纯化AXL受体酪氨酸激酶抑制剂“R428”的方法与流程

本发明涉及一种方法，尤其涉及一种以高纯度和低溶剂残余物的形式获得限定的活性药物成分的游离碱的方法。

axl(也称为ufo、ark和tyro7；核苷酸登录号为nm_021913和nm_001699；蛋白质登录号为np_068713和np_001690)为受体酪氨酸激酶(rtk)，其包括n末端胞外配体结合结构域和含有催化结构域的c末端胞质区。axl及其两个近亲mertk/nyk和sky(tyro3/rse/dtk)一起被称为rtk的tam家族，均结合并受到相同配体——gas6(生长停滞特异性蛋白-6)的不同程度的刺激，gas6为约76kda的分泌蛋白，其与凝血级联调节剂——蛋白s有显著同源性。除了结合配体，axl胞外结构域已经显示出进行介导细胞聚集的同源相互作用(homophilicinteractions)，提示axl的一个重要功能可能是调节细胞-细胞粘附。

在wo2008/083367中，公开了作为axl抑制剂的一组化合物。这种抑制显示出可导致抗肿瘤作用。一个具体的化合物，1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺(在下文中有时称为化合物a)在这方面已经显示出特别有前途。wo2008/083367描述的化合物a的小规模合成在异丙醇中进行，随后蒸发溶剂并通过hplc纯化。然而，这一过程既昂贵又不适合放大。尝试了分离化合物a的游离碱的其他方法，但是这些方法通常包括太多步骤并且存在提供的产物的溶剂残余物比可能所需的更高的风险。例如，在含有甲苯的终溶剂中合成了化合物a后，一种分离方法包括通过蒸馏将甲苯交换为甲醇，随后加入二氯甲烷，使用mgso4干燥，通过蒸馏除去dcm，加入甲醇，将富马酸加入到热溶剂中并沉淀和分离出富马酸盐。然后用碳酸钾水溶液、乙醇和dcm的混合物处理该盐，干燥有机相，过滤并蒸发得到不纯的化合物a游离碱。将不纯的化合物a游离碱再溶解于乙醇/dcm中，并且加入到沸腾的乙醇中，通过蒸馏除去dcm，得到化合物a游离碱的沉淀。然而，即使在这一复杂过程之后，产品中的残余乙醇和dcm的水平仍然高于所需水平，产品中的残余乙醇和dcm的水平不可预测并且受到方法规模的显著影响。

因此，本发明的一个目的在于提供纯化化合物a的游离碱的方法，所述方法易于放大并且提供具有可接受的低溶剂残余物的产品。

根据本发明的第一个方面，提供了纯化1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱的方法，所述方法包括

a)一定量的粗品1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-

基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三

唑-3,5-二胺和酸一同溶解于c1-5醇和水的混合溶剂中，以及

b)提高步骤(a)所得溶液的ph，直至1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并

[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-

基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱从所述醇-水混合溶剂中沉淀析出。

本发明的方法提供了从粗样品中回收相对纯净形式的化合物a的简易方法。在本文中使用的术语“粗简单地是指化合物a的形式，该化合物a的形式不如所需的用于预期用途的纯净(根据游离碱计)。粗样品可以来自，例如，已经合成了化合物a的反应混合物。不需要使用有害的和/或与水不混溶的有机溶剂即可获得化合物a游离碱。此外，不需要进行通过分离化合物a-酸式盐，随后将该盐分解回游离碱的额外步骤。在步骤(b)期间，ph的提高导致产生溶解性较差的化合物a的游离碱，其会沉淀析出，在溶液中留下较易溶的化合物a-酸式盐。该方法可得到收率高、纯度合适并且溶剂残余物低的产物，例如使用乙醇作为混合溶剂中的c1-5醇时，所得产物的乙醇残余物可显著低于10,000ppm。此外，对于化合物a游离碱的药学上最有用的多晶型形式而言，本发明的方法产生具有高的多晶型纯度的产物。

术语“粗品化合物a”指包括化合物a的盐形式。因此，本发明的方法可以用于从化合物a的盐样品中纯化化合物a游离碱。在这样的实施方案中，应理解步骤(a)中待溶解的酸可以简单地为用作粗品化合物a的化合物a的共轭酸，以此可以不需要加入另外的酸。

在本发明的方法中，虽然还可使用其他直链或支链c1-5醇，但是所述醇-水混合溶剂(即c1-5醇与水的混合溶剂)中的醇优选为甲醇或乙醇。优选的醇为乙醇，并且基于乙醇的混合溶剂可较好地从粗原料中萃取得到化合物a。

在优选的实施方案中，在进行步骤(b)之前，先调节所述醇-水混合溶剂(如有必要)以使得其含有以体积计60-80％，优选70-80％的醇。已发现该水平的溶剂组合物在步骤(b)的沉淀中有好的效果。在70-80％范围以外的醇含量仍然可以使本发明的方法成功地运用(例如，已经发现以体积计60％的乙醇得到了有用的结果)；但是，已经发现70-80％范围内的醇含量意外地提供了甚至更好的结果。如果用于步骤(a)的所述醇-水混合溶剂以体积计已经具有了所需的醇含量，则可以不需要进行该调节步骤。然而，如果有必要或期望对步骤(a)使用较低醇含量的混合溶剂，则可在进行步骤(b)之前进一步加入醇以使醇含量达到所需水平。如果所述粗品化合物a以已经合成了化合物a的反应混合物的形式存在，这通常会以非极性溶剂(例如，甲苯或二氯甲烷)的溶液形式存在。在这种情况下，步骤(a)可以使用较低醇含量的混合溶剂以确保在非极性溶剂与醇-水混合溶剂之间呈现清晰的相分离，并由此有效地除去非极性溶剂和杂质，以及使化合物a的损失最小化。

在进行步骤(b)之前，可以例如调节所述醇-水混合溶剂(如有必要)以使得其含有以体积计73-77％的醇，优选以体积计约75％的醇。尤其是在乙醇的情况中，已经发现这样的溶剂组合物令人惊奇地在步骤(b)中提供了有效的沉淀。

在步骤(b)中，所述步骤(a)所得溶液的ph可以提高到，例如，7.5至9.5。具体而言，所述ph可以提高到7.8至8.8，优选约8.5。已经发现将ph提高到所述范围内可导致化合物a游离碱的有效沉淀，同时杂质的共沉淀最少。

使用碱溶液可以方便地在步骤(b)中提高所述步骤(a)所得溶液的ph。虽然还可以使用合适的有机碱，但是所述碱优选为无机碱。优选的碱包括naoh和koh，尤其是koh。使用包含koh的碱可减少出现在化合物a游离碱中的不溶性杂质。

在一些实施方案中，可能需要在步骤(b)期间不止一次地提高ph，尤其是一旦开始沉淀后。这是因为化合物a游离碱的沉淀可导致ph下降。如果所述粗品化合物a在步骤(a)中以已经合成了化合物a的反应混合物的形式存在，则这可能不是一个问题，因为反应混合物的其他组分可以将溶液缓冲到某一程度。

在优选的实施方案中，步骤(b)中用以提高ph的碱溶液使用醇-水混合溶剂，所述醇-水混合溶剂具有与该步骤中含有粗品化合物a的醇-水混合溶剂基本相同的溶剂组成。这确保了所述醇-水混合溶剂的组成不会因碱的加入而改变。由于沉淀可对醇含量敏感，因此可有效地部署这一预防措施。

在步骤(a)中，所述粗品化合物a以及酸在c1-5醇和水的混合溶剂中的溶解可以在高温下进行(例如在60摄氏度以上，优选在65摄氏度以上，更优选在70摄氏度以上)。可以以该方式获得改善的和/或更快速的溶解。无论是否在高温下进行溶解，优选的是所述步骤(a)所得溶液的温度维持在70摄氏度或更高，同时增加ph(即在步骤(b)期间)。这是为了确保在化合物a与酸之间形成的盐仍然是溶解的，从而防止所述盐污染在步骤(b)中待形成的游离碱沉淀。在优选的实施方案中，所述步骤(a)所得溶液的温度在步骤(b)中维持在73摄氏度或者更高直至化合物a游离碱开始沉淀。在一些情况中，如果在沉淀期间，至少在其初始阶段，将溶液维持在75摄氏度左右，可以获得更好的结果。一旦开始沉淀，即可以进行溶液的冷却，但是理想的是应该监测沉淀进程。例如通过允许混合物从75摄氏度自然冷却至室温，如使得混合物在第一个4至5小时内每小时冷却8至9摄氏度左右(平均)，获得了有用的结果。

本发明的方法还可进一步包括以下步骤：

c)将步骤(b)中获得的1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-

基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三

唑-3,5-二胺游离碱沉淀和酸一同重新溶解于c1-5醇和水的混合溶剂中；

以及

d)提高步骤(c)所得溶液的ph直至1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并

[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-

基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱从所述醇-水混合溶剂中沉淀析出。

步骤(c)和(d)提供了步骤(b)中获得的化合物a游离碱的再沉淀物。这进一步增加了化合物a游离碱的纯度。遵循只有步骤(a)和步骤(b)的方法，获得了98％左右的纯度，以重量计。按照步骤(c)和(d)再沉淀后，纯度增加到大于99％，以重量计。另外，对于化合物a游离碱的期望的多晶型形式而言，步骤(c)和(d)产生具有甚至更高的多晶型纯度的产物。

在进行再沉淀过程中，可能有用的是：在步骤(d)中化合物a游离碱的沉淀期间，必要时进一步提高ph以将ph维持在化合物a游离碱在步骤(d)中开始沉淀时的ph或以上。如在上文步骤(b)的上下文中所述，由于化合物a的沉淀可导致ph下降，因此进一步提高ph可能是必要的。这是可监测的并且通过例如加入另外的碱减弱ph的下降。在上文步骤(a)的上下文中提及的高温也可用于步骤(c)。同样地，就步骤(b)而言在上文提及的温度和冷却条件也可以有利地用于步骤(d)的进行。

步骤(a)和/或(c)所用的酸可以选自富马酸、柠檬酸和盐酸中的一种或多种。如技术人员所理解的，可以使用其他酸。

在一些实施方案中，1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(s)-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱(即化合物a游离碱的s-对映异构体)由一定量的粗品1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(s)-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺(即化合物a的s-对映异构体粗品)纯化。

通常，所述粗品化合物a可以为苯基n'-氰基-n-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)异脲(carbamimidate)与3-肼基-6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪的反应产物。该反应描述于现有技术中(例如wo2008/083367)。所述反应可以在任何合适的溶剂中进行，并且步骤(a)所用的粗品化合物a可以固体或溶液形式(在本文中指“起始溶液”)存在。如上文所述，由于步骤(a)接着可以包括化合物a的液相萃取，因此可以方便地使用非极性溶剂，同时使杂质保留在非极性溶剂中。

因此，在实施方案中，所述粗品化合物a的起始溶液与步骤(a)中的所述醇-水混合溶剂接触。所述粗品化合物a的起始溶液可包括苯基n'-氰基-n-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)异脲与3-肼基-6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪反应所得的产物溶液。如在上文所解释的，起始溶液可以方便地使用步骤(a)所用的醇-水混合溶剂之外的溶剂。在某些实施方案中，所述起始溶液的溶剂可与步骤(a)所用的醇-水混合溶剂基本上不混溶。通常，在步骤(b)之前先将起始溶液的溶剂方便地去除。

根据第二方面，本发明提供了通过本发明第一方面的方法获得的或者可获得的1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱，或者1-(6,7-二氢-5h-苯并[6,7]芳庚并[1,2-c]哒嗪-3-基)-n³-(7-(s)-(吡咯烷-1-基)-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3,5-二胺游离碱。

本发明现在将仅通过实例的方式并参照附图进行更详细地描述，附图中：

图1示出了通过使用本发明步骤(a)、(b)、(c)和(d)的方法获得的化合物a游离碱样品的xrpd结果；以及

图2示出了具有所需多晶型形式的化合物a游离碱的标准样品的xrpd。

化合物a的合成

方案1中示出了合成化合物a的最后一步线路。将b*溶于甲苯并在30℃下与dpcc反应。当完成转化后，加入化合物f，并将温度升至65℃。

方案1

在三种不同的溶剂：甲苯、异丙醇和乙腈之中设置三个实验(0.1gb*)。最好的结果，至少关于d的溶解性的最好结果，是在甲苯中。将所有反应放置过夜，在多数情况下，反应混合物为在边缘有少量沉淀固体的棕色溶液。由b*至d的转化一般超过了99％，并且化合物a的收率通常在70％左右或更高(通过hplc)。

后处理

在50％甲醇/水、75％甲醇/水、50％乙醇/水和75％乙醇/水中测试化合物a富马酸盐物质的溶解性。在所有情形中富马酸盐均能溶解(加热)。通过加入naoh再沉淀的尝试从75％乙醇/水中获得了成功。

优选的溶剂混合物为乙醇/水，并且进行了反应混合物的萃取，其中化合物a最终会在乙醇/水相中。在50℃下向反应混合物中加入乙醇、水和富马酸(与理论收率相比1当量)，得到乙醇/水/甲苯的1:1:1混合物，从而使得相分离和甲苯相中的产物损失最小。

化合物a游离碱的沉淀

在沉淀之前，先(热)过滤反应混合物以除去颗粒。使用大量乙醇“内洗(washin)”产物以得到约75％乙醇/水混合物。最初，在75℃下通过加入1mnaoh(aq)，同时将ph调节至9.1进行沉淀。使悬浮液冷却过夜。分离化合物a，收率为62％，纯度为97.3％。当在类似的实验中将ph调节至10.5时，获得了差不多相同的收率(63％)，但是纯度降至93.9％。另外，检测到了一些富马酸的剩余物。

加入koh而不是naoh使得溶液的ph更高。因此，通过在75℃下加入1mkoh(aq.)调节ph至9进行沉淀。冷却过夜后，分离化合物a，收率为56％，纯度为95.3％。

由于已经用碱的水溶液调节了后续实验中的ph，所以计算出实际的乙醇/水比例为63-67％。因此进行重复实验，由10gb*开始，经后处理后，将溶液分成两份。两种情形均在75％乙醇/水中用1mkoh调节ph，由此保持乙醇/水比例恒定。第一个实验调节至ph8.5，第二个实验调节至ph9.0。沉淀过夜后，测定ph分别为9.3和10.1。ph提高的原因在于温度下降。第一个实验最终收率50％，纯度98.7％。第二个实验最终收率43％，纯度98.5％。得到结论：将乙醇/水比例保持在75％乙醇是绝对有益处的，并且在ph8.5时沉淀得到了最好的结果。

将后续实验放大至20gb*来进行。实验的进行令人满意，收率为21.2g(54％)，纯度为97.6％。另外，放大至120gb*来进行。这一实验的进行也令人满意，并且分离得到174.9g湿固体。基于小样品的干燥，确定收率为51％，纯度为98.7％。

化合物a游离碱的再沉淀

使用上述实验所得的纯度为97.6％的物质进行再沉淀测试。将得物质分成2×10g并且在ph9.0下或在ph8.5下沉淀。溶剂混合物设置为75％乙醇/水，富马酸的量为0.75当量，温度为75℃，碱为在75％乙醇/水中的1mkoh，时间为过夜。

ph9.0的实验生成了7.5g的游离碱(75％回收率)，纯度为99.3％，测定值为98.8％，残余的乙醇为14,600ppm并且水含量为0.20％。对所得化合物a游离碱的样品进行xrpd，结果示于图1中。可观察到与标准样品xrpd(图2)的比较优异。在实验中将ph调节至8.5然后冷却，结果表明，由于当化合物沉淀时ph下降，这一ph可能低于最佳值，使得冷却后在滤液中发现了多于预期的化合物a。

因此，在随后的过程(run)中，在75％乙醇/水中用1mkoh调节ph，并且在ph8.0时观察到自发沉淀。使ph稳定而不加入碱(稳定在ph7.5)，然后通过加入碱调节至8.5。通过加入碱将ph再次稳定在8.5。当观察到ph稳定了20分钟时，使悬浮液冷却过夜。85分钟后，温度为46℃，过夜冷却后测定ph为9.4((22.0℃)。分离得到2.63g(88％回收率)，纯度为99.4％，残余乙醇为8,800ppm。

这一再沉淀非常成功并且控制良好。

讨论和结论

发现向合成化合物a的反应混合物中加入乙醇、水和富马酸(相较于理论收率1当量)在溶剂间得到了1:1:1比例(甲苯：乙醇：水)，这产生了分离溶液(在50℃时)，其中甲苯被除去，同时产物的损失最小，并且除去了一些杂质。用甲苯另外进行洗涤以进一步除去杂质，同时使产物的损失最小化，过量的甲苯可以通过共沸蒸馏除去。

向乙醇/水相中加入乙醇以得到约75％乙醇/水混合物。在75℃下通过在75％乙醇/水中用1mkoh调节ph至8.5进行沉淀。使用最后的沉淀方法，获得了97.6％-98.9％的纯度，以及50％-54％的收率。

发现以下因素对沉淀是重要的：

-碱：当使用naoh调节ph时，形成了一些不溶性物质。

当换成koh时，没有这一问题。

-ph：ph越高，化合物越不纯。ph8.5已经显示出最佳结果。当化合物沉淀时，ph并不显著下降，这可能是因为反应混合物的缓冲。

-醇/水比例：当在75％乙醇/水中使用1mkoh而不用koh水溶液来调节ph时，观察到了在纯度方面有很大的提高，从而使乙醇/水比例保持在75％。

-温度：存在温度的影响。例如，化合物a的富马酸盐在>70℃下溶解，并且似乎在<73℃下对沉淀不那么有利。可以有利的是：在75℃下使沉淀成熟并且缓慢冷却。当然，如技术人员所理解的，当以更加受控的方式冷却时可以获得甚至更好的结果。

为了研究再沉淀，进行1g规模的筛选实验。还进行了更大规模的实验，提供了85-88％的回收率，99.4％-99.7％的纯度，以及7,400-8,800ppm的残余乙醇水平。

发现以下参数对再沉淀是重要的：

-碱：发现koh对所有的再沉淀实验均有效

-ph：当沉淀开始时，ph可能会下降。因此，控制和调节ph是有益处的。在上文所述的实验中，一旦开始沉淀，等到ph稳定了是有效的。在三个大实验中的两个实验中，在ph8.0时观察到了自发沉淀，并且在ph7.8时就开始形成沉淀种子可能是有益处的。最后调节ph至8.5并在该ph下稳定足以得到令人满意的纯度和回收率。冷却后ph即升高，即使最终的ph在9.2至9.8变化，分离批次的质量也是相似的。使用含热敏元件的wtw，ph3110ph计测定ph。在摄氏20度下校准。

-时间：使晶体在高温下生长，随后以受控的方式缓慢冷却是有益处的。

-醇/水比：虽然在上述实验中使用75％乙醇/水，但是当加入更多的水时也观察到了优良的残余乙醇水平。更多的水可能会从负面意义上影响纯度，但是如果起始物质已经具有了高纯度，那么这并不是那么重要。

-温度：在>73℃下沉淀化合物提供了优良的结果，尤其是如果使沉淀在该温度下成熟。

总的来说，本发明的方法简单，避免了使用不利的溶剂，并避免了几种溶剂的改变。不需要分离化合物a的富马酸盐(或其他酸的)盐；相反，可直接分离化合物a游离碱，并且再沉淀不需要进行干燥。最终反应及最大的再沉淀实验的总产率可观地为43％。残余乙醇显著地<10,000ppm。

分析方法

如下文所述进行hplc分析：a1——用于确定由b*转化至d的hplc方法；a2——用于确定由d和f转化至化合物a，及确定化合物a纯度的hplc方法。

a1：用于由b*转化至d的hplc、ipc方法

梯度条件

近似保留时间

苯酚：...................................2min

d：......................................11.0min

b*：.....................................15.9min

hplc方法a2:

梯度条件

近似保留时间

苯酚：...........................................4.4min

f：..............................................5.1min

d：..............................................6.9min

化合物a的保留时间为10.4min。

根据下文的a3，通过气相色谱法分析确定残余乙醇。

a3：通过gc进行残余乙醇分析

样品洗脱剂：dmso

样品制备：通过超声将准确称量的约100mg的化合物a溶解于约5ml的dmso中。使其冷却并用dmso填充至体积(5.0ml)。

进样针洗涤溶剂：dmso

利用karl-fischer滴定法，使用甲醇/二氯甲烷，3：1作为溶剂进行水分析。萃取时间为180s。

xrpd分析：使用panalyticalxpertpro衍射仪，使用cukαx射线辐射和pixcel检测器系统进行xrpd分析。将样品保持在低密度聚乙烯膜之间，并在室温下以透射模式(transmissionmode)进行分析。仪器参数：范围3-40°2θ，步长0.013°，计数时间99秒，运行时间约22分钟)。使用highscoreplus2.2c软件对xrpd图谱进行分类、操作和索引。