酪氨酸激酶抑制剂在制备用于预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的用途的制作方法

本发明涉及酪氨酸激酶抑制剂在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的用途，具体涉及化合物ii或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的用途。
背景技术：
：基于目前ipf(特发性肺纤维化)药物的可及性、治疗现状和可及药物存在的不足，如尼达尼布目前在中国尚未上市，吡非尼酮和尼达尼布如这两种药物仅在美国上市两年多，它对于ipf的长期疗效、对生存期的影响、长期服药的耐受性及对重度ipf的疗效等尚不确定，且吡非尼酮存在光过敏的不良反应等。可见临床仍急需开发新的药物，为临床治疗ipf提供更多的选择。技术实现要素：本发明提供了式ii所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防纤维化疾病的药物中的应用。本发明提供了式i所示的化合物(其为式ii所示化合物的盐)在制备用于治疗和/或预防纤维化疾病的药物中的应用。本发明的一些方案中，上述的纤维化疾病为肺纤维化、肝纤维化、硬皮病或肾纤维化。本发明的一些方案中，上述的肺纤维化是特发性肺纤维化。本发明的一些方案中，上述的肺纤维化是尘肺。本发明的一些方案中，上述的肝纤维化是非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化。本发明的一些方案中，上述的肝纤维化是酒精性肝炎肝纤维化。本发明的一些方案中，上述的肝纤维化是胆汁淤积型肝炎肝纤维化。本发明的一些方案中，上述的硬皮病是系统性硬化症相关间质性肺疾病。本发明的一些方案中，上述的肾纤维化是糖尿病引起肾病。相关定义除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见bergeetal.，″pharmaceuticalsalts″，journalofpharmaceuticalscience66：1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟基、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或”治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。本发明采用下述缩略词：wxfl-152代表化合物i；koh代表氢氧化钾；diad代表偶氮二甲酸二异丙酯；pph3代表三苯基膦；t-buono代表亚硝基叔丁酯；cucl2代表氯化铜；bbr3代表三溴化硼；hoac代表醋酸。化合物经手工或者软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1：肺终末细支气管和伴行微小肺动脉损伤和炎症变化病理分析示意图；图2：肺纤维化病理评分示意图；图3：左肺灌洗液细胞总数计数分析，单因素方差分析(one-wayanova)：**p＜0.01，与模型组比；$p＜0.05，与模型组比，平均值±标准误；图4：左肺灌洗液炎细胞分类计数分析；其中图a：中性类细胞百分比；图b单核细胞百分比，图c淋巴细胞百分比；图5：左肺肺纤维化病灶内终末细支气管和伴随的细小肺动脉的损伤和炎症反应，one-wayanova：***p＜0.0001，与模型组比；与bibf1120低剂量组(50mg/kg)比；与bibf1120低剂量组(50mg/kg)比，平均值±标准误；图6：左肺肺纤维化病灶周边终末细支气管和伴随的细小肺动脉的损伤和炎症反应。各组间肺小动脉损伤和炎症评分用one-wayanova进行分析。图中评分以平均值±标准误展示。***与模型组比，p＜0.0001；干与bibf1120低剂量组(50mg/kg)比，p＜0.05；图7：左肺肺纤维化病灶面积(he染色)，左肺全片扫描图像；图8：左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉的组织学变化(×200，he染色)a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组(50mg/kg)；d：bibf1120高剂量组(100mg/kg)；e：化合物i低剂量组(50mg/kg)；f：化合物i高剂量组(100mg/kg)图a为假手术组，可见正常肺细支气管和伴行的肺细小动脉；图b为模型组，可见细支气管和肺细小动脉损伤。图c-f为各治疗组，可见细支气管和肺细小动脉损伤程度均有所减轻。图中a：肺小动脉；b：细支气管。图b-f中，实心箭头指示细支气管损伤，空心箭头指示肺细小动脉损伤。图9：左肺肺纤维化病灶周边细支气管和肺细小动脉的组织学变化(×200，he染色)a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组(50mg/kg)；d：bibf1120高剂量组(100mg/kg)；e：化合物i低剂量组(50mg/kg)；f：化合物i高剂量组(100mg/kg)。图a为假手术组，可见正常肺细支气管和伴行的肺细小动脉；图b为模型组，可见细支气管和肺细小动脉损伤；图c-f为各治疗组，细支气管和肺细小动脉损伤程度均有所减轻。图中a：肺小动脉；b：细支气管。图b-f中，实心箭头指示细支气管损伤，空心箭头指示肺细小动脉损伤。图10：左肺肺纤维化病灶内肺泡组织的组织学变化(×200，he染色)a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组；d：bibf1120高剂量组；e：化合物i低剂量组；f：化合物i高剂量组图a为假手术组，可见正常肺泡壁；图b为模型组，纤维化病灶内片状肺泡结构损伤、消失，由大量渗出的炎细胞和增生的结蹄组织充填(星状标记)。图c-f为各治疗组，肺泡结构虽有异常，但明显好于模型组。f组，也即化合物i高剂量组，部分肺泡接近正常的肺泡壁结构。图b-f中，空心箭头指示纤维化病灶内部分肺泡结构损伤，残存肺泡壁增厚，壁内炎细胞浸润，实心箭头指示部分残存肺泡腔内可见炎性渗出物和增生的结蹄组织。图11：左肺纤维化病灶占左肺切面面积；图12：左肺肺纤维化评分，各组间肺纤维化评分用one-wayanova进行分析。图中评分以平均值±标准误展示。***与模型组比，p＜0.001；图13：左肺肺纤维化百分比病理评分，各组间比较用two-wayanova进行分析，图中评分以平均值±标准误展示。***p＜0.001，与模型组比，平均值±标准误。图14：左肺肺纤维化病灶(massontrichrome三色染色)，左肺全片扫描图像；图15：左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉的组织结构变化(×200，massontrichrome三色染色)；a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组(50mg/kg/d)；d：bibf1120高剂量组(100mg/kg/d)；e：化合物i低剂量组(50mg/kg/d)；f：化合物i高剂量组(100mg/kg/d)图a为假手术组，可见正常肺细支气管和伴行的肺细小动脉；图b为模型组，可见细支气管(实心箭头)和肺细小动脉损伤(空心箭头)，管壁增厚，中膜和外模不同程度的纤维化和结缔组织的增生，以细支气管为重。图c-f为各治疗组，肺纤维化程度均有所减轻。图中a：肺小动脉；b：细支气管。图b-f中，实心箭头指示细支气管损伤，空心箭头指示肺细小动脉损伤。图16：左肺肺纤维化引起的纤维化灶周边细支气管和肺细小动脉的组织结构变化(×200，massontrichrome三色染色)a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组(50mg/kg/d)；d：bibf1120高剂量组(100mg/kg/d)；e：化合物i低剂量组(50mg/kg/d)；f：化合物i高剂量组(100mg/kg/d)图a为假手术组，可见正常肺细支气管和伴行的肺细小动脉；图b为模型组，可见细支气管(实心箭头)和肺细小动脉损伤(空心箭头)，管壁增厚，中膜和外模不同程度的纤维化和结缔组织的增生，以细支气管为重。图c-f为各治疗组，肺纤维化程度均有所减轻。图中a：肺小动脉；b：细支气管。图b-f中，实心箭头指示细支气管损伤，空心箭头指示肺细小动脉损伤。图17：左肺肺纤维化病灶内肺泡组织的结构损伤变化(×200，massontrichrome三色染色)a：假手术组；b：模型组；c：bibf1120低剂量组(50mg/kg/d)；d：bibf1120高剂量组(100mg/kg/d)；e：化合物i低剂量组(50mg/kg/d)；f：化合物i高剂量组(100mg/kg/d)图a为假手术组，可见正常肺泡壁；图b为模型组，可见纤维化病灶内片状肺泡结构损伤、正常肺泡壁结构消失，由大量渗出的炎细胞和增生的结蹄组织充填(星状标记)。图c-f为各治疗组，肺泡结构好于模型组，尤其是化合物i高剂量组(f)中部分肺泡接近正常的肺泡壁结构。图b-f中，实心箭头指示部分残存肺泡腔内可见炎性渗出物和增生的结蹄组织，空心箭头指示纤维化病灶内部分肺泡结构损伤，残存肺泡壁增厚，壁内炎细胞浸润图18：动物左肺体积变化，one-wayanova：***p＜0.0001，与假手术组比，平均值±标准误。图19：动物左肺灌注后的湿重变化，one-wayanova：***p＜0.0001，与假手术组比，平均值±标准误。图20：实验期间动物的体重变化，注：注射博来霉素开始造模的当天记为第1天，第9天起开始给药。图21：实验期间动物的体重变化百分比，注：注射博来霉素开始造模的当天记为第1天，第9天开始给药。图22.大鼠体重曲线(平均值±sem)。图23：大鼠体重变化曲线(平均值±sem)。图24：各组大鼠的肝脏重量(数据以均值±sem标示)。图25：各组大鼠的肝脏重量与体重的比值(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。图26：各组大鼠的血清tb、db和ib水平(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。图27：各组大鼠的血清alp和血糖水平(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。图28：各组大鼠的肝脏各基因mrna相对表达量(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。图29：肝脏病理炎症评分(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。图30：肝纤维化分析(数据以均值±sem标示，与模型组作比较，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05)。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。实施例1：化合物i的制备流程化合物a将化合物2，3二氟-6硝基苯胺(1.00g，5.74mmol)溶解于二氧六环(10ml)中，加入氢氧化钾(1.29g，22.96mmol)的水溶液(4ml)。反应物在100℃下反应16小时后冷却到室温，加入1m柠檬酸水溶液，并用乙酸乙酯提取(20mlx3)。合并的有机层分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得到粗品化合物a(黄色固体，1.00g)，没有纯化直接用于下一步反应。1hnmr(400mhz，cdcl3)7.93(dd，j＝9.6，2.0hz，1h)，6.41-6.36(m，1h)，6.15(br，m，2h)，5.73(br，s，1h).化合物b将化合物a(1.00g，5.81mmol)，无水甲醇(186.16mg，5.81mmol)和三苯基膦(1.68g，6.39mmol)溶解于四氢呋喃(10ml)中，在0℃下滴加偶氮二甲酸二异丙酯(1.29g，6.39mmol)。反应物在0℃下搅拌1个小时后升温至25℃，并继续搅拌16个小时。减压蒸去溶剂，得到的剩余物用快速硅胶柱纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯，乙酸乙酯的含量0-30％)得到化合物b(黄色固体，780.00mg，收率72.12％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)7.98(dd，j＝9.6，2.0hz，1h)，6.40(dd，j＝10.0，7.6hz，1h)，6.09(br，m，2h)，3.97(s，3h).化合物c将化合物b(780.00mg，4.19mmol)溶解于乙腈(5ml)中，在0℃下加入氯化铜(1.13g，8.38mmol)。然后，缓慢加入亚硝基叔丁酯(648.11mg，6.29mmol)。反应物在0℃下搅拌1个小时后升至25℃，并继续搅拌5个小时。将水(10ml)加入到反应液中，并用二氯甲烷(20ml)萃取。有机层分别用2m盐酸水溶液(20mlx3)，饱和碳酸氢钠水溶液(20mlx3)和饱和食盐水(20mlx3)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得到的剩余物用快速硅胶柱纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯，乙酸乙酯的含量0-20％)得到化合物c(黄色固体，360.00mg，收率41.80％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)7.89(dd，j＝9.6，2.0hz，1h)，6.96(dd，j＝9.2，8.0hz，1h)，4.01(s，3h).化合物d将化合物c(100.00mg，486.45μmol)溶解于二氯甲烷dcm(10ml)中，在-78℃下，缓慢滴加三溴化硼(609.33mg，2.43mmol)。反应物在-78℃下搅拌1个小时后升温至25℃，并继续反应16个小时。反应液缓慢加入水淬灭，后加入饱和的碳酸氢钠水溶液，减压蒸去有机层后，用乙酸乙酯(10ml*3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗品化合物d(棕黑色固体，100.00mg)，并直接用于下一步反应。1hnmr(400mhz，cdcl3)7.88-7.85(m，1h)，7.06-7.02(m，1h)，4.01(s，3h).化合物e将化合物d(100.00mg，522.08μmol)和化合物6(123.55mg，522.08μmol)混合于氯苯(5ml)中，并加热到120℃，反应16个小时。减压蒸去溶剂得到粗品化合物e(橙色固体，205.00mg)，并直接用于下一步反应。化合物f将化合物e(205.00mg，523.31μmol)溶解于乙醇(10ml)中，加入锌粉(342.19mg，5.23mmol)和醋酸(314.25mg，5.23mmol)。反应物在80℃下搅拌16个小时。将沉淀物过滤掉，滤液减压蒸馏，得到的剩余物用快速硅胶柱纯化(洗脱液用二氯甲烷和甲醇，甲醇的含量从0-40％)得到化合物f(棕色固体，114.00mg，收率57.21％)。化合物ii将化合物f(114.00mg，315.13μmol)溶解于二氧六环(10ml)中，加入1，1′-硫代羰基二-2(1h)-吡啶酮(102.47mg，441.18μmol)，反应物在101℃下搅拌16个小时。后将反应物冷却到25℃，加入环丙基胺(395.78mg，6.93mmol)。反应物在25℃下搅拌16小时后，直接用制备色谱分离(synergimax-rp，200*25mm，4um，三氟乙酸)，得到目标化合物ii(微黄色固体，16.30mg，收率9.00％)。1hnmr(400mhz，cd3od)9.05(s，1h)，8.95(d，j＝6.4hz，1h)，7.86-7.72(m，1h)，7.66(s，1h)，7.55-7.51(m，1h)，7.22(m，2h)，4.22(s，3h)，2.76(m，1h)，0.94(m，2h)，0.79(m，2h).化合物i在20～30℃，将300ml乙醇加入到500ml的三口瓶中，在20-30℃，甲磺酸(2.50g，26.04mmol)慢慢(2滴/秒)滴加到三口瓶中；反应瓶加热至55～60℃(内温)，化合物g(10.00g，21.70mmol)加入到r1；加完，在55～60℃(内温)搅拌1分钟，然后缓慢(40～50分钟)降温至20～25℃，在20～25℃搅拌14小时；过滤，滤饼用乙醇(5ml*2)洗涤；滤饼45～50℃真空干燥4小时，hnmr(p05222-001-p1a)检测；75～80℃真空干燥14小时，hnmr检测；得到产物化合物i(灰白色固体，10.02g)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm9.39(s，1h)8.99-9.15(m，1h)8.75(s，1h)8.36(brs，1h)7.89-8.08(m，2h)7.87-7.88(m，1h)7.82(brs，1h)7.55-7.72(m，2h)7.06(brs，1h)4.11(s，3h)2.38(s，3h)0.48-0.93(m，4h)实施例2：评价化合物i对博来霉素诱导的大鼠特发性肺纤维化的作用1、材料1.1动物雄性sd大鼠56只，体重240-260克，由北京维通利华实验动物有限公司提供。动物合格证号：11400700132099；实验动物使用许可证号syxk(苏)2012-0004。动物饲养于南京百家汇医药研发平台动物中心spf级屏障系统内，遵循国际标准温、湿、光控制系统。本实验动物操作方案经该平台动物中心与本公司iacuc委员会联合审批确认，严格遵循南京凯斯艾生物科技有限公司(kci)的相关sop实行一切操作和管理。1.2受试化合物化合物i(由实施例1制备而成)，分子量：460.92；化学式量：557.02；盐系数：1.20(557.02/460.92)；纯度：98.81％保存条件：4-8℃尼达尼布乙磺酸盐(bibf1120，nintedanib)包装量：10.5g分子量：539.64；化学式量：649.77；盐系数：1.20(539.64/469.77)；纯度：99.75％；保存条件：室温1.3仪器：体重秤：jj500，g&g，jiangsu，china电热毯：jwilch，china手术显微镜：luckbirdxts-4a动物呼吸机：hx-300s大鼠灌胃器：#16灌胃针组织脱水机：leicaasp300s包埋机：micromgmbh，ec350-1，germany切片机：hm315r，germany自动染色机：leicaautostainerxl显微镜：mic01964，蔡司光学仪器(上海)切片扫描仪：digitalpathscope4s1.4试剂：造模剂：注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社，规格：15mg/瓶批号：650472溶媒：甲基纤维素，规格：m0512-100g，批号：079k0054v，货号：9004-67-5品牌：sigma；吐温80，规格：t104865-500ml，批号：k1519036，货号：9005-65-6品牌：阿拉丁2、方法2.1sd大鼠左侧单侧肺纤维化模型建立在kci动物实验操作sop指导原则下实施本实验所涉及到的一切操作。动物采用腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉；确认动物麻醉之后，消毒后剪开颈部皮肤，顿性分离肌肉暴露气管，沿气管环之间直接注入博来霉素(blm，剂量3mg/kg，注射体积1.0ml/kg)。手术完毕后，将动物置于37℃电热毯保温至动物完全苏醒，确认能够自由采食和饮水后将动物返回饲养笼正常饲养。2.2实验分组本实验共分六组，即假手术组(组-1，n＝6)，模型组(组-2，n＝10)，bibf1120低剂量组(组-3，n＝10)，bibf1120高剂量组(组-4，n＝10)，化合物i低剂量组(组-5，n＝10)，化合物i高剂量组(组-6，n＝10)(表1)。表1实验分组和给药计划*：造模当天为第1天，造模次日为第2天，如此类推。2.3、实验数据采集2.3.1实验动物生理观察检测动物体重变化(每天给药前测量一次体重)；监测试验周期内动物死亡率。2.3.2试验终点给药14天后每组各取5只动物安乐死，进行支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，balf)分析。开胸腔，去心脏，取出动物整肺，用4度冷却的生理盐水冲洗肺表面1-2次。分离颈部气管，用pe20导管插入左右支气管分叉处的左侧支气管，插管3cm深，用手术缝线结扎左侧支气管插管处。用注射器吸取室温的生理盐水3.0ml，通过pe20导管以较小的压力将盐水缓慢注入肺内，可见肺部逐渐变得膨隆、苍白，立即缓慢回抽灌洗液，再将所得液体缓缓注回肺内，如此反复抽注2次。将回收液移至离心管(置冰浴)，记录回收总量，计算回收率。回收液在4℃以1500r/min离心10min，弃上清，细胞沉淀物以50μl的生理盐水重悬后制备成balf液做细胞总数计数和细胞分类计数。之后，将肺组织与每组剩余动物一同进行左肺肺内等量福尔马林灌注固定(每个左肺3毫升)，测量灌注后左肺体积和重量，进行肺病理相关检测。2.3.3左肺balf细胞计数与分类细胞总数计数：将balf混悬液加入细胞计数室中，排除上皮细胞、红细胞.统计白细胞计数区的总细胞数。细胞分类计数：吸细胞沉淀重悬液，滴加洁净载玻片制作细胞涂片。进行瑞士吉姆萨混合染色后在40倍物镜下，统计100个白细胞中中性颗粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的百分比。2.3.4肺脏病理学检测左肺大体病理检测：左肺经福尔马林灌注后进行左肺湿重测量，左肺体积测量。左肺组织病理学检测：按照kci病理sop进行左肺整肺脱水，石蜡块制作，左肺整肺石蜡切片。遵循kci病理标准染色sop进行he染色、massontrichrome染色，并通过digitalpathscope4s切片扫描仪进行切片全片扫描。通过he染色切片进行病变区域内和病变区域周边终末细支气管和伴行微小肺动脉损伤和炎症变化进行病理分析和评分(表2、表3、图1)。通过massontrichrome染色切片进行病变面积计算，病变病理分析和评分(表4、图2)。表2终末细支气管损伤和炎症浸润病理评价指标表3细小肺动脉损伤和炎症浸润病理评价指标表4肺纤维化病理评价指标2.3.5数据分析使用graphpadprism软件，计算平均值±sd或平均值±sem，差异显著性检验使用t-test、one-wayanova和two-wayanova检验。p＜0.05时认为两组之间具有显著性差异。3、实验结果3.1化合物i可降低博来霉素诱导的肺纤维化模型中肺灌洗液中细胞数左肺支气管灌洗液(balf)单位灌洗液体积中细胞总数计算结果如图3。化合物i两周治疗后可见细胞总数与模型组相比显著性减少(p＜0.01)。bibf1120两个剂量(50，100mg/kg)治疗两周后，肺支气管灌洗液中细胞数均有所减少，与模型组相比，高剂量组细胞数减少具有统计学意义(p＜0.05)，而低剂量组与模型组相比没有统计学差异。炎细胞分类统计结果每组统计数值变异性较大，未见每个单项炎细胞各组之间存在显著性差异(图4)。3.2化合物i可减轻博来霉素诱导的肺组织病理改变进行病理检测之前，组-2(模型组)中一只动物经福尔马林固定的肺组织标本丢失，在病理统计中该组数量为9只，其余每组为10只(组-1为6只)。肺组织h&e和massontrichrom染色结果显示，接受博来霉素注射的大鼠左肺可见均匀一致的纤维化病灶以及病灶分布范围，并可见界限较为清晰的肺损伤，表现为细支气管、终末细支气管、肺泡管上皮细胞不同程度的增生，部分上皮乃至全层上皮杯状细胞化，管腔内可见不等量粘液组织。管壁不同程度的炎细胞浸润，部分管壁增厚，平滑肌增生以及管壁外膜肉芽组织增生。病灶内肺泡组织不同程度损伤，表现为肺泡上皮脱落与再生，肺泡壁增厚，纤维化。肺泡腔内炎性渗出，炎细胞浸润。部分肺泡腔纤维化导致整体肺泡组织结构消失(图7～10)。bibf1120和化合物i(50mg/kg、100mg/kg)治疗后显著性改变纤维化病灶内和病灶周边的细支气管以及伴行的细小肺动脉的损伤和炎症反应p＜0.001)，并且50mg/kg化合物i的疗效优于50mg/kgbibf1120(p＜0.05)(图5～10，表5)。massontrichrome染色采用三种染料混合对组织染色，染色后不同的组织类型显示不同的颜色，其中胶原纤维会显示为蓝色或绿色，细胞核会显示为深棕色或黑色，胞浆显示为亮红色或粉色。本研究肺组织用massontrichrome染色后模型组可见肺损伤区域、纤维化灶内及周边的细支气管和伴行的细小动脉组织结构损坏、纤维结蹄组织沉积、和肺泡壁结构破坏、肺泡壁纤维化以及肺泡腔内纤维结蹄组织沉积等病理改变(图14～17)。博来霉素诱导的肺纤维化各组面积一致，说明造模很好的稳定性。但是bibf1120和化合物i治疗组肺纤维程度明显减轻。对左肺纤维化程度进行评分结果显示50、100mg/kg剂量bibf1120和50、100mg/kg剂量化合物i治疗组肺纤维化程度均较模型组显著改善(p＜0.001)(图12)。各剂量组之间虽然没有统计学上的差异，但是其评分数值呈现剂量依赖性减轻的趋势。以肺纤维化评分的3分为界计算小于等于3分和大于等于4分的肺纤维化在纤维化总面积中所占百分比。结果显示在模型组中3分以下的病灶百分比占整个病灶的大于40％，然而，经过药物治疗可见所有药物组的纤维化评分3分以下所占的百分比均大于等于76％，提示药物治疗后肺纤维化的程度减轻(p＜0.001)(表6，图11～17)。3.3化合物i可减轻博来霉素诱导的左肺组织支气管、小动脉损伤及炎症浸润表5左肺损伤和炎症病变的评价(平均值±sem)3.4化合物i可减轻博来霉素诱导的肺纤维化表6左肺纤维化的评价(平均值±sd)3.5左肺大体检测结果动物左肺注射了博来霉素诱导肺纤维化。给药结束时左肺经固定液灌注固定后，测量肺体积和湿重(图18和图19)。结果显示模型组及各给药组肺的体积及湿重均显著低于假手术组(p＜0.001)，证实造模成功。各给药组肺的体积及湿重与模型组相当(p＞0.05)。3.6实验期间所有动物的体重变化及日常观察造模当日为实验的第一天。造模后5日内各组动物体重均有轻度下降，该现象为此模型正常表现。造模5天后所有动物体重均逐渐增加，第9日起开始给药，未见给药引起的体重下降(图20、21)。给药期间所有实验动物未见异常变化。3.7实验结论化合物i在50mg/kg、100mg/kg两个剂量下，对博来霉素诱导的肺细支气管及血管损伤、炎症和纤维化有明显的治疗作用。与相同剂量的bibf1120比较，化合物i对终末细支气管和细小肺动脉的损伤及炎症的改善显著优于同剂量的bibf1120。实施例3：化合物i对大鼠胆汁淤积实验的抗纤维化作用药效1、试验材料1.1受试化合物和对照化合物(1)受试化合物名称：化合物i(由实施例1制备)溶媒：0.5％甲基纤维素+0.2％吐温-80溶液配制方法：1)75mg/kg称取化合物787.93mg溶于103.807ml的0.5％甲基纤维素+0.2％吐温-80溶液中，充分溶解后分装成3份待用。2)75mg/kg称取化合物789.95mg溶于104.073ml的0.5％甲基纤维素+0.2％吐温-80溶液中，充分溶解后分装成3份待用。3)75mg/kg称取化合物700.79mg溶于92.327ml的0.5％甲基纤素+0.2％吐温-80溶液中，充分溶解后分装成2份待用。(2)对照化合物名称：obeticholicacid，奥贝胆酸代号：int-747溶媒：1％hpmc(hydroxypropylmethylcellulose，sigma-h7509)配制方法：20mg/kg称取化合物332.97mg溶于165.969ml的1％hpmc中，充分溶解后分装成8份待用。2、主要仪器及试剂(1)实验仪器及材料1)体内动物试验用仪器：精密电子天平：cpa225d，sartorius动物天平：ja20002，常州科源仪器有限公司2)血生化指标检测用仪器：生化分析仪：hitachi7180，日立3)肝脏mrna表达水平检测用仪器：t100pcr仪：biorad-t100，bio-rad实时定量pcr系统：abiprism7900ht，appliedbiosystemsjanus移液工作站：：ajm8m01，perkinelmer微量紫外分光计：nanodrop2000，thermoscientific4)肝脏病理分析用仪器：全自动组织脱水机：leicaasp300s，莱卡石蜡包埋机：micromec350-1&ec350-2石蜡切片机：micromhm315r全自动染色机：leicaautostainerxl，莱卡显微镜：mic01964，蔡司光学仪器切片扫描仪：digitalpathscope4s(2)实验试剂1)体内动物试验用：anit：1-萘异硫氰酸酯(1-naphthylisothiocyanate)，aldrich-n45)252)肝脏mrna表达水平检测试剂：rneasymini试剂盒：74104，qiagenrnase-freednaseset：79254，qiagen大通量cdna逆转录试剂盒：4368814，abitaquniversalsybrgreensupermix：172-5121，biorad3)肝脏病理分析试剂：苏木素染色液：货号ba4021，珠海贝索生物技术有限公司伊红染色液：货号ba4022，珠海贝索生物技术有限公司天狼星红染色液：批号150202，electronmicroscopysciences3、试验动物分组*：bid，两次给药时间分别为9:00和17:00，两次给药之间至少间隔8小时。4、试验设计4.1大鼠胆汁淤积实验的抗纤维化作用药效为评估化合物i对肝纤维化的改善作用，本研究选用了异硫氰酸酯α(anit)诱导的胆汁淤积型肝纤维化模型，该模型肝纤维发生率高，个体差异较小，被广泛用于肝纤维化研究。本研究利用anit诱导的大鼠胆汁淤积模型，分析化合物i对血清生化指标、肝组织炎症及肝纤维化的改善作用，以奥贝胆酸作为阳性参照。4.2试验方法(1)实验日期的界定：将开始给药的当天定为第0天，开始给药的时间定为第0小时。(2)适应期：总共订购了84只大鼠，动物到的当天，按照组与组之间差异最小的原则进行分组，每组8只，每笼4只；化合物i测试共用32只动物，剩余动物用作其它用途。动物到达设施后，适应期为4天。适应期内，给动物提供正常的饮食和饮水，每天监测动物的健康状况。(3)饮食：第0天，先给药。2小时后，将除第一组外的其它所有笼盒内的正常饲料换成anit添加料，添加量为大鼠正常三天的摄入量(这个量是根据之前的实验结果得出)。anit添加料每三天更新一次。第一组的大鼠在整个实验过程中食用正常饲料。(4)给药安排*：bid，两次给药时间分别为9:00和17:00，两次给药之间至少间隔8小时。每天在给药前，当天需要使用的化合物需要预热到37度后灌胃。(5)预定性安乐死及终点操作(6)终点取材的血/器官样品的收集及转运(7)血清分析方法参数单位方法altu/l紫外连续监测法astu/l紫外连续监测法tbumol/l重氮盐法dbumol/l2，4-二氯苯胺重氮法alpu/l速率法glummol/l葡萄糖氧化酶法tbaumol/l循环酶法(8)肝脏纤维化相关mrna表达水平的检测：1)rna抽提和稀释：严格按照rneasvminikit说明书提取总rna，用depc水稀释rna到合适浓度。2)引物设计：引物序列由苏州金唯智生物技术有限公司合成。3)cdna合成：严格按照highcapacitycdnareversetranscriptionkit说明书逆转录合成cdna，-20℃保存。按照下表准备cdna合成反应体系：按照下表程序完成cdna合成：第一步第二步第三步第四步温度(℃)25378510时间10分钟120分钟5分钟∞4)sybr-green荧光定量pcr实验按照下表准备qpcr反应体系，共10μl每孔，混匀放入abiprism7900htfastreal-timepcr仪。组分体积(1×反应)itaquniversalsybrgreensupermix(2x)5μlforwardprimers0.5ul(10um)reverseprimers0.5ul(10um)depc-treatedwater2μlcdna2μl用janusliquidrobotichandler加入2μlcdna模板。反应条件如下表：5)基因表达数据分析：用相对定量2-δδct的方法计算目的基因的表达水平。公式如下：δct＝目标基因的ct平均值-18s基因的ct平均值δδct＝药物处理各组或正常动物组的δct-模型动物组(controldiet+vehicle)的δct(9)肝脏he染色和纤维化染色及分析方法按照南京凯斯艾生物科技有限公司(kci)病理标准sop进行肝脏组织脱水，石蜡块制作，石蜡切片，he染色石蜡片厚3μm，天狼星红染色石蜡片厚4μm。遵循kci病理标准染色sop分别进行he染色和天狼猩红染色；he染色的片子由一位病理学专家进行打分，苏木素伊红染色切片中，根据肝组织门管区，中央静脉区以及肝细胞之间炎细胞浸润的程度进行评价，评价标准如下：天狼星红染色切片经过digitalpathscope4s全片扫描，对全景切片进行分析，计算胶原纤维在切片中的百分比，以此来判断各组动物经过化合物处理后的纤维化程度变化。5、数据分析试验数据以mean±sem表示，采用分析软件graphpadprism6分析数据，多组数据就单一因素的差异作比较用one-wayanova分析；作图时，将各组与模型组的数据进行比较分析，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；模型组与健康对照组比较，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05。多组数据就双因素差异进行比较用two-wayanova分析。(健康对照组有一只大鼠在第4天由于灌胃操作意外致死，在做two-wayanova分析时该只大鼠的体重数值予以剔除。)6、结果6.1体重及体重变化：从大鼠的体重变化曲线可以明显地观察到(图22和图23)，所有饲喂anit的大鼠体重在开始饲喂anit后都出现了不同程度的下降。而饲喂正常饲料的大鼠体重则是不断增加。第7天到第8天体重突然下降是由禁食导致。6.2肝脏重量及其与体重的比值：与健康对照组相比，模型组肝重重量没有显著性变化(p＞0.05)；与模型组相比，int-747-20mg/kg-qd组和wxfl-152-75mg/kg-bid组肝脏重量没有显著性差异(图24)。肝重与体重的比值，与健康对照组相比，模型组数值显著性升高(p＞0.05)，这与模型组体重在第8天显著性低于健康对照组有关(p＜0.0001)；而其它各组与模型组相比，int-747-20mg/kg-qd组数值显著性升高，第8天两组体重数据相互之间不存在显著性差异(p＝0.99)，而int-747本身具有一定的增加肝重的药效，这在之前的多次实验中已经得到证实。与模型组相比，wxfl-152组数值没有显著性变化(p＝0.10)。(图25)6.3血清生化指标变化：本试验中，相对于正常组，模型组碱性磷酸酶(alp)、总胆红素(tb)、直接胆红素(db)和间接胆红素(ib)均显著性增高，说明造模成功。tb、db、ib的检测结果显示，与正常对照组相比，模型组的数值显著性升高，分别升高36倍、48倍、21倍；而将药物处理组与模型组相比，阳性对照组int-747具有显著性的降低tb、db、ib的作用，分别降低53％、54％、52％；wxfl-152也可以显著性降低tb、db、ib的水平，降低水平均约60％，药效稍优于int-747，但两者之间没有显著性差异(p值分别为0.97，0.97，0.95)。(图26)碱性磷酸酶(alp)水平，与模型组相比，int-747显著性升高，这与int-747在该模型中的多次实验结果相一致；而待测化合物wxfl-152一定程度上可以降低alp水平，降低约22％，使之接近正常水平(p＝0.48)，但不具备显著性差异(p＝0.08)。与正常组相比，模型组的血糖水平出现一定程度的降低，而int-747和wxfl-152则表现出了对这种改变的显著性抑制作用，使血糖水平回复，基本达到正常水平，且两者的药效作用相当(p＝0.95)。(图27)6.4mrna结果分析：与正常组相比，模型组的胶原蛋白1正基因(collagen1α)、转化生长因子-β1基因(tgf-β1)、平滑肌肌动蛋白基因(sma)的相对表达都显著性升高，而int-747在20mg/kg剂量下一定程度上可以降低collagen1α、tgf-β1和sma的相对表达量，分别降低约28％、7％、46％，但不具有显著性差异；而与模型组相比，wxfl-152对这三个基因的表达分别可以降低23％、43％、8％，其中对tgf-β1的表达具有显著性差异(p＝0.03)。(图28)6.5病理学结果分析：肝脏病理切片经过he染色，根据染色结果，对肝脏炎症水平进行打分。模型组炎症水平显著性升高，但阳性对照int-747给药组的分值更高，这在本模型的多次试验中已经得到多次验证；与模型组相比，wxfl-152的炎症分值显著性升高(p＝0.03)，未观察到对肝脏炎症的改善作用(图29)。肝组织切片通过天狼星红染色，经过digitalpathscope4s全片扫描，对全景切片进行分析，计算胶原纤维在切片中的百分比，以此来判断各组动物经过化合物处理后的纤维化程度变化。结果显示，模型组的分值显著性高于健康对照组(p＜0.0001)，显示肝纤维化造模成功。与模型组相比，int-747一定程度上可以降低肝脏组织的纤维化程度，降低约20％；而wxfl-152处理组对肝脏的纤维化程度有明显的抑制作用(p＝0.0008)，抑制率为48％，对肝纤维化具有显著性改善作用。(图30)。7、结论本研究分析了wxfl-152对anit诱导的胆汁淤积性大鼠模型血清学和组织学的改善作用，以奥贝胆酸作为阳性参照。wxfl-152在75mg/kg组表现出显著性抗纤维化作用，且抗纤维化作用优于int-747-10mg/kg。关于本模型各个组的分析结果总结如下：7.1本次胆汁淤积模型造模成功：1)模型组动物血清中的alp/tb/db/ib在血清中的数值显著性高于健康对照组；2)炎症评分结果中，与健康对照组相比，模型组的纤维化程度明显升高，表明该模型可以成功应用与抗炎症药物的体内筛选；3)病理纤维化结果中，与健康对照组相比，模型组的纤维化程度明显升高，表明该模型可以成功应用与抗纤维化药物的筛选；7.2int-747在20mg/kg给药剂量下，在该模型中表现出了与文献报道类似的药效：1)可以显著性降低血清中的tb/db/ib；2)一定程度上降低肝脏纤维化程度；7.3wxfl-152在75mg/kg剂量下显示了一定的抗纤维化作用和抗炎症作用：1)在病理纤维化程度上表现了明显的抗纤维化作用；2)显著性降低胆汁淤积模型的血清tb/db/ib水平。3)显著性降低肝脏中生长转化因子的表达4)一定程度上降低血清alp水平，降低肝脏胶原蛋白基因的表达。当前第1页12