专利名称：一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，属于生物酶解技术 领域。
背景技术：
生物体在生命活动的代谢过程中，会不断的产生多种自由基，DPPH自由基 (DPPH )、羟自由基(0H* )是两种具有代表性的自由基。自由基过多，会导致生物机体中 许多生物大分子如核酸、蛋白质、多糖及膜多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，使生物大分 子出现交联或断裂，引起细胞结构和功能损害。虽然合成抗氧化剂曾在清除活性氧、食物保 鲜等方面做出了巨大贡献，但人工合成抗氧化剂存在直接或间接的致癌作用，具有潜在的 不安全性。目前天然的抗氧化剂取得了很大的进展，而且天然抗氧化剂已从单纯作为油脂 和含脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内氧自由基的清除剂，以达到保护人体细胞组织、心 脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。我国是禽肉生产和消费的大国。2008年我国鸡肉产量达1015万吨，位居世界第 二，约占鸡总重25%的鸡骨产量也相当可观。目前，鸡骨大部分只作为动物饲料，产品附加 值低，利用率很低。然而，鸡骨中含有丰富的优质蛋白质和人体所需的微量元素以及磷脂、 软骨素、维生素和矿物质等多种营养素。若是能将鸡骨泥进行酶解，提取其抗氧化活性肽， 开发成为天然抗氧化剂和功能性食品，将带来重要的经济与社会意义。
发明内容
本发明目的是提供一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法。以廉价的下 脚料——鸡骨为原料，利用生物酶解技术，开发出一种具有清除DPPH自由基、羟自由基能力 以及还原能力的酶解物。本发明的技术方案包括下列步骤
(1)原料预处理将鸡骨进行粉碎，制成80 100目的骨泥(由福建圣农食品有限公司 提供)，加水配制鸡骨泥悬浮液，浓度为5 9% (重量，以下百分比类同)，80 100°C加热 20 30分钟；
(2)用盐酸或氢氧化钠调整步骤(1)所述悬浮液的pH值，添加蛋白酶进行水解；
(3)对步骤(2)制得的溶液灭酶升高反应体系温度至85°C 95°C，保持10 20分
钟；
(4)将步骤(3)灭酶后的溶液进行过滤采用离心机，4000 4800转/分钟离心8 15分钟；
(5)干燥取步骤(4)所述离心后的上清液，干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。 干燥可以采用冻干、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥等。其中水解的蛋白酶为复合风味蛋白酶Flavourzyme (购自丹麦N0VE公司)、复合 蛋白酶Protamex (购自丹麦N0VE公司)、胰酶(购自苏州天绿制药有限公司)、水解蛋白酶Alcalase (购自丹麦N0VE公司)、胰蛋白酶(购自北京华美公司)、AS. 1398中性蛋白酶(购自 无锡星达生物有限公司)或木瓜蛋白酶(购自上海旭梅公司)。选用复合风味蛋白酶加入时，复合风味蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 75% 1. 25%，控制反应温度为45 65°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6 8，反应20 120分 钟；
选用复合蛋白酶加入时，复合蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的1.0% 1.5%，控制温度 为45 55°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6. 5 7. 5，反应20 100分钟；
选用胰酶加入时，胰酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度为50 60°C， 用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 100分钟；
选用水解蛋白酶加入时，水解蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 75% 1. 5%，控制反 应温度为60 65°C，用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 90分钟；
选用胰蛋白酶加入时，胰蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度为 45 55°C，用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 100分钟；
选用AS. 1398中性蛋白酶加入时，AS. 1398中性蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的 0. 5% 1. 5%，控制温度为50 60°C，用氢氧化钠调整pH为7. 0 9. 0，反应10 100分 钟；
选用木瓜蛋白酶加入时，木瓜蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度 为50 70°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6. 0 8. 0，反应20 120分钟。本发明具有以下优点
1、本发明采用价格低廉的鸡骨泥为原料，利用生物酶解技术生产鸡骨蛋白 酶解物。酶解物具有良好的风味且含有大量短肽和游离氨基酸，易于人体吸收，并且具 有抗氧化活性。2、热反应条件较为温和，对营养成分破坏力低，同时使骨骼中的营养物质 在产品中得以充分保留，有益于人体健康。3、本发明为天然的抗氧化剂，安全性高，具有有效地保护人体细胞组织、心脑血管 循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。4、制备过程简单，原料为肉鸡加工的下脚料，可以有效地节约资源、降低成本，产 品具有明显的市场竞争力。
具体实施例方式实施例一利用复合风味蛋白酶Flavourzyme水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为5% (重 量，以下百分比类同)，于80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为45°C，用0. 5mol/L的盐酸调整pH为6，加入复合风味 蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的0. 75%，反应120分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例二
4(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为7%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为55°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入复合风 味蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的1%，反应70分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例三
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%， 于100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为65°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入复合风 味蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的1. 25%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例四利用复合蛋白酶Protamex水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%， 于100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为45°C，用0. 5mol/L盐酸调整pH为6. 5，加入复合蛋白 酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1. 25%，反应60分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例五
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为55°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入复合蛋 白酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例六
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于 80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为50°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为7. 5，加入复合 蛋白酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1%，反应100分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
5
实施例七利用胰酶水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%， 于100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为50°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入胰酶水 解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1%，反应60分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例八
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为55°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入胰酶水 解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例九
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于 80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为60°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8. 5，加入胰酶 水解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0. 5%，反应100分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十利用水解蛋白酶Alcalase水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于 100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为60°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入水解蛋 白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的1%，反应55分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十一
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为5%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为65°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入水解蛋 白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
(5)干燥取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十二
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为1%， 于80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为62. 5°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8. 5，加入水 解蛋白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的0. 5%，反应90分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十三利用胰蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%， 于100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为50°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入，加酶量 为原料鲜重的1%，反应60分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十四
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为55°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入胰蛋白 酶，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十五
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于 80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为45°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8. 5，加入胰蛋 白酶，加酶量为原料鲜重的0. 5%，反应100分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十六利用AS. 1398中性蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取lKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于 100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为50°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入，加酶量 为原料鲜重的1%，反应60分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。
7
(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十七
(1)原料预处理取IKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为5%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为55°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入AS. 1398 中性蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十八
(1)原料预处理取IKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%， 于80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为60°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入AS. 1398 中性蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0. 5%，反应100分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例十九利用木瓜蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
(1)原料预处理取IKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于 100°C下加热20分钟。(2)水解控制反应温度为50°C，用0. 5mol/L盐酸调整pH为6，加入木瓜蛋白酶， 加酶量为原料鲜重的1%，反应70分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至95°C保持10分钟。(4)过滤采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。(5)干燥取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例二十
(1)原料预处理取IKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为5%，于 90°C下加热25分钟。(2)水解控制反应温度为70°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入木瓜蛋 白酶，加酶量为原料鲜重的1. 5%，反应20分钟。(3)灭酶升高反应体系温度至90°C保持15分钟。(4)过滤采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。(5)干燥取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例二i^一
(1)原料预处理取IKg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%， 于80°C下加热30分钟。(2)水解控制反应温度为60°C，用0. 5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入木瓜蛋 白酶，加酶量为原料鲜重的0. 5%，反应120分钟。
(3)灭酶升高反应体系温度至85°C保持20分钟。(4)过滤采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。(5)干燥取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。实施例二十二七种蛋白酶的鸡骨酶解物的体外抗氧活性
按所述的相同步骤重复进行实施例一、实施例四、实施例七、实施例十、实施例十三、 实施例十六以及实施例十九。将制得的复合风味蛋白酶Flavourzym的鸡骨酶解物、复合 蛋白酶Protamex的鸡骨酶解物、胰酶的鸡骨酶解物、水解蛋白酶Alcalase的鸡骨酶解物、 胰蛋白酶的鸡骨酶解物、AS. 1398中性蛋白酶的鸡骨酶解物和木瓜蛋白酶的鸡骨酶解物溶 于水配制成相同的蛋白质浓度(3mg/mL)，分别采用DPPH显色法、Fenton反应测定羟自由 基法、铁氰化钾测定法，进行体外清除DPPH自由基、清除羟自由基以及还原能力的实验。 如表1所示，复合风味蛋白酶Flavourzyme的鸡骨酶解物的DPPH自由基清除率最高，达 91. 37士0. 68%，而复合蛋白酶Protamex和AS. 1398中性蛋白酶的鸡骨酶解物的DPPH自由 基清除率均高于85%。复合风味蛋白酶Flavourzyme的鸡骨酶解物的羟自由基清除能力最 强，达到35. 5士 1. 09% ；木瓜蛋白酶的鸡骨酶解物的还原性最强，达到0. 36士0. 01 (700nm处 吸光值)。可见，7种蛋白酶的鸡骨酶解物均具有较强的DPPH自由基、羟自由基的清除能力 及还原性，其中对DPPH自由基的清除能力最显著。因此，鸡骨酶解物是一种潜在的天然抗 氧化剂和功能性食品。
表1 七种鸡骨酶解物的体外抗氧化活性测定结果
权利要求
一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)原料预处理将鸡骨进行粉碎，制成80～100目的骨泥，加水配制成鸡骨泥悬浮液，浓度为5 %～9 %(重量，以下百分比类同)，在80～100℃下加热20～30分钟；(2)对步骤(1)制得的悬浮液进行酶解添加蛋白酶进行水解；(3)对步骤(2)制得的溶液灭酶升高反应体系温度至85℃～95℃，保持10～20分钟； (4)将步骤(3)灭酶后的溶液进行过滤采用离心机，4000～4800转/分钟离心8～15分钟；(5)干燥取步骤(4)所述离心后的上清液，干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物，所述干燥采用冻干、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征 在于在加入蛋白酶进行水解的过程中，选用复合风味蛋白酶Flavourzyme、复合蛋白酶 Protamex、胰酶、水解蛋白酶Alcalase、胰蛋白酶、AS. 1398中性蛋白酶或木瓜蛋白酶进行 水解。
3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征在 于按以下任意一种方法选用蛋白酶进行水解选用复合风味蛋白酶Flavourzyme加入时，复合风味蛋白酶Flavourzyme用量为鸡骨 泥原料鲜重的0. 75% 1. 25%，控制反应温度为45 65°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为 6 8，反应20 120分钟；选用复合蛋白酶Protamex加入时，复合蛋白酶Protamex用量为鸡骨泥原料鲜重的 1. 0% 1. 5%，控制温度为45 55°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6. 5 7. 5，反应20 100分钟；选用胰酶加入时，胰酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度为50 60°C， 用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 100分钟；选用水解蛋白酶Alcalase加入时，水解蛋白酶Alcalase用量为鸡骨泥原料鲜重的 0. 75% 1. 5%，控制反应温度为60 65°C，用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 90 分钟；选用胰蛋白酶加入时，胰蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度为 45 55°C，用氢氧化钠调整pH为8. 0 9. 0，反应20 100分钟；选用AS. 1398中性蛋白酶加入时，AS. 1398中性蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的 0. 5% 1. 5%，控制温度为50 60°C，用氢氧化钠调整pH为7. 0 9. 0，反应10 100分 钟；选用木瓜蛋白酶加入时，木瓜蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0. 5% 1. 5%，控制温度 为50 70°C，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6. 0 8. 0，反应20 120分钟。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，能够获得有效清除DPPH自由基、羟自由基及具有还原性的酶解物，属于生物酶解技术领域。该方法是将鸡骨进行粉碎，制成骨泥，配制鸡骨泥悬浮液，在80～100℃下加热预处理20～30分钟，冷却至酶反应的最适温度，调整pH，加入蛋白酶，反应一定时间后，升温到85℃～90℃保持10～20分钟灭酶，得到淡黄色粉状物，即为鸡骨蛋白酶解物。本发明所获得的鸡骨蛋白酶解物具有清除DPPH自由基、羟自由基及还原的能力，是潜在的天然抗氧化剂和功能性食品，且安全性高，具有有效地保护人体细胞组织、心脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。
文档编号A61P39/06GK101856367SQ20101011591
公开日2010年10月13日 申请日期2010年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者倪莉, 易余艳 申请人:福州大学