专利名称：包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用寡核苷酸作为免疫刺激剂的免疫学和免疫治疗应用。相关领域的概述在现代分子生物学中寡核苷酸已经成为不可或缺的工具，应用于各种技术，包括 从诊断探针方法到PCR到基因表达的反义抑制和免疫治疗应用。寡核苷酸的这种广泛使用导致对快速、廉价和高效合成寡核苷酸方法的需求不断増加。用于反义和诊断应用的寡核苷酸的合成现在可以常规地实现。參见，例如，Methods in Molecular Biology, Vo丄 20:Protocols for Oligonucleotides andAnalogs pp. 165-189 (S.Agrawal, ed. , Humana Press, 1993) ;01igonucleotides andAnalogues, A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, ed. , 1991);和 Uhlmann andPeyman, supra;Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech.6:12(1995);和 AntisenseResearch and Applications(Crooke and Lebleu, eds. , CRC Press, Boca Raton, 1993)。早期的合成方法包括磷酸ニ酯和磷酸三酯化学法。例如，Khorana等人，J. Molec.Biol. 72:209 (1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸ニ酯化学法。Reese, TetrahedronLett. 34:3143-3179(1978),公开了用于寡核苷酸和多核苷酸合成的磷酸三酯化学法。这些早期方法大部分已经被更有效的亚磷酰胺和H-膦酸酯(H-phosphonate)合成途径所取代。例如，Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)，公开了脱氧核糖核苷亚磷酰胺在多核苷酸合成中的用途。Agrawal和Zamecnik,美国专利5，149，798 (1992)，公开了通过H-膦酸酯化合物方法的寡核苷酸优化合成。这两种现代方法已经用于合成具有各种修饰的核苷酸间联结的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987),教导了利用亚憐酸胺化学法的寡核苷酸甲基膦酸酯合成。Connolly等人，Biochem. 23:3443(1984)，公开了利用亚磷酰胺化学法的寡核苷酸硫代磷酸酯合成。Jager等人，Biochem. 27:7237 (1988)，公开了利用亚磷酰胺化学法的寡核苷酸氨基磷酸酯合成。Agrawal等人，Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 85:7079-7083 (1988)，公开了利用H-膦酸酯化合物化学法的寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯的合成。最近，若干研究人员已经证明寡核苷酸在免疫治疗应用中用作免疫刺激剂的有效性。磷酸ニ酯和硫代磷酸酯寡核苷酸能够诱导免疫刺激的观察结果引起了人们将这种副作用发展成为治疗手段的兴趣。这些努力聚焦于包含二核苷酸——天然CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸。Kuramoto 等人，Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)教导了包含含有CpG 二核苷酸的回文结构的磷酸二酯寡核苷酸能够诱导干扰素-alpha和ga_a的合成并增强天然杀伤活性。Krieg等人，Nature 371:546-549(1995)公开了包含硫代磷酸酯CpG的寡核苷酸具有免疫刺激活性。Liang等人，J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)公开了这类寡核苷酸活化人B细胞。Moldoveanu等人，Vaccine 16:1216-124 (1998)教导了包含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增强抗流感病毒的免疫应答。McCluskie和Davis，J.Immunol. 161:4463-4466(1998)教导了包含CpG的寡核苷酸作为强力的佐剂，增强抗乙型肝炎表面抗原的免疫应答。Hartman等人，J. Immunol 164:1617-1624(2000)教导了免疫刺激序列是种属特异的，在小鼠和灵长类动物之间是不同的。对含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其他修饰还可能影响它们作为免疫应答调节剂的能力。参见，例如，Zhao 等人，Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao 等人，Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao 等人，Antisense Nucleic Acid DrugDev. (1997)7:495-502;Zhao 等人,Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458;Zhao 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.(2000) 10:2585-2588;Yu 等人，Bioorg. Med. Chem.Lett. (2001) 11:2263-2267;和 Kandimalla 等人,Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813。这些报道清楚表明仍然存在一种需要，以便能够调节免疫刺激性寡核苷酸造成的免疫应答并克服免疫刺激性序列的种属特异性。发明简述本发明提供用于调节寡核苷酸化合物造成的免疫应答的方法。本发明的方法能够用来改变免疫刺激性寡核苷酸产生的细胞因子分布谱(profile)，用于免疫治疗应用。本发明人出人意料地发现免疫刺激二核苷酸的修饰使产生的免疫应答性质可以具有灵活性，而且某些修饰克服了迄今为止观察到的免疫刺激序列的种属特异性。在第一个方面中，本发明提供具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5’ -Tcg1Aacg1Ttcg1-X-G1Cttg1Caag1Ct-S ’ ；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，;5，-TCAGTCGiTTAG-X-GATTGfTGACT-5’ ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGfTGfT-5，和5，-CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中Gi=〗’-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷(arabinoguanosine);和X=甘油接头。在第二个方面中，本发明提供药物组合物。这些组合物包括本发明第一个方面公开的任意一种组合物和药学上可接受的载体。在第三个方面中，本发明提供一种在脊椎动物中产生免疫应答的方法，该方法包括对脊椎动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5’ -Tcg1Aacg1Ttcg1-X-G1Cttg1Caag1Ct-S ’ ；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;
5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’ ;5’ -TCAGTCG JTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5，和5，-CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。在第四个方面中，本发明提供一种用于治疗患有癌症，自身免疫病症，气道炎症，炎性病症，皮肤病症，变态反应，哮喘或者病原体引起的疾病的脊椎动物的方法，这种方法包括对患者施用具有来自下组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5’ -TCGiAACGiTTCGfX-GiCTTGiCAAGiCT-5’ ;5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’ ;5，-TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5，和5，-CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。在第五个方面中，本发明提供一种用于在脊椎动物中预防癌症，自身免疫病症，气道炎症，炎性病症，皮肤病症，变态反应，哮喘或者病原体引起的疾病的方法，这种方法包括对脊椎动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5’ -TCGiAACGiTTCGi-X-GiCTTGiCAAGiCT-5’ ;5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，;5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5，和5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。具体地，本发明涉及I. ー种免疫刺激性寡核苷酸，具有来自下列组的结构5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’ ;5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5，和5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。2. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，。3. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5’ -TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，。4. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5 ’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，。5. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5，。6. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5’ -TCGJCGJTAGA-X-AGATTG1CTG1CT-S'7. 一种如项I所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5 ’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTG!CTGAC-5，。
8. 一种药物制剂，包括如项I所述的寡核苷酸和生理上可接受的载体。9. 一种用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括对脊椎动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，;5，-TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGfTGfT-5，和5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。10.如项9所述的方法，其中施用途径选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱口剂。11.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。12.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。13.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。14.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGfTGACT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。15.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCGJCGJTAGA-X-AGATTGfTGfT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。16.如项9所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。17. 一种用于治疗患有癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或者病原体引起的疾病的脊椎动物的方法，该方法包括对患者施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，;
5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5’ ;5，-TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5，和5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。18.如项17所述的方法，其中施用途径选自非消化道、ロ服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱ロ剂。19.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。20.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCG2TCG2TTAGA-X-AGAITG2CTG2CT-
5’的免疫刺激性寡核苷酸。21.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。22.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。23.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。24.如项17所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。25. 一种用于在脊椎动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或者病原体引起的疾病的方法，这种方法包括对脊椎动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’ ;5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’ ;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，;5，-TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5J ;5’ -TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5’ 和5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5J ;其中G1=2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X=甘油接头。26.如项25所述的方法，其中施用途径选自非消化道、ロ服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱ロ剂。27.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT_5’的免疫刺激性寡核苷酸。28.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCG2TCG2TTAGA-X-AGAITG2CTG2CT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。29.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。30.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCAGTCGJTAG-X-GATTGiCTGACT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。31.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -TCGJCGJTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5’的免疫刺激性寡核苷酸。32.如项25所述的方法，包括施用具有结构5’ -CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5’的免疫刺激性寡核苷酸。33.如项I所述的寡核苷酸，还包括抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。34.如项8所述的药物组合物，还包括抗体、反义药物组合物、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。35.如项9所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。 36.如项17所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。37.如项25所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。
附图简述图I描述了适于本发明的免疫刺激性寡核苷酸的线性合成的一组典型的小分子接头。图2描述了适于本发明免疫刺激性寡核苷酸平行合成的一组典型的小分子接头。图3是用于本发明免疫刺激性寡核苷酸线性合成的合成方案。DMTr=4, 4’ -二甲氧三苯甲基；CE=氰乙基。图4是用于本发明免疫刺激性寡核苷酸平行合成的合成方案。DMTr=4, 4’ - 二甲氧三苯甲基；CE=氰乙基。图5显示在HEK293细胞中本发明免疫刺激性寡核苷酸对TLR9的活化。图6显示在人pDC中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IFN- α的诱导。图7显示在人PBMCs中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IL_6的诱导。图8显示本发明免疫刺激性寡核苷酸对人B细胞的增殖作用(72小时)。图9显示在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IL-12的诱导。
图10显示在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IL_6的诱导。图11是寡核苷酸3’ -端核苷的示意图，显示非核苷酸联结可附接于核苷的核碱基处、3’位或者2’位上。优诜实施方式详述本发明涉及寡核苷酸在免疫治疗应用中作为免疫刺激剂的治疗用途。本文通过提述并入本文引用的授权专利、专利申请和参考文献的全部内容，如同具体地和个别地写明将它们通过提述并入本文一样。在此处引用的任意文献的任意教导与本说明书不一致的情况下，说明书应优先用于本发明的目的。本发明提供增强免疫刺激性化合物引起的免疫应答的方法，所述免疫刺激化合物用于免疫治疗应用，例如，但不限于，在成体和幼体的人类和兽医应用中的癌症、自身免疫病症、哮喘、呼吸系统变态反应、食物过敏以及细菌、寄生虫和病毒感染的治疗。因此，本发明还提供对免疫治疗具有最佳免疫刺激作用水平的化合物，以及制备和使用这类化合物的方法。此外，本发明的化合物可以作为佐剂与DNA疫苗、抗体和变态反应原联用；以及和化疗剂和/或反义寡核苷酸联用。本发明人令人意外地发现，通过对免疫刺激性寡核苷酸进行修饰，使其5’端得到最优的展示，可对其免疫刺激能力产生显著影响。此外，本发明人发现，通过使用新的嘌呤或者嘧啶结构作为免疫刺激性寡核苷酸的一部分，能够调节免疫应答的细胞因子分布谱和种属特异性。在第一个方面中，本发明提供単独的或者包括至少两个寡核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸，所述至少两个寡核苷酸在它们的3’端处、或者核苷间联结(internucleosidelinkage)处、或者官能化的核碱基处或者糖处与非核苷酸接头连接,其中至少ー个寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸并具有易接近的5’端。此处所用的术语“易接近的5’端”是指寡核苷酸的5’端是充分可用的，识别和结合寡核苷酸并刺激免疫系统的因子能够接近它。在 具有易接近5’端的寡核苷酸中，末端糖的5’ OH位置不与超过两个核苷残基或者任意其他干扰与5’端相互作用的模块共价连接。可选的是，5’OH可以连接于磷酸酷，硫代磷酸酷，或者ニ硫代磷酸酯模块，芳香族或者脂肪族接头，胆固醇，或者其他不干扰易接近性的实体。本发明的免疫刺激性寡核苷酸优选地还包括免疫刺激性二核苷酸，所述二核苷酸包括新的嘌呤或者嘧啶。在某些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括核酶或者诱饵寡核苷酸。此处所用的术语“核酶”是指具有催化活性的寡核苷酸。优选的，核酶结合特异的核酸靶标并切割靶标。本文中所用的术语“诱饵寡核苷酸”是指以序列特异性的方式结合转录因子并阻止转录活性的寡核苷酸。优选的，核酶或者诱饵寡核苷酸显示ニ级结构，包括，但不限于，茎-环或者发夹结构。在某些实施方式中，至少ー个寡核苷酸包括聚(I)-聚(C)。在某些实施方式中，至少ー组Nn包括一串3到10个dGs和/或Gs或者2’ -取代的核糖或者阿糖Gs。对本发明来说，术语“寡核苷酸”是指由大量连接的核苷单位形成的多核苷(polynucleoside)。这类寡核苷酸可以从现有的核酸来源，包括基因组或者cDNA来源获得，但优选地通过合成方法产生。在优选的实施方式中，每个核苷单位包括杂环碱基和呋喃戍糖基(pentofuranosyl)、海藻糖、阿拉伯糖、2’ -脱氧-2，取代阿拉伯糖、’ _0_取代阿拉伯糖或者己糖糖基团。核苷残基可以通过很多任意已知的核苷间联结彼此偶联。这类核苷间联结包括，但不限干，磷酸ニ酷，硫代磷酸酷，ニ硫代磷酸酷，烷基磷酸酷，烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate),磷酸三酷,氨基磷酸酷,娃氧烧,碳酸酷，烃氧羰基，こ酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酷，吗啉代，borano，硫醚，桥联磷酰胺脂，桥联亚甲基膦酸酷，桥联硫代磷酸酯，和砜核苷间联结。术语“寡核苷酸”还包括具有ー种或者多种立体特异核苷间联结(例如，(Rp)-或者(Sp)-硫代磷酸酷，烷基磷酸酯或者磷酸三酯联结)的多聚核苷。此处所用的术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明确g在包括具有任意这类核苷间联结的多聚核苷和二核苷，不管该联结是否包括磷酸基。在某些优选的实施方式中，这些核苷间联结可以是磷酸ニ酷，硫代磷酸酷，或者ニ硫代磷酸酯联结，或者其组合。在一些实施方式中，姆个寡核苷酸具有从大约3个到大约35个核苷残基,优选的从大约4个到大约30个核苷残基,更优选的从大约4个到大约20个核苷残基。在ー些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括具有从大约5个到大约18个，或者从大约5个到大约14个核苷残基的寡核苷酸。此处所用的术语“大约”表示精确数目并不是关键的。因此，寡核苷酸中核苷残基的数目并不是关键的，少I个或者2个核苷残基的寡核苷酸，或者多I个到数个核苷残基的寡核苷酸被视作如上所述的每个实施方式的等同物。在一些实施方式中，一种或者多种寡核苷酸具有11个核苷酸。在免疫刺激性寡核苷酸的语境中，优选的实施方式具有从大约13个到大约35个核苷酸，更优选的从大约13个到大约26个核苷酸。术语“寡核苷酸”还包括具有其他取代基的多聚核苷，包括但不限于，蛋白基，亲脂性基，插入剂，二胺，叶酸，胆固醇和金刚烷。术语“寡核苷酸”还包括任意其他包含核碱基的聚合物，包括但不限于，肽核酸(PNA)，具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)，锁定核酸(LNA)，吗啉代-骨架寡核苷酸，和具有包括烷基接头或者氨基接头的骨架部分的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，修饰的核苷或者其混合物。此处所用的术语“修饰核苷”是指包括修饰杂环碱基、修饰糖模块或者其组合的核苷。在一些实施方式中，修饰核苷是如此处描述的非天然嘧啶或者嘌呤核苷。在一些实施方式中，修饰核苷是2’ -取代核糖核苷，阿糖核苷或者2’ -脱氧-2’ -取代-阿拉伯糖苷。 对本发明来说，术语“2’ -取代核糖核苷”或者“2’ -取代阿拉伯糖苷”包括这样的核糖核苷或者阿糖核苷，其中戊糖模块的2’位的羟基被取代产生2’ -取代的或者’ -O-取代的核糖核苷。优选的，这类取代是用包含1-6个饱和或者不饱和的碳原子的低级烷基，或者为具有6-10个碳原子的芳基取代，其中这类烷基或者芳基可以是未取代的，或者可以是取代的，例如被卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或者氨基取代。2’ -O-取代核糖核苷或者2’ -O-取代-阿拉伯糖苷的实例包括但不限于2’ -O-甲基核糖核苷或者2’ -O-甲基阿拉伯糖苷和2’ -O-甲氧乙基核糖核苷或者2’ -O-甲氧乙基阿拉伯糖苷。术语“2’ -取代核糖核苷”或者“2’ -取代阿拉伯糖苷”还包括这样的核糖核苷或者阿糖核苷，其中2’ -羟基被替换为包含1-6个饱和或者不饱和碳原子的低级烷基，或者氨基或卤素基团。这类2’ -取代核糖核苷或者2’ -取代阿拉伯糖苷的实例包括但不限于，2’ -氨基，2’ -氟代，2’ -烯丙基和2’ -炔丙基核糖核苷或者阿拉伯糖苷。术语“寡核苷酸”包括杂交和嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是指具有超过一种类型的核苷间联结的寡核苷酸。这类嵌合寡核苷酸的优选实例之一是包括硫代磷酸酯、磷酸二酯或者二硫代磷酸酯区域和非离子联结例如烷基磷酸酯或者烷基硫代膦酸酯(alkyIphosphonothioate)联结的嵌合寡核苷酸(参见,Pederson等人美国专利5，635, 377和 5，366，878)。“杂交寡核苷酸”是指具有超过一种类型的核苷的寡核苷酸。这类杂交寡核苷酸的一个优选实例包括核糖核苷酸或者2’ -取代核糖核苷酸区域，以及脱氧核糖核苷酸区域(参见，例如，Metelev 和 Agrawal，美国专利 5，652，355，6，346，614 和 6，143，881)。对本发明来说，术语“免疫刺激性寡核苷酸”是指如上所述的寡核苷酸，当将其施用于脊椎动物例如鱼、家禽或者哺乳动物时，其诱导免疫应答。此处所用的术语“哺乳动物”包括但不限于大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛(cattle)、奶牛(cows)、猪、兔、非人灵长类动物和人。有用的免疫刺激性寡核苷酸可参见于Agrawal等人在1998年11月5日公开的WO98/49288; 2001 年2 月 22 日公开的WO 01/12804; 2001 年8 月 2 日公开的WO 01/55370; 2001年4月30日提交的PCT/US01/13682;和2001年9月26日提交的PCT/US01/30137中的描述。优选的，免疫刺激性寡核苷酸包括至少ー个磷酸ニ酷，硫代磷酸酯或者ニ硫代磷酸酯核苷间联结。在一些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括式5’ -Pyr-Pur-3'所示的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然或者合成的喃唳核苷,Pur是天然或者合成的嘌呤核苷。在一些优选的实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括式5’ -Pur*-Pur-3’所示的免疫刺激性ニ核苷酸，其中Pur*是合成的嘌呤核苷，Pur是天然或者合成的嘌呤核苷。在不同的地方二核苷酸表达为RpG，C*pG或者TL,在这种情况下R、C*或者Y分别代表合成嘌呤。尤其优选的合成嘌呤是2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤。当该合成嘌呤位于二核苷酸的Pur*位置时，可克服免疫刺激作用的种属特异性(序列依赖性)并且改善细胞因子分布谱。此处所用的术语“嘧啶核苷”是指这样的核苷，其中核苷的碱基组分是单环核碱基。类似地，术语“嘧啶核苷”是指一种这样的核苷，其中核苷的碱基组分是双环核碱基。对本发明来说，“合成的”嘧啶或者嘌呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤碱基、非天然存在的糖模块、或者它们的组合。 本发明优选的嘧啶核苷具有结构(I)
D
d,\A^a
S(I)其中D是氢键供体；D’选自氢、氢键供体、氢键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；A是氢键受体或者亲水基；A’选自氣键受体、未水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；X是碳或者氮；和S’是戊糖或者己糖糖环，或者非天然存在的糖。优选的，糖环被磷酸酯模块、修饰的磷酸酯模块、或者适于将嘧啶核苷连接到另ー个核苷或者核苷类似物的其他接头模块所衍生化。优选的氢键供体包括但不限于，-NH-，-NH2, -SH和-0H。优选的氢键受体包括但不限于，C=O, C=S和芳族杂环的环氮原子，例如，胞嘧啶的N3。在一些实施方式中，(I)中的碱基模块是非天然存在的嘧啶碱基。优选的非天然存在的嘧啶碱基的实例包括，但不限干，5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，优选N4-こ基胞嘧啶和4-硫尿嘧啶。但是，在一些实施方式中，5-溴胞嘧啶特别被排除在外。在一些实施方式中，(I)中的糖模块S’是非天然存在的糖模块。对本发明来说，“天然存在的糖基”是天然作为核酸一部分存在的糖模块，例如，核糖和2’ -脱氧核糖，而“非天然存在的糖模块”是指不是天然作为核酸一部分存在，但可用于寡核苷酸的骨架的任意糖，例如，己糖。阿拉伯糖和阿拉伯糖衍生物是优选糖模块的实例。本发明优选的嘌呤核苷类似物具有结构(II):
权利要求
1.一种免疫刺激性寡核苷酸，由下述结构组成5’ -CAGTC-Gx-TTCAG-3’ _X_3’ -GACTT-Gx-CTGAC-5’ 其中Gx是2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷或阿糖鸟苷，且X为甘油接头。
2.一种药物制剂，包括如权利要求I所述的寡核苷酸和生理上可接受的载体。
3.如权利要求I所述的寡核苷酸，还包括抗体、反义寡核苷酸、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。
4.如权利要求I所述的寡核苷酸，还包括蛋白。
5.如权利要求2所述的药物制剂，还包括抗体、反义寡核苷酸、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。
6.如权利要求2所述的药物制剂，还包括蛋白。
7.由5’ -CAGTC-Gx-TTCAG-3’ _X_3’ -GACTT-Gx-CTGAC-5’ 的结构组成的免疫刺激性寡核苷酸在制备用于在脊椎动物中产生免疫应答的药物中的用途，其中Gx是2’-脱氧-7-脱氮鸟苷或阿糖鸟苷，且X为甘油接头。
8.免疫刺激性寡核苷酸在制备用于治疗性处理患有癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或者病原体引起的疾病的脊椎动物的药物中的用途，所述免疫刺激性寡核苷酸由5’ -CAGTC-Gx-TTCAG-3’ _X_3’ -GACTT-Gx-CTGAC-5’的结构组成，其中Gx是2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷或阿糖鸟苷，且X为甘油接头。
9.免疫刺激性寡核苷酸在制备用于在脊椎动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或者病原体引起的疾病的药物中的用途，所述免疫刺激性寡核苷酸由 5’ -CAGTC-Gx-TTCAG-3’ _X_3’ -GACTT-Gx-CTGAC-5’ 的结构组成，其中 Gx是2’ -脱氧-7-脱氮鸟苷或阿糖鸟苷，且X为甘油接头。
10.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物的施用途径选自口服、舌下、经皮、鼻内、眼内、气管内、直肠内和阴道。
11.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物的施用途径是非消化道。
12.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物的施用途径是局部。
13.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物配制为气溶胶、基因枪、皮肤贴片、滴眼液或漱口剂。
14.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物与抗体、反义寡核苷酸、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂联用。
15.如权利要求7、8或9中任一项所述的用途，其中所述药物与蛋白联用。
全文摘要
本发明涉及作为免疫刺激剂的寡核苷酸在免疫治疗应用中的治疗用途。更特别的，本发明提供一种免疫刺激性寡核苷酸，所述寡核苷酸在用于产生免疫应答或者用于治疗需要免疫刺激的患者的方法中使用。本发明的免疫刺激性寡核苷酸优选的包括新嘌呤。本发明的免疫刺激性寡核苷酸还包括至少两个寡核苷酸，所述至少两个寡核苷酸在其3'端、核苷间联结或者官能化的核碱基或者糖处与非核苷酸接头连接，其中至少一个寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸并具有易接近的5'端。
文档编号A61P31/00GK102864152SQ20121033568
公开日2013年1月9日 申请日期2005年11月7日 优先权日2005年11月7日
发明者萨德希尔.阿格雷沃尔, 郁东, 埃坎巴.R.坎迪马拉 申请人:艾德拉药物股份有限公司