本发明属于医药化工领域，具体地说，本发明涉及布鲁顿(Burton’s)酪氨酸激酶抑制剂。
背景技术：
蛋白质激酶组成人类酶的最大家族之一，并且通过添加磷酸基团到蛋白质上来调节许多不同的信号传递过程(T Hunter，Cell,198750：823-829)。特别地，酪氨酸激酶磷酸化蛋白在酪氨酸残基的酚部分。酪氨酸激酶家族包括控制细胞生长，迁移和分化的成员。异常的激酶活性己经涉及到许多的人类疾病，包括癌症，自身免疫疾病和炎性疾病。
关于B细胞在自身免疫和/或炎性疾病的发病机制中的关键作用存在良好的证据。针对B细胞的基于蛋白质的治疗剂，如Rituxan针对自身抗体导致的炎性疾病如类风湿性关节炎是有效的(Rastetter等，Annu。Rev。Med。200455：477)。因此，在B细胞活化中发挥作用的蛋白质激酶的抑制剂应该是对于B细胞介导的疾病病理如自身抗体生成有用的冶疗剂。
通过B细胞受体(BCR)的信号传递控制一系列细胞应答，包括增殖和分化到成熟的抗体生成细胞。BCR是B细胞活性的关键调节点，并且异常的信号传导可以导致失调的B细胞增殖和病原性自身抗体的形成，其导致多种自身免疫疾病和/或炎性疾病。布鲁顿(Burton’s)酪氨酸蛋白激酶(Btk)是在BCR的膜近端和紧接下游的非BCR相关的激酶。Btk的缺乏己经显示阻断BCR信号传导，因此Btk的抑制可以是阻断B细胞介导的疾病过程的有效的治疗方法。
本发明以开发同时具有优良的抗肿瘤作用以及自身免疫疾病治疗作用的药物为目标,发现了高选择性的Btk抑制剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂及其应用。
本发明的第一方面，提供了具有通式I所示结构的化合物或其药学可接受 的盐，氘代衍生物，或前药：
式中，
R1选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R2选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R3选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
或者R2和R3可一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原子的4-8元环，所述4-8元环为饱和的或不饱和的；
R4选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、C(O)R5，R5选自C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基为取代的或非取代的。
在另一优选例中，所述化合物的结构如式Ia所示：
式中，
R1选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R2选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R3选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
或者R2和R3可一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原子的4-8元环，所述4-8元环为饱和的或不饱和的；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基为取代的或非取代的。
在另一优选例中，所述4-8元环为饱和的。
在另一优选例中，所述4-8元环为不饱和的。
在另一优选例中，所述4-8元环为取代的或非取代的。
在另一优选例中，所述不饱和的4-8元环包括芳香环或非芳香环。
在另一优选例中，所述R2和R3可一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原子的5-6元环，所述5-6元环为饱和的或不饱和的。
在另一优选例中，所述R1选自氢、卤素、C1-4烷基。
在另一优选例中，所述R1选自氢、F、Cl、甲基。
在另一优选例中，所述R2为甲基。
在另一优选例中，所述R3为甲基。
在另一优选例中，所述R2和R3一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原 子的4-8元环。
在另一优选例中，所述R2和R3一起形成6元环，所述6元环为饱和的或不饱和的。
在另一优选例中，所述R2和R3一起形成芳香环。
在另一优选例中，所述化合物选自：
本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
式II化合物与式III化合物和式IV化合物反应生成式I化合物，
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
在惰性溶剂中，将式III-3所示化合物与双联频哪醇硼酸酯反应，制得式III所示化合物；
本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物的用途，(1)用于制备蛋白质激酶抑制剂；和/或(2)用 于制备治疗蛋白激酶相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述蛋白质激酶为布鲁顿(Burton’s)酪氨酸蛋白激酶(Btk)。
在另一优选例中，所述蛋白激酶相关疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病、病理性肥大细胞反应。
在另一优选例中，所述肿瘤包括但不限于：慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌(包括纵隔癌)、口腔上皮癌、鼻咽癌、甲状腺癌、食道癌、淋巴癌、胸腔癌、消化道癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、胆囊癌、胆管癌、中枢神经癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肉癌、脑癌、血癌(白血病)、宫颈癌、胶质瘤、胃癌、或腹水瘤。
在另一优选例中，所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，含有安全有效量的本发明第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物；以及，药学上可接受的载体。
本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制蛋白质激酶的方法，所述方法包括步骤：将本发明第一方面所述的化合物与所述蛋白质激酶接触，从而抑制所述蛋白质激酶的活性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一类能够作为Btk抑制剂的化合物，实验结果表明，所述化合物对Btk具有良好的抑制效果。本发明还提供了上述化合物的制备方法，及其在制备药物中的用途。
术语
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、C1-8烷氧基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、C1-8醛基、C2-10酰基、C2-10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-10烷基、氰基、OH、硝基、C3-10环烷基、C1-8烷氧基、氨基。
除特别说明之处，本发明的所有化合物之中，各手性碳原子(手性中心)可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“C1-8烷基”指具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
如本文所用，术语“C2-8烯基”是指具有2-8个碳原子的直链或支链烯基，例如乙烯基、丙烯基、1,2-丁烯基、2,3-丁烯基、丁二烯基、或类似基团。
如本文所用，术语“C2-8炔基”指具有2-8个碳原子的直链或支链炔基，例如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、或类似基团。
如本文所用，术语“C3-10环烷基”指具有3-10个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。
如本文所用，术语“C1-8烷氧基”指具有1-8个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
如本文所用，术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
如本文所用，术语“C1-4烷氧基羰基”指具有“C1-4烷氧基-C＝O”结构的基团，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基，或类似基团。其中，C1-4烷氧基的定义如前所述。
如本文所用，术语“芳基”，优选为“C6-12芳基”，是指在环内部分具有6-12个碳原子的单环或双环芳香性基团，例如：苯基、联苯基、萘基、或类似基团，其中的每个碳原子均可以被任意取代。
如本文所用，术语“杂芳基”包括氮杂芳基、氧杂芳基、硫杂芳基等。
本发明所述药学上可接受的盐可以是阴离子与式I化合物上带正电荷的基团形成的盐。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲基磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、苹果酸根、甲苯磺酸根、酒石酸根、富马酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、乳酸根、戊二酸根和马来酸根。类似地，可以 由阳离子与式I化合物上的带负电荷的基团(例如羧酸根)形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子，例如四甲基铵离子。在另一优选例中，“药学上可接受的盐”是指同选自下述酸形成的盐类：氢氟酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、草酸、硫酸、甲磺酸、水杨酸、三氟甲磺酸、萘磺酸、马来酸、柠檬酸、醋酸、酒石酸、琥珀酸、酢浆草酸、苹果酸、谷氨酸。
本发明涉及一系列吲哚类衍生物，其作为选择性布鲁顿酪氨酸激酶(Burton‘s tyrosine kinase,BTK)的不可逆抑制剂,可单独使用或与其它治疗药物联合使用以治疗炎症，与异常B细胞增殖相关的自身免疫性疾病(如风湿关节炎)和癌症等。本发明还涉及包含式(I)所示化合物的药物组合物及制备方法，所述化合物在制药中的用途以及本发明化合物预防或治疗哺乳动物(特别是人)与过度Btk活性相关疾病的方法。
活性成分及其药学可接受的盐
本发明提供的具有通式I所示结构的化合物或其药学可接受的盐，氘代衍生物，或前药：
式中，
R1选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R2选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R3选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
或者R2和R3可一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原子的4-8元环，所述4-8元环为饱和的或不饱和的；
R4选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、C(O)R5，R5选自C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；
所述烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基为取代的或非取代的。
在优选地实施方式中，本发明的化合物结构如式Ia所示：
式中，
R1选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R2选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
R3选自氢、卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-10环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2；
或者R2和R3可一起形成包含0-3个选自N、O和S的杂原子的4-8元环，所述4-8元环为饱和的或不饱和的。
制备方法
本发明式I所示化合物的的制备方法，包括步骤：
式II化合物与式III化合物和式IV化合物反应生成式I化合物，
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
在惰性溶剂中，将式III-3所示化合物与双联频哪醇硼酸酯反应，制得式III所示化合物；
药物组合物和施用方法
本发明的化合物可以用作激酶抑制剂，特别是作为Btk的抑制剂，因此其对Btk相关的疾病具有良好的治疗效果。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明化合物的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地0.1毫克/千克至500毫克/千克体重的本发明化合物。此外，本发明的化合物可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限 于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。
当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的本发明的化合物或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
根据本发明的化合物和药物组合物可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病等疾病。
术语“癌症”指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞，组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。癌症疾病的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，肠胃(例如：结肠)，和生殖泌尿道(例如：肾脏，上皮细胞)，咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。
上述方法在治疗不同器官系统恶性肿瘤方面十分有用，该不同的器官例如：感染的肺部，乳房，淋巴，肠胃(例如：结肠)，膀胱，生殖泌尿道(例如：前列腺)，咽头，以及肺鳞癌，这些疾病包括恶性肿瘤，例如大多数的癌 症，肾细胞癌，前列腺癌和/或肿瘤，肺部非小细胞癌，小肠癌和食道癌。
布鲁顿(Burton’s)酪氨酸蛋白激酶(Btk)
关于Btk在自身免疫疾病和炎性疾病中的作用的证据己经由Btk-缺陷型小鼠模型提供。在系统性红斑狼疮(SLE)的临床前鼠模型中，Btk缺陷型小鼠显示疾病进展的显著改善。此外，Btk一缺陷型小鼠对胶原蛋白诱导的关节炎具有抗性(Jasson和Holmdahl，Clin。Exp。Immunol。1993，94：459)。己经证明选择性Btk抑制剂在小鼠关节炎模型中的剂量依赖性功效(Pan等，Chem.Med.Chem.20072：58-61)。
Btk还由除了B细胞之外可能涉及疾病过程的细胞表达。例如，Btk由肥大细胞表达并且Btk缺陷型骨髓来源的肥大细胞显示受损的抗原诱导的颗粒(Iwaki等，J.Biol.Chem.2005280：40261)。这显示Btk可以有效用于治疗病理性肥大细胞反应，如变态反应和哮喘。此外，来自其中缺乏Btk活性的XLA患者的单核细胞显示在刺激后减少的TNFa生成(Horwood等，J.Exp.Med.2003197：1603)。因此TNFa介导的炎症可以由Btk的小分子抑制剂来抑制。此外，己经报道Btk在细胞凋亡中发挥作用(Islam和Smith，Immunol。Rev.2000178:49),因此Btk抑制剂对于治疗某些B细胞淋巴瘤和白血病将是有效的(Feldhahn等,J.Exp.Med.2005201:1837)。
Btk抑制剂,它应用于治疗慢性淋巴细胞白血病,小淋巴细胞淋巴瘤,同时还在临床上试验用于治疗多发性骨髓瘤均取得了良好的效果，它的优秀临床结果和广阔的应用前景昭示着Btk激酶的高选择性小分子抑制剂是全球新药研发领域的一个热点。
本发明的主要优点在于：
(1)首次获得了一类结构新颖的能够作为Btk抑制剂的化合物，实验结果表明，所述化合物对Btk具有良好的抑制效果；
(2)本发明的化合物对自身免疫疾病和炎性疾病有显著的治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下 实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1式A化合物的制备
步骤A：
化合物7-1(25g,0.12mol)溶于CH3CN(250ml)，添加K2CO3(42g，0.23mol)和2-溴乙酸乙酯(30g,0.18mol)。混合物搅拌回流2h，过滤，滤液浓缩后得粗品。将粗品溶于醋酸(250ml)，加入Fe(20g,0.36mol)。混合物在80℃下搅拌2h，然后倒入水中，用乙酸乙酯萃取(3x 200ml)，然后用aq.NaHCO3(6N)洗涤,硅胶柱层析分离纯化(EtOAc/PE＝1:1)得黄色固体化合物7-2(22.2g,85％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)10.8(s,1H),7.0-7.1(m,2H),6.9-7.0(m, 1H),4.6(s,2H).MS(ESI)m/z:227.9/229.9(M+H)+。
步骤B：
将化合物7-2(22g,0.1mol)溶于四氢呋喃(200ml)中，在0℃一滴一滴地添加BH3/四氢呋喃溶液(1.0M，200ml)。然后混合液在回流条件下搅拌过夜。然后在0℃用甲醇缓慢地猝灭反应。混合物浓缩得一粗品直接用于下步反应。
步骤C：
将上步的粗品溶于二氧六环(200ml)中，添加KOAc(15g,0.15mol),Pd(dppf)2Cl2(8.2g,0.01mol)和4,4,4',4',5、5、5',5'-Octamethyl-2,2-bi(1、3、2-dioxaborolane)(38g，0.15mol)，混合物回流搅拌过夜。浓缩得粗品，硅胶柱层析分离(PE：EtOAc＝1：1)纯化得油状化合物7(17.1g,70％).HNMR(400MHz,CDCl3)7.0-7.2(m,2H),6.7-6.8(m,1H),4.2-4.4(m,2H),3.3-3.5(m,2H),1.2-1.4(m,12H).MS(ESI)m/z:262.1(M+H)+。
步骤D：
将化合物1(75g,342.5mmol)在室温溶于硫酸(500ml)中，缓慢地添加硝酸(103.8g，1027mmol)。搅拌18h后,慢慢地倒到超过3公斤的冰中,搅拌，固体过滤，用水清洗，在45℃下减压干燥得化合物2(90g,99.5％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)8.4-8.6(m,1H),7.8-8.0(m,1H).MS(ESI)m/z:262.0/264.0.
步骤E：
将化合物2(4-bromo-5-fluoro-2-nitrobenzoic acid)(90g,340mmol)和盐酸(37％,630ml)混合在630毫升水中,添加氯化锡(II)(230.2g,1020mmol),然后加热至90℃3h。冷却到室温后，形成沉淀,过滤，用水清洗,干燥得化合物3(60g,76％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)7.4-7.6(m,1H),7.0-7.2(m,1H).MS(ESI)m/z:233.9/235.9.
步骤F：
向一个含有化合物3(2-amino-4-bromo-5-fluorobenzoic acid)(50g,214mmol),盐酸(240ml,1M),水(74ml)冷却在盐和冰水浴中的混合液中一滴一滴地添加了79毫升亚硝酸钠水溶液(16.5g,236mmol)(温度低于0℃)。添加完成后，混浊液在盐和冰水浴中搅拌20分钟。然后将7M的氯化锡(II)(145g,641mmol)盐酸(37％,92ml)溶液一滴一滴地添加进去(温度低于0℃)。反应混合物在室温下搅拌1h,混合物减压过滤,固体用水清洗,在45℃减压干燥得白色固体化合物4(30g,48.4％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)7.7-7.8(m,1H),7.5-7.7(m,1H).MS(ESI)m/z:248.9/250.9(M+H)+.
步骤G：
向一个搅拌的(4-bromo-2-hydrazinyl-5-fluorobenzoic acid)(8g，28.1mmol)乙酸(100毫升)溶液中添加丁酮(4.6g,63.8mmol)。然后混合物被加热到70℃搅拌30分钟,然后升温到110℃搅拌过夜,成了一个黑色的液体。混合物过滤得滤液,滤液浓缩后得固体,硅胶柱层析分离纯化(EtOAc:PE:AcOH＝55:40:5)得淡黄色固体化合物5(2.34g,29.3％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)11.0(s,1H),7.4-7.5(m,1H),2.5(s,3H),2.4(s,3H).MS(ESI)m/z:285.9/287.9[M+H]+.
步骤H：
将化合物5(4-bromo-5-fluoro-2,3-dimethyl-1H-indole-7-carboxylic acid)(2.0g,7.0mmol),HATU(3.8g,10.5mmol),NH4Cl(526mg,10.5mmol)溶于二氯甲烷(85ml)中,在0℃搅拌10分钟,然后加入DIPEA(3.9g,30mmol),在0℃搅拌15分钟,然后再室温搅拌2h。浓缩混合物得固体，然后添加水搅拌10分钟得混浊液，过滤,干燥得化合物6(0.9g,45％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)11.0(s,1H),8.4-8.5(m,1H),2.5(s,3H),2.4(s,3H).MS(ESI):m/z 285.0/287.0[M+H]+。
步骤I：
4-bromo-5-fluoro-2
3-dimethyl-1H-indole-7-carboxamide(800mg,2.806mmol),化合物7(783mg,3.0mmol),和Pd(dppf)2cl2(230mg,0.28mmol)溶于DMA(15ml)中,搅拌，用N2脱气半小时。2M的碳酸氢钠(2.8ml)加入,再次脱气半小时后,在N2的条件下,120℃加热2h。然后混合物倒入150毫升水，用二氯甲烷萃取,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品。将此粗品溶解在二氯甲烷(40ml)冷却到-30摄氏度,慢慢地添加丙烯酰氯(0.76g)。滴加完后,室温搅拌1h。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品。硅胶柱层析分离纯化(EtOAc:PE＝1：5到1：1)得粗品,然后由HPLC进一步纯化得A(200mg,18％)。HNMR(400MHz，DMSO-d6)10.5-11(s,1H),8.0-8.1(s,1H),7.4-7.6(m,3H),7.0-7.1(m,2H),6.8-6.9(m,1H),6.2-6.3(m,1H),5.7-5.8(m,1H),4.3-4.5(m,2H),3.9-4.2(m,2H),2.4(s,3H),1.7(s,3H).MS(ESI):394.1。(M+H)+。
实施例2式B化合物的制备
步骤A：
向一个搅拌的(4-bromo-2-hydrazinyl-5-fluorobenzoic acid)(8g，28.1mmol)乙酸(100ml)溶液中添加环己酮(6.3g,63.8mmol)。然后混合物被加热到70℃搅拌30分钟,然后升温到110℃搅拌过夜,成个黑色的液体。混合物过滤得滤液,滤液浓缩后得固体,硅胶柱层析分离纯化(EtOAc:PE:AcOH＝55:40:5)得淡黄色固体化合物8(2.54g,25.7％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)11.0(s,1H),7.4-7.6(m,1H),3.0(m,2H),2.7(m,2H),1.7(m,4H).MS(ESI)m/z:312.0/314.0[M+H]+.
步骤B：
将化合物8(5-bromo-6-fluoro-2、3、4、9-tetrahydro-1H-carbazole-8-carboxylic acid)(2.0g,6.4mmol),HATU(3.8g,10.5mmol),NH4Cl(526mg,10.5mmol)溶于二氯甲烷(85ml)中,搅拌10分钟在0℃,然后加入DIPEA(3.9g,30mmol),在0℃搅拌15分钟,然后再室温搅拌过夜。浓缩混合物得固体，然后添加水搅拌10分钟得混浊液。过滤,干燥得粗品化合物,直接用于下步反应.
上步得到的粗品化合物,化合物7(2.5g,9.6mmol),和Pd(dppf)2cl2(1g,1.3mmol)溶于DMA(20ml)中,搅拌N2脱气半小时。2M的碳酸氢钠(6ml)加入,再次脱气半小时后,在N2的条件下,120℃加热12h。然后混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品，然后由HPLC进一步纯化得淡黄色固体化合物9(800mg,34％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)10.8(s,1H),8.0(m,1H),7.4-7.5(m,2H),6.4-6.8(m,3H),5.8(s,1H),4.0-4.2(m,4H),2.7(m,2H),2.0(m,2H),1.7(m,2H),1.5(m,2H).MS(ESI)m/z:365.1。(M+H)+。
步骤C:
将化合物9(0.8g,2.2mmol)溶解在二氯甲烷(10ml)冷却到-30摄氏度,慢慢地添加丙烯酰氯(0.25g,2.5mmol)。滴加完后,室温搅拌1h。浓缩得粗品。硅胶柱层析分离纯化(EtOAc:PE＝20％到50％)得粗品,然后由HPLC进一步纯化得黄色固体B.HNMR(400MHz，DMSO-d6) 10.9-11(s,1H),8.0-8.1(s,1H),7.4-7.6(m,3H),7.0-7.1(m,2H),6.8-6.9(m,1H),6.2-6.3(m,1H),5.7-5.8(m,1H),4.3-4.5(m,2H),3.9-4.2(m,2H),2.6-2.7(m,2H),2.0-2.2(m,2H),1.5-1.7(m,4H).MS(ESI)m/z:420.1(M+H)+。
实施例3式C化合物的制备
步骤A：
将化合物8(2.5g,8mmol)溶解在甲醇(30ml)中,添加浓硫酸(3ml)，然后回流搅拌18h。冷却,浓缩得粗品,粗品用乙酸乙酯溶解,aq.NaHCO3(6N)洗涤,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品，硅胶 柱层析分离纯化(EtOAc:PE＝1:1)得白色固体化合物10(2.4g,93％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)11(s,1H),7.4(m,1H),3.9(s,3H),2.9(m,2H),2.7(m,2H),1.8(m,4H).MS(ESI)m/z:277.9/279.9(M+H)+。
步骤B：
化合物10(2.0g,7.01mmol)在甲苯(20ml)中添加DDQ(1.86g,8.4mmol),然后搅拌回流48h.浓缩后得粗品,再溶于二氯甲烷和水中,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品.然后由HPLC进一步纯化得黄色固体11(0.8g,36.2％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)11.8(s,1H),8.7(m,1H),7.8-8.0(m,2H),7.6(m,1H),7.4(m,1H),4.0(s,3H).MS:m/z:321.9/323.9[M+H]+
步骤C：
将化合物11(0.8g,2.5mmol)溶于含有NH4OH(10ml)的密封管中，封闭后在130℃搅拌16h。冷却后过滤,固体用水洗涤后,干燥得白色固体化合物12(0.73g,95.1％).HNMR(400MHz，MeOD)8.6(s,1H),7.8(m,1H),7.6(m,1H),7.5(m,1H),7.3(m,1H).MS(ESI)m/z:306.9/308.9(M+H)+。
步骤D：
化合物12(700mg,2.3mmol),化合物7(780mg,3.0mmol),和Pd(dppf)2cl2(188mg,0.23mmol)溶于DMA(15ml)中,搅拌脱气半小时。2M的碳酸氢钠(2.8ml)加入,再次脱气半小时后,在N2的条件下,120℃加热2h。然后混合物倒入水中。用二氯甲烷萃取,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品。将此粗品溶解在二氯甲烷(40ml)冷却到-30摄氏度,慢慢地添加丙烯酰氯(0.7g)，滴加完后,室温搅拌1h。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取,有机相用水洗后,再用饱和盐水洗涤,Na2SO4干燥,过滤,浓缩得粗品。硅胶柱层析分离纯化(EtOAc:PE＝20％到50％)得粗品,然后由HPLC进一步纯化得C(200mg,20％).HNMR(400MHz，DMSO-d6)11.5(s,1H),8.2(m,1H),8.0(m,1H),7.6-7.8(m,3H),7.1-7.4(m,4H),6.7-7.0(m,2H),6.2(m,1H),5.7(m,1H),4.4(m,2H),4.1(m,2H).MS(ESI):416.1。(M+H)+。
实施例4生物活性实验
化合物的生物学活性
对BTK的体外抑制活性(IC50值)的测定
本发明中化合物对BTK的半抑制浓度(IC50)在酶学水平和细胞学水平都进行了测定:在酶活性反应中测定其对BTK激酶活性的抑制能力,同时在细胞学功能分析中测定了化合物对细胞中BCR诱导的钙流的抑制作用。
采用匀相时间分辨荧光(HTRF)方法建立了BTK的激酶活性检测平台,进行化合物活性的测定。将化合物从10uM开始用DMSO进行10倍的梯度稀释(共9个浓度),每个浓度取4uL加入到96uL的反应缓冲液中(50mM HEPES，pH7。4，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.01％Tween-20,0.005％BAS,2mM DTT),取2.5uL加入到384孔板(potiPlate-384,PerkinElmer)，然后加入5uL的BTK激酶 (Millipore)，离心混匀，再加入2.5uL的ATP(终浓度为Km值)与TK peptide(HTRF，Cisbio)混合物启动反应(总体积为10uL)。将384孔板放于孵育箱中23℃反应120分钟,然后加入5uL的Eu3+cryptate-labeled anti-phosphotyrosine抗体(Cisbio),5uL的Streptavidin-XL-665(HTRF,Cisbio)停止反应。在孵育箱中孵育1小时后,在Envision(PerkinElmer)上读取荧光值(320nm激发,检测665nm与615nm的发射光,两者比值为酶活性)。每个化合物分别在9个浓度下测定酶的活性,数据用GraFit6.0软件(Erithacus Software)计算得到该化合物的IC50。
钙流试验使用Fluo-4DirectTM Calcium Assay Kits(Invitrogen)检测试剂盒,测定化合物对细胞内钙库释放的抑制能力。按照检测试剂盒的说明在FlexStation III(Molecular Device)上进行操作,具体步骤如下。Ramos细胞用RPMI-1640(Invitrogen)加10％胎牛血清(Hyclone)培养,离心冲洗后用低血清培养基重新铺到96孔板中(Corning)(1X105细胞/45uL),然后加入45uL的荧光染料(Invitrogen)37C孵育1小时.待检测化合物用DMSO进行3倍的梯度稀释,然后用低血清培养基稀释100倍,取10uL加入到铺好细胞的96孔板(Corning)中(DMSO的终浓度为0.1％),将96孔板放于孵育箱中(37℃,5％CO2)孵育30分钟。化合物处理过的细胞加羊抗-人IgM抗体(10ug/ml,SouthernBiotech)刺激后在FlexStation III上读取荧光值(494nm激发,516nm检测90秒)。每个化合物的数据使用GraphPad Prism5(GraphPad Software)拟合处理,计算得到相应的IC50。
根据本文所述的生物学方法对上述制备的化合物进行分析。其结果显示于下表:
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。