本发明属于药物化学领域，具体涉及一类作为布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂的化合物、其制备方法、含有这些化合物的药物组合物、以及使用这些化合物和药物组合物在制备预防、改善或治疗与布鲁顿酪氨酸激酶有关的疾病中的用途。
背景技术：
酪氨酸激酶是信号转导通路中的重要分子，它的激活与肿瘤的发生发展密切相关，是理想的治疗肿瘤的药物靶标。酪氨酸激酶抑制剂以其高效低度超越了传统化疗药物，成为了抗肿瘤药物研究的热点。
布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)作为一种非受体型酪氨酸激酶，是B细胞发育、激活、信号传导和存活的关键调节物，此外，它在众多其他造血细胞信号传导途径中也起作用。目前，BTK抑制剂单独使用或者与其它治疗药联合使用可用以治疗自身免疫性疾病或病症、异种免疫性疾病或病症、癌症包括淋巴瘤以及炎性疾病或病症等。
现有技术中报道了一些布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，例如，伊布替尼是一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂的首创新药，它能够与BTK形成强有力的共价键，从而抑制恶性B细胞中过度活跃的细胞生存信号的传输，从而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。目前已被开发用于治疗套细胞淋巴瘤。伊布替尼的化学名为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，结构式如下：
技术实现要素：
本发明提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
R1选自氢、烷氧基羰基、烷基羰基；R2选自烷基、环烷基、烷氧基、环烷基氧基、芳基氧基。
在一些实施方案中，R1选自氢、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基。在一些实施方案中，R1选自氢、C1-6烷氧基羰基。在一些实施方案中，R1为氢。
在一些实施方案中，R2选自C1-6烷基、C3-8环烷基、C1-6烷氧基、C3-8环烷基氧基、芳基氧基。在一些实施方案中，R2选自C1-6烷基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基氧基。在一些实施方案中，R2选自C1-6烷基、C1-6烷氧基。
在一些实施方案中，R1选自氢、正丁氧基羰基；R2选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁基氧基、正戊基氧基、1-甲基丁基氧基。
在一些实施方案中，式I化合物选自如下化合物：
本发明另一方面提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等等。
给予本发明化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药。
本发明的药物组合物可以采用本领域周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
本发明提供的化合物(优选实施例化合物)具有布鲁顿酪氨酸激酶抑制活性。
本发明同时提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为自身免疫性疾病，例如炎性肠病、关节炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、奥德甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves disease)、类风湿性关节炎综合征(syndrome)、多发性硬化症、传染性神经元炎(Guillain-Barrésyndrome)、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病(Addison’sdisease)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、强直性脊椎炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻(coeliac disease)、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’s syndrome)、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、莱特尔综合征(Reiter’s syndrome)、高安动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、银屑病、全身脱毛、贝赫切特病(disease)、慢性疲劳、家族性自主神经功能异常、子宫内膜异位、间质性膀胱炎、神经肌强直、硬皮病或外阴痛。
在一些实施方式中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为异种免疫性疾病，例如移植物抗宿主病、移植、输血、过敏反应、变态反应、I型超敏反应、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎或特应性皮炎(atopicdermatitis)。
在一些实施方式中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为炎性疾病，例如哮喘、阑尾炎、睑炎、细支气管炎、支气管炎、粘液囊炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、肝炎、化脓性汗腺炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎心肌炎、肌炎、肾炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肺炎(pneumonia)、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、腱炎、扁桃腺炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎或外阴炎。
在一些实施方式中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为癌症。所述癌症是B细胞增生性疾病，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症 (macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)或淋巴瘤样肉芽肿病。
在进一步的实施方式中，所述与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为血栓栓塞性疾病，例如心肌梗塞、心绞痛、血管成形术后再闭塞、血管成形术后再狭窄、主动脉冠状动脉分流术后再闭塞、主动脉冠状动脉分流术后再狭窄、中风、一过性局部缺血、周围动脉闭塞性疾病、肺栓塞或深部静脉血栓形成。
在具体的实施方式中，所述的与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、边缘B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、毛细胞白血病、乳腺癌、转移性非小细胞肺癌、胰腺癌、实体癌、全身性肥大细胞增多症、移植物抗宿主病、过敏性鼻炎。
在具体的实施方式中，所述的与布鲁顿酪氨酸激酶相关疾病为肺癌、胃癌和胶质瘤。
本发明再一方面提供式I化合物的制备方法：
其中，R1和R2如上定义。
当R1选自氢时，在碱的存在下，伊布替尼与R2-C(＝O)Cl于有机溶剂中反应生成式I化合物。
当R1选自烷氧基羰基或烷基羰基时，在碱的存在下，伊布替尼于有机溶剂中可依次与R2-(C＝O)Cl和R1-Cl反应生成式I化合物。
上述反应还可以加入催化剂例如4-二甲氨基吡啶(DMAP)以加速反应进行。
其中，所述碱选自吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钾、碳酸钠，乙醇钠、甲醇钠。
其中，反应溶剂选自苯、甲苯、二氯甲烷、醋酸乙酯、三氯甲烷。
其中，反应在室温下进行。
本发明的化合物或其盐可以作为活性物质单独给药，优选以其药物组合物的形式给药。
除非另有说明，本发明所使用的术语具有下述含义。
“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和脂肪烃基团，其通过单键与分子的其余部分连接。烷基优选为具有1-6个碳原子的烷基(也可表示为C1-6烷基)，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基。
“烷氧基”是指烷基-O-基团。
“环烷基”是指由碳原子和氢原子组成的饱和的或不饱和的非芳香性的环状烃基，可以是单环或稠合多环结构。环烷基的非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“环烷基氧基”是指环烷基-O-基团。
“烷氧基羰基”是指具有烷氧基取代的羰基，即烷基-O-C(＝O)-基团。
“烷基羰基”是指具有烷基取代的羰基，即烷基-C(＝O)-基团。
“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与药学上可接受的无机或有机酸形成的盐，这些盐包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐和苯磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐和水杨酸盐、丙二酸盐、己二酸盐、己酸盐、精氨酸盐、富马酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐等。
“药物组合物”是指一种或多种本发明的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本发明的化合物。
“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些载体。“药学上可接受的载体”是指与活性成份一同给药的、有利于活性成份给药的惰性物质，包括但不限于国家食品药品监督管理局许可的可接受的用于人或动物(例如家畜)的任何助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。所述载体 的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
具体实施方式
本发明提供的化合物可以通过多种制备方法来合成，实施例中仅提供了合成这些化合物的代表性方法。具体实施例的目的是进一步说明本发明内容但不意味着对本发明进行限制。
本发明具体实施例中使用的初始原料、反应试剂等均为市售产品。
伊布替尼可参考已经公开的文献例如CN101610676制备得到。
实施例1化合物1的合成
伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)于二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，搅拌溶清，得黄色透明溶液，15℃下，滴加氯甲酸甲酯(4ml)的二氯甲烷溶液。反应2h后，加20ml水终止反应，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合并有机相，有机相用20ml水洗涤3次，分出有机相，无水硫酸镁干燥。抽滤，滤液30℃以下旋蒸干，层析柱分离，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脱，得化合物1。
MS m/z:499.37[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：8.801(s,1H)，7.906(s,1H)，7.662(s,2H)，7.430～7.391(m,3H)，7.285～9.193(m,3H)，7.121(d,j＝7.6Hz,2H)，6.613(s,1H)，6.356～6.284(m,1H)，5.754～5.696(m,1H)，4.967～4.903(m,1H)，4.635～4.597(m,1H)，3.697(s,3H)，2.064～1.986(m,4H)，1.779～1.751(m,2H)
实施例2化合物2的制备
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸异丙酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物2。
MS m/z:527.23[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.793(s,1H)，7.688～7.658(m,3H)，7.431～7.392(m,2H)，7.217～7.177(m,3H)，7.117(d,j＝8.0Hz,2H)，6.616(s,1H)，6.356～6.328(m,1H)，5.734～5.704(m,1H)，4.957～4.896(m,3H)，3.849～3.788(m,1H)，3.457～3.429(m,1H)，3.237～3.233(m,1H)，3.202～2.934(m,1H)，2.430～2.289(m,1H)，2.068～2.027(s,1H)，1.629(s,1H)，1.301～1.253(m,6H)
实施例3化合物3的制备
伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)于二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，搅拌溶清，得黄色透明溶液，15℃下，滴加氯甲酸正丁酯(5ml)的二氯甲烷溶液。反应2h后，加20ml水终止反应，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合并有机相，有机相用20ml水洗涤3次，分出有机相，无水硫酸镁干燥。抽滤，滤液30℃以下旋蒸干，层析柱分离，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脱，得化合物3。
MS m/z:641.01[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.935(s,1H)，7.635(d,j＝14Hz,3H)，7.415～7.286(m,2H)，7.192～7.155(m,3H)，7.100～7.070(m,2H)，6.695～6.600(m,1H)，6.375～6.334(m,1H)，5.788～5.679(m,1H)，5.021～4.986(m,2H)，4.042～3.978(m,4H)，3.862～3.789(m,1H)，3.414～3.402(m,1H)，3.290～3.199(m,1H)，3.266～3.188(m,1H)，2.974～2.889(m,1H)，2.334～2.310(m,2H)，2.059～1.802(m,2H)，1.669～1.649(m,1H)，1.494(d,j＝18.4Hz,4H)，0.970(s,6H)
实施例4化合物4的合成
伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)于二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，搅拌溶清，得黄色透明溶液，15℃下，滴加乙酰氯(4ml)的二氯甲烷溶液。反应2h后，加20ml水终止反应，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合并有机相，有机相用20ml水洗涤3次，分出有机相，无水硫酸镁干燥。抽滤，滤液30℃以下旋蒸干，层析柱分离，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脱，得化合物4。
MS m/z:483[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.685(s,1H)，8.183(s,1H)，7.642(d,j＝7.8Hz,2H)，7.429～7.390(m,2H)，7.210～7.172(m,3H)，7.125(d,j＝8.4Hz,2H)，6.636～6.544(m,1H)，6.348～6.289(m,1H)，5.755～5.670(m,1H)，4.951～4.889(m,1H)，4.636～4.610(m,1H)，2.549(s,3H)，2.302～2.278(m,3H)，2.059～2.021(m,2H)，1.780～1.748(m,2H)
实施例5化合物5的合成
参考实施例4中化合物4的合成方法，使用异丁酰氯代替乙酰氯，制备得到化合物5。
MS m/z:511.2[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.746(s,1H)，8.130(s,1H)，7.649(d,j＝8.4Hz,2H)，7.211～7.163(m,3H)，7.106(d,j＝7.8Hz,2H)，6.658～6.548(m,1H)，6.358～6.290(m,1H)，5.766～5.703(m,1H)，4.942～4.622(m,2H)，3.804～3.787(m,1H)，3.417～3.232(m,1H)，2.992～2.888(m,2H)，2.438～2.305(m,2H)，2.065～2.021(m,2H)，1.781(m,2H)，1.176(d,j＝6.8Hz,6H)
实施例6化合物6的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸乙酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物6。
MS m/z:513[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.780(s,1H),7.684(s,2H)，7.425～7.385(m,3H)，7.190～7.169(m,3H)，7.112(d,j＝7.8Hz,3H)，6.682～6.543(m,1H)，6.357～6.285(m,1H)，5.759～5.733(m,1H)，4.939～4.909(m,2H)，4.728～4.202(m,1H)，3.813～3.810(m,1H)， 3.416～3.228(m,2H)，3.228～2.935(m,1H)，2.434～2.284(m,2H)，2.022～1.812(s,2H)，1.780～1.727(m,2H)
实施例7化合物7的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸正丙酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物7。
MS m/z:527.1[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.794(s,1H)，7.855(s,1H)，7.685(d,j＝7.6Hz,2H)，7.429～7.390(m,2H)，7.214～7.177(m,3H)，7.118(d,j＝8.8Hz,2H)，6.656～6.574(m,1H)，6.360～6.291(m,1H)，5.763～5.675(m,1H)，4.959～4.608(m,2H)，4.229(d,j＝0.8Hz,1H)，4.151～4.037(m,3H)，3.810(m,3H)，3.422～3.230(m,2H)，1.688～1.647(m,2H)，1.351～1.280(s,3H)
实施例8化合物8的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸异丁酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物8。
MS m/z:541.1[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.788(s,1H)，7.682～7.613(m,2H)，7.428～7.389(m,2H)，7.217～7.170(m,3H)，7.113～7.096(m,2H)，6.651～6.549(m,1H)，6.357～6.290(m,1H)，5.763～5.674(m,1H)，4.984～4.898(m,2H)，3.899(d,j＝6.8Hz,2H)，2.939(m,1H)，2.755(m,1H)，2.498～2.067(m,3H)，2.025～1.955(m,2H)，1.816～1.639(m,2H)，1.298～1.280(m,6H)
实施例9化合物9的合成
参考实施例4中化合物4的合成方法，使用正戊酰氯代替乙酰氯，制备得到化合物9。
MS m/z:525.2[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.715(s,1H)，8.119(s,1H)，7.639(d,J＝7.8Hz,2H)，7.434～7.394(m,2H)，7.191～7.170(m,3H)，7.123(d,j＝7.8Hz,3H)，6.642～6.574(m,1H)，6.354～6.290(m,1H)，5.761～5.698(m,1H)，4.623(m,1H)，3.801(m,1H)，3.415～3.228(m,1H)，2.919(m,1H)，2.777～2.764(m,2H)，2.303～2.066(m,2H)，1.781(s,2H)，1.677～1.622(m,4H)，1.338～1.297(m,3H)
实施例10化合物10的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸正戊酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物10。
MS m/z:555.62[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.744(s,1H)，7.656～7.635(m,1H)，7.379～7.344(m,2H)，7.184～7.177(m,3H)，7.155～7.045(m,2H)，6.667～6.568(m,1H)，6.330～6.288(m,1H)，5.713～5.674(m,1H)，4.957～4.868(m,2H)，2.379～2.212(m,4H)，2.059～1.979(m,2H)，1.881～1.687(m,2H)，1.661～1.642(m,3H)，1.403～1.308(m,3H)，1.308～1.236(m,6H)
实施例11化合物11的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸异戊酯代替氯甲酸甲酯，制备得到化合物11。
MS m/z:555.44[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.742(s,1H)，7.669～7.639(m,1H)，7.387～7.352(m,2H)，7.199～7.188(m,3H)，7.166～7.125(m,2H)，6.698～6.518(m,1H)，6.336～6.297(m,1H)，5.728～5.699(m,1H)，4.978～4.887(m,2H)，2.389～2.222(m,4H)，2.129～1.989(m,2H)，1.852～1.677(m,2H)，1.652～1.638(m,3H)，1.400～1.355(m,3H)，1.318～1.276(m,6H)
实施例12化合物12的合成
参考实施例4中化合物4的合成方法，使用丙酰氯代替乙酰氯，制备得到化合物12。
MS m/z:497.47[M+H]
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.872(s,1H)，7.652(d,J＝7.8Hz,2H)，7.431～7.396(m,2H)，7.220～7.180(m,3H)，7.130(d,J＝8.4Hz,2H)，6.640～6.540(m,1H)，6.349～6.290(m,1H)，5.752～5.671(m,1H)，4.952～4.889(m,2H)，4.647～4.619(m,1H)，3.853～3.781(m,1H)，3.422(s,1H)，3.240(s,1H)，2.555(s,1H)，2.309～2.279(m,1H)，2.060～2.030(m,4H)，1.200～1.188(m,3H)
实施例13测定本发明化合物对体外细胞增殖的抑制活性
A549细胞、N87细胞和U251细胞均由购买获得。以下为一般性实验步骤：
取处于指数生长期、状态良好的贴壁细胞，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗两遍，加入0.05％胰蛋白酶消化液(Gibco公司，货号25300-062)2ml，消化使贴壁细胞脱落，再加入2ml完全培养基(含10％胎牛血清，Gibco公司，货号：10099-141)终止消化。
取出消化好的细胞悬液离心，1000转/分钟，离心5分钟，培养基重悬后计数至所需浓度后，接种至96孔细胞培养板；对于悬浮细胞，直接取细胞悬液离心，1000转/分钟，离心5分钟，培养基重悬后计数至所需浓度，每孔100μL接种至96孔细胞培养板。CO2培养箱中(Thermo公司，型号371)培养24小时，配制待测化合物，使其浓度为终浓度的10倍，加入到细胞培养板中，11μL/孔，CO2培养箱中继续培养72小时，期间贴壁细胞使用活细胞工作站进行实时拍照，8小时拍照一次，软件计算其融合度，根据融合度值的大小计算抑制率，悬浮细胞使用CCK-8(Dojindo公司，货号：CK04)检测试剂进行检测，每孔加入10μL，37℃孵育3小时，全波长酶标仪(Thermo公司，型号Varioskan Flash)在450nm处读取吸光值，计算抑制率。采用四参数拟合方式，对检测结果的抑制率拟合曲线计算IC50值，结果如下表1、2、3。
表1
表2
表3
实施例14测定本发明化合物的药代动力学
取健康的SD雄性大鼠，体重200～220g，每天定时饲以大鼠标准配方颗粒饲料，实验前禁食12h，给药后4h恢复供食，实验前后和实验过程中均自由饮水。
随机分组，每组4只，分别单剂量灌胃给予待测化合物。每组大鼠的给药剂量均按摩尔浓度折算为相当于依布替尼20mg/kg，分别于给药前(0h)和给药后0.0833、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、24h由眼底静脉丛取血约0.2～0.3ml，EDTA-K2抗凝，离心分离血浆，准确量取50μL，加入500μL内标溶液，用涡旋混合器高速混匀3min，离心10min(4℃，13800rpm)，收集上清液，转移100μL上清液至进样瓶，LC-MS/MS进样0.5μL检测，记录色谱图，得到每个时间点的血浆中的血药浓度。
根据所得的给药后平均血药浓度-时间数据，采用Winnonin软件，按非房室统计矩理论求算相关药代动力学参数，详见下表4、5、6、7。
表4
表5
表6
表7