗浓度的因子Xa抑制剂倍曲沙班也可以获得凝血酶生成的相似结果。然而，两种成分的联合应用使得凝血酶的产生受到更大的抑制。因为凝血酶活性是血栓形成条件的介质，所以两种成分的联合应用有可能较每一种单一成分单独使用产生更高的活性。
实施例6 化合物A和抗因子XI抗体的联合应用(I) 在该实施例中，自健康志愿者收集非抗凝全血，在通过胶原包被的毛细管(I型胶原)以动脉切变率(1000s-1)灌注之前，加入若丹明6G(它荧光标记血小板)以及因子XI(Hemetech)的抗体和化合物A。灌注后，血小板血栓的大小通过荧光测定。如图5所示，在分析条件下，抗因子XI抗体以至多10μg/mL的浓度单独使用不能减小血栓的大小。在该分析中，化合物A以10tM的浓度单独使用对血小板血栓的大小没有显著作用。然而，当与10μM化合物A联合使用的因子XI抗体的浓度逐渐增加时，观察到血栓大小的抑制与剂量成比例，在因子XI抗体浓度为10μg/mL时达到最大50％的抑制。
实施例7 化合物A和抗因子XI抗体的联合应用(II) 将毛细管采用I型胶原和组织因子的组合产品(胶原与Innovin的比例为1/100)(Dade-Behring)包被。在通过毛细管灌注之前，将非抗凝血液与若丹明6G、10μM化合物A以及倍曲沙班或对抗因子XI的抗体混合。如图6所示，与化合物A单独使用或化合物A和倍曲沙班的组合使用相比，化合物A和因子XI抗体的组合使用能够产生更显著的血栓形成抑制。
实施例8 化合物A和比伐卢定(一种直接凝血酶抑制剂)的联合应用 例如，当化合物A与直接凝血酶抑制剂(例如比伐卢定)联合应用时，可以获得加成性的抗血栓效果，在下列分析中，在12μg/mL比伐卢定(标准治疗浓度)中收集血液，在若丹明6G(它荧光标记血小板)存在下，将其与各种浓度的化合物A(0.1、1或10μM)温育20分钟，随后通过采用胶原(III型)包被的玻璃毛细管以固定切变率(1600s-1)灌注。在这些条件下，比伐卢定单独使用不能明显抑制血栓形成过程，但是，当与比伐卢定联合使用的化合物A的量逐渐增加时，可以观察到剂量依赖性的血栓形成抑制。图7显示化合物A和比伐卢定联合应用可以获得联合的的抗血栓形成作用。
实施例9 P2Y12拮抗剂化合物A和阿司匹林(环氧酶抑制剂)以及因子 Xa抑制剂的联合应用 采用实时灌流槽分析评价健康供体的血栓形成特征，其中人血液通过静脉穿刺自服用阿司匹林的供体(aspirinated donors)(每日服用81mg或325mg阿司匹林，共服用3日)收集，评价除阿司匹林外化合物A的额外的抗血栓形成作用。在该分析中，玻璃毛细管采用I型胶原包被，在因子Xa抑制剂C921-78存在下收集(参见Betz A，Wong PW，Sinha U.肽基-α-酮基噻唑(peptidyl-α-ketothiazole)对因子Xa的抑制包括2个步骤对稳定构象改变的证据。Biochemistry 1999；3814582-14591，其全部内容在此引入作为参考)人全血(与若丹明-6G(荧光标记血小板)一起温育20分钟)，将其通过毛细管以切变率(1600sec-1)灌注。在灌注过程中，血栓形成的程度通过平均荧光强度/面积(μm2)的测定而定量，它是血小板在胶原表面上的沉积的评价。
如图8所示，当将化合物A以渐增浓度在体外加至全血时(通过毛细管灌注前温育15分钟)，它能够以剂量依赖模式抑制血栓形成过程。在阿司匹林和因子Xa抑制剂存在下，浓度为0.37μM的化合物A具有统计学上更显著的额外抗血栓形成作用，而在阿司匹林存在下时该浓度的P2Y12拮抗剂单独使用不能检测到抗血栓形成活性。
实施例10 化合物A和伊非曲班(TP拮抗剂)以及因子Xa抑制剂的联合应用 与上述实施例相似，化合物A和TP拮抗剂(例如伊非曲班)以及因子Xa抑制剂的联合应用显示加成性的抗血栓形成作用。
在该实施例中，通过静脉穿刺在因子Xa抑制剂C921-78存在下(参见上述)自健康志愿者收集血液。将化合物A以1.1μM的浓度加至血样中，在该分析中它模拟了氯吡格雷的抑制作用。如图9所示，当将渐增浓度的伊非曲班加至全血中并在通过胶原包被的毛细管灌注血液(I型胶原，1600see-1)前与化合物A(1.1μM)温育30分钟时，可以观察到剂量依赖性的血栓形成抑制，当浓度为1.1μM的化合物A和30nM的伊非曲班在因子Xa抑制剂存在下联合应用时，获得如氯吡格雷+阿司匹林或化合物A+阿司匹林相同的抑制效果。
实施例11 化合物A和因子Xa抑制剂在实时血栓形成分析中的联合应用 通过静脉穿刺自健康志愿者中将血液收集到各种浓度(5-20μM)的如本文中所述的因子Xa抑制剂中。体外加入渐增浓度的化合物A。温育20分钟后，如实施例4所述通过胶原包被的毛细管灌注(III型胶原，1600see-1)。可以预期，渐增浓度的化合物A与固定浓度的选定的因子Xa抑制剂(例如利伐沙班、apixaban)的联合应用具有剂量依赖模式的血栓形成抑制作用。
实施例12 化合物A和因子Xa抑制剂在凝血酶生成分析中的联合应用 通过静脉穿刺自健康志愿者供体收集全血，加入用于抗凝的3.2％柠檬酸三钠(Vacutainer，Becton Dickinson)。通过离心制备血小板富集血浆。在96孔板的孔中，将最终血小板数调节至150,000/μL，通过加入convulxin(100ng/mL)活化血小板，于37℃温育3分钟。血小板活化后，通过加入23pM组织因子(Innovin，Dade Behring)和15mM钙使得凝血酶开始生成。在荧光板读数仪中通过特异性荧光底物(Z-gly-gly-arg-AMC，Bachem)的裂解监测凝血酶活性，如Sinha U.等所述。纯化的因子Xa的酰胺水解活性(amidolytic activity)的抑制可能不能够说明体内血栓形成的抑制。用于治疗的活性抑制剂的鉴定的启示(Implications for identification oftherapeutically active inhibitors)。Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，231098-1104。
可以预期，与实施例5相似，与相同浓度的各化合物的单独使用相比，化合物A与因子Xa抑制剂(例如利伐沙班、apixaban或其它因子Xa抑制剂)的联合应用能够在更大程度上抑制凝血酶的产生。
实施例13 化合物A和因子Xa抑制剂的联合应用在鼠肠系膜动脉模 型中抑制了血栓形成 根据下列文献所述Andre，P.等，抗凝剂(凝血酶抑制剂)和阿司匹林与P2Y12受体协同作用对抗血栓形成(Anticoagulants(thrombin inhibitors)and aspirin synergize with P2Y12receptor antagonism in thrombosis).Circulation，2003，108(21)2697-703，几乎不加修改的如前所述方法，实施并记录鼠肠系膜动脉上的血栓形成(切变率为1000-1300s-1)。采用通过尾静脉给予的若丹明6G(0.2mg/mL)在位标记血小板，10分钟后使动脉呈像。通过采用5％FeCl3溶液饱和的1×1mm滤纸使得血管壁损伤开始。5分钟后，移除滤纸，采用温盐水(37℃)冲洗肠系膜动脉。记录血小板血管壁相互作用40分钟或者直到出现完全闭塞并坚持多于40秒。在血管损伤前2小时，采用载体对照、化合物A(7.5、20、60mg/kg)或倍曲沙班(4、40、400mg/kg)口服喂饲C57Bl6J小鼠。采用Simple PCI软件实时分析血栓形成，如下列文献所述Andre，P.等，P2Y12在受损动脉中调节血小板粘附/活化、血栓生长和血栓稳定(P2Y12regulates platelet adhesion/activation，thrombus growth，and thrombus stabilityin injured arteries).J Clin Invest，2003，112(3)398-406。以2Hz的频率记录荧光强度40分钟并根据时间作图。分析闭塞(血流停止)时间。
在40分钟的观察期间，剂量为20和60mg/kg的化合物A能够预防由于血管损伤造成的闭塞。7.5mg/kg的剂量能够延迟动脉闭塞时间。超过1μg/mL化合物A的剂量所产生的血浆水平能够预防血管闭塞，而低于1μg/mL的剂量所产生的血浆浓度不能预防闭塞。低于200ng/mL的剂量为无作用剂量。剂量高于1μg/mL的倍曲沙班所产生的血浆粘度能够预防血管闭塞。低于100ng/mL的剂量为无作用剂量。可以预期，当无作用剂量的化合物A和倍曲沙班联合应用时，可以获得有效的协同抗血栓形成活性。同样，其它因子Xa抑制剂(例如，利伐沙班、apixaban)在小鼠的活体显微镜血栓形成模型中预期也具有显著的抗血栓形成活性。可以预期，当无作用剂量的利伐沙班或其它本文中所述的因子Xa抑制剂与无作用剂量的化合物A联合应用时，也可以观察到有效的协同抗血栓形成活性。
实施例14 化合物A和倍曲沙班的联合应用在小鼠肠系膜动脉模型中 抑制了血栓形成 采用几乎不加修改的如前所述方法，实施并记录鼠肠系膜动脉上的血栓形成(切变率为1000-1300s-1)(Andre，P.，等，抗凝剂(凝血酶抑制剂)和阿司匹林与P2Y12受体协同作用对抗血栓形成.Circulation，2003.108(21)第2697-703页.)。采用通过尾静脉给予的若丹明6G(0.2mg/mL)在位标记血小板，10分钟后使动脉呈像。通过采用10％FeCl3溶液饱和的1×1mm滤纸使得血管壁损伤开始。5分钟后，移除滤纸，采用温盐水(37℃)冲洗肠系膜动脉。记录血小板血管壁相互作用40分钟或者直到出现完全闭塞并坚持多于40秒。在血管损伤前2小时，采用载体对照、化合物A(0.83、2.5、7.5、20、60mg/kg)或倍曲沙班(2、4、10mg/kg)口服喂饲C57Bl6J小鼠。采用Simple PCI软件实时分析血栓形成。(Andre，P.等，P2Y12在受损动脉中调节血小板粘附/活化、血栓生长和血栓稳定.J Clin Invest，2003.112(3)第398-406页.)。以2Hz的频率记录荧光强度40分钟并根据时间作图。分析闭塞(血流停止)时间。
在该模型中，剂量为0.83和2.5mg/kg的化合物A无作用。剂量为7.5、20和60mg/kg化合物A延迟了第一次血栓(图10-13)和血管闭塞出现的时间。在40分钟的观察期间，剂量为20和60mg/kg的化合物A能够预防由于血管损伤造成的闭塞。超过1μg/mL化合物A的剂量所产生的血浆水平能够预防血管闭塞，而低于1μg/mL的剂量所产生的血浆浓度不能预防闭塞(图13)。低于200ng/mL的剂量所产生的血浆浓度在该模型中为无作用剂量(图13)。剂量为2和4mg/kg倍曲沙班在该模型中为无作用剂量，而剂量为10mg/kg的倍曲沙班能够显著延迟第一次血栓出现的时间和闭塞时间(图14-17)。当无作用剂量的化合物A(2.5mg/kg)和倍曲沙班(2和4mg/kg)联合应用时，可以获得有效的协同抗血栓形成活性(图14-17)。
在闭塞后2分钟或者血管损伤后42分钟收集抽取血液，测定化合物A和倍曲沙班的血浆浓度。
应当理解，结合上述实施方案阐述了本发明，但是，前面的说明书和实施例都是用于对本发明加以说明而非限定本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和修饰对于本发明所涉及的领域内技术人员而言是显而易见的。
权利要求
1.在哺乳动物中治疗特征在于不受欢迎的血栓形成的疾病的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)选自抗凝剂、抗血小板药物及其组合的治疗成分。
2.权利要求1的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列两种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)抗凝剂。
3.权利要求2的方法，其中抗凝剂为因子Xa抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中因子Xa抑制剂选自YM-150、DaiichiDU-176b、N-{(1R)-2-[4-(1-甲基-4-哌啶基)-1-哌嗪基]-2-氧代-1-苯基乙基}-1H-吲哚-6-甲酰胺、apixaban、利伐沙班、otamixaban和razaxaban。
5.权利要求3的方法，其中因子Xa抑制剂选自下列成分
6.权利要求3的方法，其中因子Xa抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。
7.权利要求6的方法，其中倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐。
8.权利要求2的方法，其中抗凝剂选自凝血酶、因子IXa、因子XI、因子XIa或因子VIIa的特异性抑制剂。
9.权利要求2的方法，其中抗凝剂选自AZD0837、RB2006、希美加群、达比加群、比伐卢定、阿加曲班、水蛭素、华法林和phenocoumarol。
10.权利要求2的方法，其中抗凝剂为注射用抗凝剂。
11.权利要求2的方法，其中抗凝剂选自合成的五糖和低分子量肝素。
12.权利要求2的方法，其中抗凝剂选自磺达肝癸、依达肝素、生物素化的依达肝素、达那肝素、依诺肝素、达肝素和普通肝素。
13.权利要求2的方法，其中抗凝剂为抗因子XI抗体。
14.权利要求2的方法，其中抗凝剂为比伐卢定。
15.权利要求1的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列两种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)其它抗血小板药物。
16.权利要求15的方法，其中抗血小板药物为TP受体拮抗剂或环氧酶抑制剂。
17.权利要求16的方法，其中环氧酶抑制剂为可逆的环氧酶-1抑制剂。
18.权利要求15的方法，其中抗血小板药物选自乙酰水杨酸、阿昔单抗、依非巴特、替罗非班、双嘧达莫、阿司匹林和缓释双嘧达制剂、西洛它唑、伊非曲班、伊波格雷、呋格雷酸、白藜芦醇和奥扎格雷。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中至少一种治疗成分以亚治疗剂量给药。
20.权利要求1-18中任一项的方法，其中两种治疗成分均以亚治疗剂量给药。
21.权利要求1-18中任一项的方法，其中两种治疗成分同时给药。
22.权利要求1-18中任一项的方法，其中两种治疗成分按顺序给药。
23.权利要求1的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下列三种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；
(2)抗血小板药物；和
(3)抗凝剂。
24.权利要求23的方法，其中抗血小板药物为环氧酶抑制剂。
25.权利要求23的方法，其中抗血小板药物为乙酰水杨酸。
26.权利要求23的方法，其中抗凝剂为因子Xa抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中因子Xa抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。
28.权利要求27的方法，其中倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐。
29.权利要求23-28中任一项的方法，其中至少一种治疗成分以亚治疗剂量给药。
30.权利要求23-28中任一项的方法，其中所有的治疗成分均以亚治疗剂量给药。
31.权利要求23-28中任一项的方法，其中三种治疗成分同时给药。
32.权利要求23-28中任一项的方法，其中三种治疗成分按顺序给药。
33.权利要求1-18和23-28中任一项的方法，其中[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用的盐为钾盐或钠盐。
34.权利要求1-18和23-28中任一项的方法，其中所述与血栓形成有关的疾病选自急性心肌梗塞、不稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、短暂性脑缺血发作、中风、外周血管病、先兆子痫/子痫、深部静脉血栓形成、栓塞、弥散性血管内凝血和血栓性血小板减少性紫癜、侵入性操作后血栓形成性和再狭窄性并发症，所述侵入性操作包括血管成形术、颈动脉内膜切除术、CABG(冠状动脉旁路移植)手术后、血管移植术、支架放置以及血管内装置和假体的植入。
35.药用组合物，所述药用组合物含有可药用载体和下列治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)选自抗凝剂、抗血小板药物及其组合的治疗成分。
36.权利要求35的药用组合物，该组合物含有可药用载体和下列两种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)抗凝剂。
37.权利要求36的药用组合物，其中抗凝剂为因子Xa抑制剂。
38.权利要求37的药用组合物，其中因子Xa抑制剂选自YM-150、Daiichi DU-176b、N-{(1R)-2-[4-(1-甲基-4-哌啶基)-1-哌嗪基]-2-氧代-1-苯基乙基}-1H-吲哚-6-甲酰胺、apixaban、利伐沙班、otamixaban和razaxaban，或者选自下列成分
39.权利要求37的药用组合物，其中因子Xa抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。
40.权利要求39的药用组合物，其中倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐。
41.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂选自凝血酶、因子IXa、因子XI、因子XIa或因子VIIa的特异性抑制剂。
42.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂选自AZD0837、RB2006、希美加群、达比加群、比伐卢定、阿加曲班、水蛭素、华法林和phenocoumarol。
43.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂为注射用抗凝剂。
44.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂选自合成的五糖和低分子量肝素。
45.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂选自磺达肝癸、依达肝素、生物素化的依达肝素、达那肝素、依诺肝素、达肝素和普通肝素。
46.权利要求37的药用组合物，其中抗凝剂为抗因子XI抗体。
47.权利要求35的药用组合物，该组合物含有可药用载体和下列两种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)其它抗血小板药物。
48.权利要求47的药用组合物，其中抗血小板药物为TP受体拮抗剂或环氧酶抑制剂。
49.权利要求48的药用组合物，其中环氧酶抑制剂为可逆的环氧酶-1抑制剂。
50.权利要求47的药用组合物，其中抗血小板药物选自阿昔单抗、乙酰水杨酸，依非巴特、替罗非班、双嘧达莫、阿司匹林和缓释双嘧达制剂、西洛它唑、伊波格雷、伊非曲班、白藜芦醇、呋格雷酸和奥扎格雷。
51.权利要求35-50中任一项的药用组合物，其中两种治疗成分中至少一种以亚治疗剂量存在。
52.权利要求35-50中任一项的药用组合物，其中两种治疗成分均以亚治疗剂量存在。
53.权利要求35的药用组合物，该组合物含有可药用载体和下列三种治疗成分
(1)[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；
(2)其它抗血小板药物；和
(3)抗凝剂。
54.权利要求53的药用组合物，其中抗血小板药物为环氧酶抑制剂。
55.权利要求53的药用组合物，其中抗血小板药物为乙酰水杨酸。
56.权利要求53的药用组合物，其中抗凝剂为因子Xa抑制剂。
57.权利要求56的药用组合物，其中因子Xa抑制剂为倍曲沙班或其可药用盐。
58.权利要求57的药用组合物，其中倍曲沙班的可药用的盐为马来酸盐。
59.权利要求53-57中任一项的方法，其中至少一种治疗成分以亚治疗剂量给药。
60.权利要求53-57中任一项的方法，其中所有的治疗成分均以亚治疗剂量给药。
61.权利要求35-50和53-57中任一项的药用组合物，其中[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲的可药用的盐为钾盐或钠盐。
62.试剂盒，该试剂盒包含
(1)第一个容器，其中所述第一个容器含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐；和
(2)第二个容器，其中所述第二个容器含有抗凝剂或其它抗血小板药物。
63.权利要求62的试剂盒，该试剂盒还包含指导两种治疗成分一起使用的药品说明书。
全文摘要
本发明涉及药用组合物和使用联合产品治疗血栓形成疾病的方法，所述联合产品含有[4-(6-氟-7-甲基氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-苯基]-5-氯代-噻吩-2-基-磺酰基脲或其可药用盐。
文档编号A61K45/06GK101686959SQ200880021658
公开日2010年3月31日 申请日期2008年5月2日 优先权日2007年5月2日
发明者P·B·康利, P·安德烈, U·辛哈 申请人:波托拉医药品公司