专利名称：人nob1基因的用途及其相关药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人NOBl基因的用途及其相关药物。
背景技术：
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi技术具有很高的转录后沉默效率和特异性，将RNAi技术应用于肿瘤基因治疗是现阶段研究的热点(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。一般利用质粒或病毒载体操纵一段45-50nt的发夹结构RNA (short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达，shRNA在细胞内会自动被加工成为小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)，从而引发基因沉默或者表达抑制。具有携带基因片段容量大、转染效率高、无毒性、不易诱发宿主免疫反应、可感染分裂细胞及终末分化细胞和非分裂细胞、可稳定抑制靶基因的表达等优点，已被广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域(Angaji SA,Hedayati SS, Poor RH, Madani S，Poor SS，Panahi S.Application of RNA interference in treating human diseases. J Genet. 2010 ；89 (4) :527-37. Ketting RF. The many faces of RNAi. Dev Cell. 2011 ；20 (2) :148-61.)。锌指蛋白是人体中最大的蛋白家族，是识别核酸最常见的结构元件。研究发现人类基因的1%属于锌指蛋白基因家族。锌指蛋白能够通过靶定在基因启动子区域而调节基因的表达，在组织细胞的生长、增殖和分化中均起重要作用，其异常表达可能导致许多疾病包括恶性肿瘤的发生(Yajima I，Kumasaka M，Thang ND，Yanagishita T，Ohgami N， Kallenberg D，Naito Y，Yoshikawa T，Sakashita N，Kato M. Zinc finger protein 28 as a novel melanoma—related molecule. J Dermatol Sci. 2009 ；55 :68-70.Oyanagi H， Takenaka K， Ishikawa S，Kawano Y，Adachi Y，Ueda K，Wada H，Tanaka F.Expression of LUN gene that encodes a novel RING finger protein is correlated with development and progression of non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2004 ；46 :21-28. Witkiewicz-Kucharczyk A，Bal W. Damage of zinc fingers in DNA repair proteins， a novel molecular mechanism in carcinogenesis.Toxicol Lett. 2006 ； 162 :29-42. Vendrell JA, Ghayad S， Ben-Larbi S，Dumontet C，Mechti N， Cohen PA. A20/TNFAIP3, a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancer cells. Oncogene. 2007 ；26 :4656-4667.)。锌带蛋白(zinc ribbon protein)是锌指类蛋白的一种，作为转录因子结合核酸的结构域是RNA聚合酶II中通用转录因子的重要组成部分，在细胞生长、增殖过程中发挥作用，并与白血病、乳腺癌、胃肠恶性肿瘤的多药耐药和癌变进展有关(Hong LiPiao YiHan Y，Wang J，Zhang X,Du Y，Cao S，Qiao Τ, Chen Ζ, Fan D.Zinc ribbon domain-containing 1(ZNRDl)mediates multidrug resistance of leukemia cells through regulation of P-glycoprotein and Bcl-2. Mol Cancer Ther. 2005 ；4 (12) :1936-42. Shi Y, ZhangY, Zhao Y, Hong L, Liu N, Jin X, Pan Y, FanD. Overexpression of ZNRDl promotes multidrug-resistant phenotype of gastric cancer cells through upregulation of P-glycoprotein. Cancer Biol Ther. 2004 ；3 (4) :377-81. Wang LH, Yang XY, Zhang X, Mihalic K, Fan YX, Xiao W, Howard OM, Appella E, Maynard AT, Farrar WL. Suppression of breast cancer by chemical modulation of vulnerable zinc fingers in estrogen receptor. Nat Med. 2004 ； 10(1) :40-7. Hong L, Chen Z, Zhang X，Xia L, Han Z, Lu Y, Jin H, Song J, Qiao T, Fan D. Zinc ribbon domain containing 1 protein :modulator of multidrug resistance, tumorigenesis and cell cycle. Exp Oncol. 2006 ；28(4) 258-62.)。 NOBlp (Nin one binding protein)作为一种锌带蛋白，最早是利用^S蛋白酶体的 19S 调节亚基 p3K26S proteasome regulatory subunit p31，Rpnl2)通过酵母双杂交方法在酵母中发现的，在溶酶体组装、成熟以及核糖体RNA的形成过程中发挥重要作用(Tone Y, TanahashiN, Tanaka K, Fujimuro Μ, Yokosawa H, Toh_e A. NobIp, a new essential protein, associates with the 26S proteasome of growing saccharomyces cerevisiae cells. Gene. 2000 ；243 (1-2) :37-45.)。Noblp 在人类中的同源基因 NOBl 及其编码产物于2005年从人肾脏的cDNA文库中克隆。该基因定位于人染色体16q22. 1，包含九个外显子和八个内含子，cDNA全长174bp。NOBl编码412个氨基酸序列的、分子量为 46675Da的RNA结合蛋白，该蛋白的氨基端含一个RNase活性的PIN(PilT amino terminus) 结构域，羧基端含有保守的锌带蛋白结构域，用于与RNA结合Ghang Y,Ni J,Zhou G,Yuan J, Ren W, Shan Y, Tang W, Yu L, Zhao S. Cloning, expression and characterization of the human NOBl gene. Mol Biol Rep. 2005 ；32 (3) :185-9.)。通过检测成年人正常组织中NOBl mRNA的表达水平，发现NOBl主要分布于肝、肺、脾等组织；哺乳动物细胞株的检测结果显示NOBl蛋白定位于细胞核。NOBl的酵母同源蛋白参与核糖体小亚基和26S蛋白酶体的合成，在泛素依赖的蛋白水解过程中的重要作用(Fatica A，Oeffinger M, Dlakic M, Tollervey D. Noblp is required for cleavage of the 3' end of 18S rRNA. Mol Cell Biol. 2003 ；23 :1798-807. Tone Y. ,Toh-e A. Noblp is required for biogenesis of the 26S proteasome and degraded upon its maturation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 2002 ;16 :3142-57.)。目前已发现 c_myc、c_fos、p53 和 ElA 等核内原癌蛋白的降解依赖泛素-蛋白酶体途径(Ciechanover A, Finley D，Varshavsky A. Ubiquitin dependence of selective protein degradation demonstrated in the mammalian cell cycle mutant ts85. Cell. 1984 ；37 :57-66. Ciechanover A,DiGiuseppe JA,Bercovich B, Orian A,Richter JD, Schwartz AL, Brodeur GM. Degradation of nuclear oncoproteins by the ubiquitin system in vitro.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ；88 :139-43.)。因此推测NOBl可能参与某些原癌蛋白的降解。而核糖体小亚基和^S蛋白酶体的变化与肿瘤的发生、发展、转移和肿瘤抑制有关。因此，NOBl与肿瘤的发生具有一定的关系，有望成为肿瘤基因治疗的一个新靶点。目前已有研究发现NOBlp在卵巢癌组织中的表达明显上调，NOBlsiRNA可有效抑制卵巢癌细胞SK0V3和HEY的生长活性、增殖能力并阻滞细胞分裂，同时显著抑制裸鼠的成瘤能力，提示NOBl与卵巢癌发生和发展相关(Lin Y，Peng S, Yu H，Teng H，Cui M. RNAi—mediated downregulation of NOBl suppresses the growthand colony—formation ability of human ovarian cancer cells. Med Oncol. 2011. PMID 2U87298.)。然而，目前尚未有NOBl调节卵巢癌以外其他肿瘤细胞增殖的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于公开与人NOBl (Nin one binding protein)基因相关的治疗方法及药物。为了深入研究NOBl在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取人胃癌SGC-7901细胞、肝癌SMMC-7721细胞、结肠癌RKO细胞、肺癌H1299细胞和胰腺癌Panc-I细胞为模型， 以RNAi为手段研究NOBl在上述肿瘤细胞的存活和凋亡命运中的作用。本发明第一方面，公开了将人NOBl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人 NOBl基因用于制备肿瘤诊断药物。人NOBl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容其一，将人NOBl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人 NOBl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。所述将人NOBl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指将人 NOBl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人 NOBl基因的表达水平。所述将人NOBl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指将人NOBl基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NOBl基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人NOBl基因小分子干扰RNA即是以人NOBl基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将NOBl基因作为作用对象。所述将人NOBl基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人NOBl基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人NOBl基因的表达相关的任一种肿瘤， 更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌。所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人NOBl基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人NOBl基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。具体的，治疗时，将能有效降低人NOBl基因表达水平的物质给药于患者。进一步的，所述的能有效降低人NOBl基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人NOBl基因表达的小分子干扰RNA (siRNA)。该小分子干扰RNA (siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NOBl基因的表达的作用。进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1_20之任一的序列作为特异性沉默人NOBl基因表达的靶点序列。所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1_20之任一的序列作为特异性沉默人 NOBl基因表达的靶点序列是指该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO 1-20中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人NOBl基因的表达。
进一步的，所述能够特异性沉默人NOBl基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括将编码所述人NOBl基因小分子干扰RNA的DNA 片段克隆入慢病毒载体获得人NOBl基因干扰慢病毒载体，进而利用该人NOBl基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。人NOBl基因干扰慢病毒载体为将编码所述人NOBl基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人NOBl基因小分子干扰RNA。进一步的，所述的慢病毒载体可选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以PGCSIL-GFP为载体。慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。本发明第二方面，公开了一种分离的人NOBl基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1-20中任意一条序列。所述分离的人NOBl基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段可应用于人NOBl基因小分子干扰RNA的筛选与制备。本发明第三方面，公开了一种人NOBl基因小分子干扰RNA(SiRNA)，能够特异性沉默人NOBl基因的表达。所述人NOBl基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1_20之任一的序列作为特异性沉默人NOBl基因表达的靶点序列。进一步的，所述人NOBl基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段， 所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO :1_20中之任一序列编码的RNA。所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条 RNA链上。所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15_27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。进一步的，所述人NOBl基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO 1-20之任一。所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以 UUCAAGAGA 为茎环。如实施例列举的，所述人NOBl基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO 21 =CCUG GAGCCAAUCUUCAAGAAUUCAAGAGAUUCUUGAAGAUUGGCUCCAGG。
本发明第四方面，公开了一种人NOBl基因干扰核酸构建体，包含编码前述人NOBl 基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人NOBl基因小分子干扰RNA。所述的人NOBl基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人NOBl基因小分子干扰 RNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述人NOBl基因干扰核酸构建体为人NOBl基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人NOBl基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人NOBl 基因小分子干扰RNA。所述慢病毒载体可以选自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人NOBl基因干扰核酸构建体,命名为 pGCSIL-GFP-siNOBl。进一步的，编码所述人NOBl基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-20中之任一序列及其互补序列。本发明的人NOBl基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人NOBl基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人 NOBl基因小分子干扰RNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人NOBl基因小分子干扰RNA 施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第五方面，公开了一种人NOBl基因干扰慢病毒，由前述人NOBl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人NOBl基因小分子干扰RNA，从而抑制胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌肿瘤细胞的增殖。本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人NOBl基因小分子干扰RNA或人NOBl基因干扰慢病毒。进一步的，所述药物组合物含有1 99wt%如前所述的人NOBl基因小分子干扰 RNA或人NOBl基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。综上所述，本发明设计了针对人NOBl基因的20个RNAi靶点序列，构建相应的NOBlRNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO 20的RNAi载体pGCSIL-GFP-siNOBl能够显著下调NOBl基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-siNOBl能够靶向地将针对NOBl基因的RNAi序列高效导入人胃癌SGC-7901细胞、肝癌SMMC-7721细胞、结肠癌RKO细胞、肺癌细胞H1299和胰腺癌Panc-I细胞，降低NOBl基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的NOBl基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的SiRNA或者包含该SiRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人NOBl基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NOBl 基因的表达，进而抑制胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌肿瘤细胞的生长，促进胃癌、肝癌、 结肠癌、肺癌和胰腺癌肿瘤细胞凋亡，在胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌肿瘤治疗中具有重要意义。
图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱图2表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胃癌SGC-7901细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、结肠癌RKO细胞、肺癌H1299细胞和胰腺癌Panc-I细胞5天后，NOBl mRNA的表达水平显著降低。图3表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胃癌SGC-7901细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图4表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图5表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人结肠癌RKO细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图6表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图7表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图8使用nobl抗体在不同肿瘤组织组织样本上的免疫组化检测结果a、b为胰腺癌，c为肺癌，d为结肠癌，e、f为胃癌
具体实施例方式本发明基于锌带蛋白可能与肿瘤细胞的增殖、耐药性和转移等相关的研究，认为 NOBl作为一种锌带蛋白可能参与了除卵巢癌外其他恶性肿瘤的发生和发展。本发明涉及了一组针对人NOBl基因的小分子干扰RNA(SiRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人NOBl mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-2 个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源NOBl基因的表达。发明人发现，采用RNAi方法下调人NOBl基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明NOBl基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对NOBl基因的siRNA，筛选出了可有效抑制NOBl的表达进而抑制人胃癌 SGC-7901细胞、肝癌SMMC-7721细胞和结肠癌RKO细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。本发明提供了一系列干扰人NOBl基因的小干扰RNA(SiRNA)序列，构建了可特异性沉默NOBl基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人NOBl基因设计的小干扰RNA及 RNAi慢病毒，稳定并特异地下调NOBl基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明NOBl基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过 RNAi方式沉默NOBl基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。本发明的设计思路为本发明通过如下方法来筛选获得一种人NOBl基因RNAi慢病毒从Genbank中调取人NOBl基因序列；预测siRNA位点；合成针对NOBl基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达NOBl 基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞^3T，包装表达NOBl基因的重组RNAi慢病毒颗粒。收集细胞培养上清中的慢病毒颗粒，纯化浓缩，即制得纯净、稳定表达NOBl siRNA的慢 ^ (siNOBl-Lentivirus)。基于上述方法，本发明提供了 20个干扰NOBl基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO 1-20所示)，构建了特异干扰人NOBl基因的慢病毒。同时本发明还公开一种人NOBl基因RNAi慢病毒(NOBl-RNAi)及其制备与应用。本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低NOBl基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，NOBl基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，NOBl基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的NOBl基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1 针对人NOBl基因RNAi慢病毒的制备1.筛选针对人NOBl基因的有效的siRNA靶点从Genbank中选取人NOBl (ΝΜ_014062)基因的编码区序列，每隔一个碱基起始获得20个碱基的序列；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件，以人NOBl mRNA序列为模板，确定20个有效的siRNA靶点序列(SEQ ID NO 1-20)，如表1所示表1靶向于人NOBl基因的siRNA靶点序列
权利要求
1.人NOBl基因在制备或筛选胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌的肿瘤治疗药物，或者在制备胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌之任一肿瘤诊断药物中的用途。
2.一种分离的人NOBl基因小分子干扰RNA靶标片段，其序列为SEQ ID N0:l_20中任意一条序列。
3.一种人NOBl基因小分子干扰RNA，能够特异性沉默人NOBl基因的表达，所述人NOBl 基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1_20之任一的序列作为特异性沉默人NOBl基因表达的靶点序列。
4.如权利要求3所述人NOBl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO 1-20中之任一序列编码的RNA。
5.如权利要求4所述人NOBl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸。
6.如权利要求5所述人NOBl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段中间由茎环片段分隔。
7.如权利要求6所述人NOBl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如权利要求3所述人NOBl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO :21。
9.一种人NOBl基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求3-8任一权利要求所述人 NOBl基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达人NOBl基因小分子干扰RNA。
10.如权利要求9所述人NOBl基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人NOBl基因干扰核酸构建体为人NOBl基因干扰慢病毒载体。
11.如权利要求10所述人NOBl基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—种人NOBl基因干扰慢病毒，由权利要求9-11任一权利要求所述人NOBl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
13.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求3-8任一权利要求所述人NOBl基因小分子干扰RNA或权利要求12所述人NOBl基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.如权利要求13所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌之任一肿瘤。
全文摘要
本发明公开了人NOB1基因的用途及其相关药物。本发明公开了人NOB1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人NOB1基因小分子干扰RNA、人NOB1基因干扰核酸构建体、人NOB1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人NOB1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NOB1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
文档编号A61K48/00GK102559895SQ201210005128
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2011年12月19日
发明者孙琴, 曹跃琼, 朱向莹, 李杨, 瞿红花, 谭畅, 金杨晟 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司