鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及一种治疗肝纤维化的药物，尤其涉及一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术：

肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ecm)大量合成、分泌，但对其降解绝对或相对不足，使细胞外基质在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞坏死，随之是炎症反应、炎症因子和促纤维化因子释放，肝星状细胞(hsc)被激活，最终使肝脏胶原的合成与降解过程两者明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理结果。目前，各种研究证明，在肝纤维化的发展过程中，肝脏内炎症反应和胶原沉积是产生肝脏纤维化的最主要的原因。

近来研究表明：鞘氨醇激酶(sphk)信号通路介导了多器官和组织(如肺，肾、心、肝和皮肤)的纤维化过程；并且s1p的促纤维化作用与pi3k/akt和smad信号通路活化相关。鞘氨醇激酶(sphk)是催化s1p生成的关键限速酶。其中，s1p是一种具有广泛生物活性的鞘磷脂，调控着细胞增殖、转化、存活、迁移以及血管形成等。sphk1可被多种外界刺激因素激活，例如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、血小板源性生长因子、神经生长因子、佛波酯，导致细胞内s1p浓度的增加。

肝纤维化研究显示：s1p能够诱导hscs增殖和迁移到肝脏损伤部位。s1p能够上调人hscs细胞株lx-2的α-sma和胶原的表达。hscs表达s1p1-3三个受体亚型，并且s1p1和s1p3参与了hscs的增殖和迁移过程；同时s1p还可上调sphk1和其受体s1p1和s1p3。tgf-β1通过激活sphk1促进骨髓干细胞向肌成纤维细胞转化。tgf-β1还可诱导胞内s1p增加，进而上调胶原表达。在胆管结扎(bdl)和四氯化碳(ccl4)诱导的小鼠肝脏中s1p合成增加。因此，通过使用鞘氨醇激酶的抑制剂减少s1p生成，有望成为肝纤维化的一种有效治疗手段。

近年陆续出现了一些抗肝纤维化治疗的方法，包括化学药、生物制剂、中药与基因疗法等，但是理想的临床治疗手段仍然缺乏。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相关的环节，主要是减轻肝损伤、抑制形状细胞激活、减少细胞外基质产生、调节细胞因子紊乱、促进活化肝星状细胞凋亡、抑制肝脏成纤维细胞的增殖等手段。但上述手段存在治疗机理单一、治疗效果不理想的问题。

为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用，所述鞘氨醇激酶抑制剂在制备抑制因四氯化碳(ccl4)诱导的肝纤维化的药物中的应用，所述鞘氨醇激酶抑制剂为sphk1抑制剂5c或sphk2抑制剂abc294640或sphk抑制剂ski-ii。

其中，所述sphk1抑制剂5c为鞘氨醇激酶1抑制剂；所述sphk2抑制剂abc294640为鞘氨醇激酶2抑制剂；所述sphk抑制剂ski-ii为鞘氨醇激酶sk抑制剂。

基于上述，所述鞘氨醇激酶抑制剂在制备抑制因肝星形细胞活化诱导的肝纤维化药物中的应用。

其中，鞘氨醇激酶抑制剂通过抑制肝星状细胞的活化与肝脏中胶原的沉积，从而抑制了肝纤维化的发展。

基于上述，所述鞘氨醇激酶抑制剂在制备抑制因肝脏中炎症反应和胶原沉积诱导的肝纤维化药物中的应用。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说：本发明将现有鞘氨醇激酶抑制剂中的sphk1抑制剂5c或sphk2抑制剂abc294640或sphk抑制剂ski-ii发掘出了新的药用价值，将其应用于制备治疗肝纤维化的药物方面，从而为制备治疗肝纤维化的药物提供了一种新来源。

需要说明的是：本专利技术受国家自然科学基金重点项目(81530102)、广东省自然科学基金重点项目(2016a030311014)、广东省科技计划(2017a020211007)资助。

附图说明

图1为从培养后的空白对照组a1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行苏木素-伊红染色后的肝脏切片图。

图2为从培养后的抑制剂阴性对照组b1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行苏木素-伊红染色后的肝脏切片图。

图3为培养后的实验组c1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行苏木素-伊红染色后的肝脏切片图。

图4为培养后的实验组d1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行苏木素-伊红染色后的肝脏切片图。

图5为培养后的实验组e1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行苏木素-伊红染色后的肝脏切片图。

图6为培养后的空白对照组a1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行天狼猩红染色法染色后的肝脏切片图。

图7为培养后的抑制剂阴性对照组b1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行天狼猩红染色法染色后的肝脏切片图。

图8为培养后的实验组c1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行天狼猩红染色法染色后的肝脏切片图。

图9为培养后的实验组d1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行天狼猩红染色法染色后的肝脏切片图。

图10为培养后的实验组e1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠进行天狼猩红染色法染色后的肝脏切片图。

图11为从培养后的空白对照组a1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中ɑ平滑肌肌动蛋白表达结果。

图12为从培养后的抑制剂阴性对照组b1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中ɑ平滑肌肌动蛋白表达结果。

图13为从培养后的实验组c1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中ɑ平滑肌肌动蛋白表达结果。

图14为从培养后的实验组d1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中ɑ平滑肌肌动蛋白表达结果。

图15为从培养后的实验组e1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中ɑ平滑肌肌动蛋白表达结果。

图16为从培养后的空白对照组a1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中巨噬细胞表面标志物表达结果。

图17为从培养后的抑制剂阴性对照组b1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中巨噬细胞表面标志物表达结果。

图18为从培养后的实验组c1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中巨噬细胞表面标志物表达结果。

图19为从培养后的实验组d1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中巨噬细胞表面标志物表达结果。

图20为从培养后的实验组e1中任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图中巨噬细胞表面标志物表达结果。

图21为分别从培养后的空白对照组a1、抑制剂阴性对照组b1，实验组c1，实验组d1，实验组e1任意选取的一只雄性c57bl/6小鼠检测到的血清谷丙转氨酶serum-alt含量对比柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。下列实施例中未注明具体试验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商建议的条件。

实施例1

本实施例提供一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用进行临床使用。所述鞘氨醇激酶抑制剂为sphk1抑制剂5c。

所述sphk1抑制剂5c购自于聚研生物医药科技有限公司(cayman中国)，产品编号为：cay10621(5c)，其分子量为435.6，分子式为c26h45no4，分子结构式为：

实施例2

本实施例提供一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用进行临床使用。所述鞘氨醇激酶抑制剂为sphk2抑制剂abc294640。所述sphk2抑制剂abc294640购自于上海蓝木生物科技有限公司(selleck中国)，其分子量为380.91，分子式为c23h25cln2o，其结构式如下：

实施例3

本实施例提供一种鞘氨醇激酶抑制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用进行临床使用。鞘氨醇激酶抑制剂为sphk抑制剂ski-ii。所述sphk抑制剂ski-ii购自于上海蓝木生物科技有限公司(selleck中国)，其分子量为302.78，分子式为c15h11cln2os，其结构式如下：

药效学实验验证：

将50只雄性c57bl/6小鼠随机分为5组，每组10只，具体为空白对照组a1、抑制剂阴性对照组b1，实施例1提供的sphk1抑制剂组c1，实施例2提供的sphk2抑制剂组d1和实施例3提供的sphk抑制剂组e1。

其中，空白对照组a1中的10只小鼠按照体重1ml/kg的注射标准通过腹腔注射玉米油溶液，每周注射2次，共注射6周。

抑制剂阴性对照组b1，sphk1抑制剂组c1，sphk2抑制剂组d1和sphk抑制剂组e1中的各小鼠按照体重1ml/kg的标准通过腹腔注射质量浓度为20％的ccl4玉米油溶液，每周注射2次，共注射6周。

同时，sphk1抑制剂组c1中各小鼠还通过腹腔注射5mg/kg的sphk1抑制剂5c，每周3次，共注射6周。sphk2抑制剂组d1中各小鼠还通过腹腔注射5mg/kg的sphk2抑制剂abc294640，每周3次，共注射6周。sphk抑制剂组e1中各小鼠还通过腹腔注射5mg/kg的sphk抑制剂ski-ii，每周3次，共注射6周。实验期间观察上述50只雄性c57bl/6小鼠活动情况和精神状况。

(1)肝脏切片检测

注射6周后，分别采用苏木素-伊红染色法、天狼猩红染色法对培养后的上述50只雄性c57bl/6小鼠的肝组织切片进行染色，并标记出平滑肌肌动蛋白和巨噬细胞表面标志物，检测结果如图1至图20所示。

具体地，对培养后的雄性c57bl/6小鼠的肝脏进行苏木素-伊红染色结果如图1至图5所示，其中，对肝脏进行苏木素-伊红染色主要是为了从病理结果中反应出肝脏中的肝纤维化严重程度，染色结果可以标记出炎症细胞的浸润与肝细胞的坏死。

从图1至图5可以看出：相比较空白对照组a1，经过ccl4诱导后的抑制剂阴性对照组b1中雄性c57bl/6小鼠和实验组c1，d1，e1中雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图显示出了较多的浸润的炎症细胞和坏死的肝细胞。而抑制剂阴性对照组b1与实验组c1，d1，e1相比，实验组c1中的雄性c57bl/6小鼠注射有sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii，其肝脏切片图中的浸润的炎症细胞和坏死的肝细胞比抑制剂阴性对照组b1明显减少。

对培养后的雄性c57bl/6小鼠的肝脏进行天狼猩红染色，结果如图6至图10所示，其中，对肝脏进行天狼猩红染色法主要是对于肝脏中的胶原进行染色，胶原可以被染成红色，进而可以反应出胶原的堆积程度。

从图6至图10中可以看出：相比较空白对照组a1，经过ccl4诱导后的抑制剂阴性对照组b1中雄性c57bl/6小鼠和实验组c1，d1，e1中雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图显示出了较多的胶原。而抑制剂阴性对照组b1与实验组c1，d1，e1相比，实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠注射有sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii，实验组c1，d1，e1中的肝脏切片图中的胶原堆积程度比抑制剂阴性对照组b1明显减轻。

请参阅图11至图15可以看出：相比较空白对照组a1，经过ccl4诱导后的抑制剂阴性对照组b1中雄性c57bl/6小鼠和实验组c1，d1，e1中雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图显示出了较多的ɑ平滑肌肌动蛋白。抑制剂阴性对照组b1与实验组c1，d1，e1相比，实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠注射有sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii，实验组c1，d1，e1中的肝脏切片图中的ɑ平滑肌肌动蛋白占比明显比抑制剂阴性对照组b1明显减少。

请参阅图16至图20中可以看出：相比较空白对照组a1，经过ccl4诱导后的抑制剂阴性对照组b1中雄性c57bl/6小鼠和实验组c1，d1，e1中雄性c57bl/6小鼠的肝脏切片图显示出了较多的巨噬细胞表面标志物。抑制剂阴性对照组b1与实验组c1，d1，e1相比，实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠注射有sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii，实验组c1，d1，e1中的肝脏切片图中的巨噬细胞表面标志物占比比抑制剂阴性对照组b1明显减少。

综上所述，通过比较实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠培养结果与抑制剂阴性对照组b1中的雄性c57bl/6小鼠培养结果，可以得出：实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠肝组织中纤维化区域的胶原堆积与炎症细胞浸润明显减少，活化的肝星状细胞数目也明显减少。由此可见，sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii能够抑制ccl4诱导的小鼠的肝纤维化发展和抑制因肝星形细胞活化诱导的肝纤维化发展。

(2)血清谷丙转氨酶alt检测

注射6周后，采用生化分析仪检测培养后的上述50只雄性c57bl/6小鼠血清中的血清谷丙转氨酶alt含量，结果如图21所示。

从图21中可以看出：相比较空白对照组a1，经过ccl4诱导后的抑制剂阴性对照组b1中的雄性c57bl/6小鼠和实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠体内的血清谷丙转氨酶alt含量明显增加。

实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠因分别注射有sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii，实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠体内的血清谷丙转氨酶alt含量比抑制剂阴性对照组b1明显降低。

综上所述，通过比较实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠培养结果与抑制剂阴性对照组b1中的雄性c57bl/6小鼠培养结果，可以得出：实验组c1，d1，e1中的雄性c57bl/6小鼠肝组织中纤维化区域的胶原堆积与炎症细胞浸润明显减少，活化的肝星状细胞数目也明显减少，血清alt水平也明显降低。由此可见，sphk1抑制剂5c，sphk2抑制剂abc294640，sphk抑制剂ski-ii能够抑制因肝脏中炎症反应和胶原沉积诱导的肝脏损伤和纤维化的发展。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。