专利名称：新型的减毒铜绿假单胞菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型的减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株，用于铜绿假单胞菌感染的预防疫苗和治疗剂，以及制备它们的方法。更具体地说，本发明涉及新型的减毒铜绿假单胞菌菌株，该菌株是通过根据Fisher-Devlin免疫型(immunotype)分离纯态铜绿假单胞菌，然后经连续通过小鼠而重复纯化被分离的菌株而获得的，由从减毒铜绿假单胞菌株分离出的细胞壁蛋白制备的预防疫苗和由该细胞壁蛋白诱导的治疗性免疫球蛋白，以及制备它们的方法。
铜绿假单胞菌为可移动的革兰氏阴性棒状菌，大约0.5μm×1.5～3.0μm，具有单生鞭毛，广泛存在于土壤、水、污物以及人类肠内(Mol.Microbiol4，1069～1075，1990)。铜绿假单胞菌是一种导致慢性感染，例如败血病、全身化感染、慢性呼吸道感染和胰腺的囊纤维化等的致病菌。由铜绿假单胞菌引起的败血病是一种由该微生物自身侵入或该微生物的毒性组分分泌至病人血液中导致的疾病，该病人因为手术、伤口、外伤等抵抗力下降。毒素的存在引起高烧休克、血压下降和其它一些最终可能导致死亡的症状。另外，由于在尿道感染中已检出铜绿假单胞菌，人们对铜绿假单胞菌越来越感兴趣。因此，迫切需要研制开发出一种能有效预防或治疗由铜绿假单胞菌引起的慢性化脓性疾病如败血病和尿道感染的药剂。然而，铜绿假单胞菌菌株对绝大多数抗生素都有抗性，而且至今仍未研制出一种对铜绿假单胞菌感染有效的预防剂或治疗剂。因此，铜绿假单胞菌感染的毒力不断增加。
铜绿假单胞菌菌株能按多种方式分类。一种分类系统根据Fisher免疫型将菌株分成7类。另一系统以Terada提出的O-抗原组为基础。还有一种是国际抗原分型纲要(IATS)分类系统。根据该分类系统，最常出现于被铜绿假单胞菌感染的病人中的铜绿假单胞菌菌株是根据Fisher免疫型/O-血清型的是5/2a、2c、3、7/3a、3c、1/4a、4b、6/5a、5b、4/6、2/7a、7b、7c、/10a、/13、/12、/11和3、7/3d、3e型，其中主要存在的是Fisher免疫型中的3、7、2和1型(对应于O-血清型中的3a、3c、3d、3e、7a、7b、7c和4a和4b)。
一种治疗铜绿假单胞菌感染的方法是用抗毒素中和铜绿假单胞菌毒素。然而，抗毒素是一种仅对已患有败血病的病人有益而无预防效果的治疗剂。而且，现有的抗毒素很昂贵且其用途有限。另外，伴随着抗毒素使用的最大缺点在于相当低的治愈率和随之而来的严重副作用。
正在研究的一种避免与抗毒素相关缺点的方法是使用一种通用抗原以预防和治疗铜绿假单胞菌的感染。正在研究的用于获取该通用抗原的方法一般可分为二类。第一类方法涉及使用一种从具有不同免疫型的铜绿假单胞菌中分离和纯化的通用抗原作为抗铜绿假单胞菌感染的预防疫苗抗原[Japan，J.Exp.Med.45，355～359，1975]。第二类方法涉及使用通过基因工程技术而生产的通用抗原簇。在该基因工程技术中，将为所需抗原编码的基因分离并将其插入至合适的载体以获得重组载体，然后用所得到的重组载体转化合适的宿主并温育以表达所需的抗原。
尽管开发一种使用通用抗原的预防疫苗在理论上是非常有效的方法，但是目前涉及该方法的研究进程表明这种方法还有许多未解决的问题。主要的缺点是通用抗原不能预防具有不同免疫型的铜绿假单胞菌的所有类型。因此其有效性也就相当低。这样低的有效性意味着除通用抗原以外还存在另一种未知主抗原可能会引发有效的预防效果。
治疗铜绿假单胞菌感染的另一种方法是施用对铜绿假单胞菌菌株具有广谱选择性的抗生素或化学治疗剂。然而，因为有许多种铜绿假单胞菌菌株，而且它们一般具有很强的抗药性，所以许多病人死于不能用抗生素有效治疗的铜绿假单胞菌菌株。
另外，已经开发出一种使用治疗性免疫球蛋白的方法。但是，这种免疫球蛋白对所有铜绿假单胞菌感染没有或只有很小的治疗效果，因此仅被用于非常有限的铜绿假单胞菌感染类型。这主要是由于免疫球蛋白是根据对某种特定微生物而制备多克隆抗体的方法来制备，因而它一般不能作用于多种铜绿假单胞菌菌株。
人们已经试图开发一种抗铜绿假单胞菌的具有鼠单克隆抗体[J.Inf.Dis.152，1290～1299，1985]或具有人单克隆抗体[FEMSMicrobiol.Immunol.64，263～268，1990]的廉价治疗剂。其中，用细胞融和技术从细胞库中选择细胞系以生产最有效的中和性抗体，然后将细胞系用作起始物质以工业化生产所需的抗体。然而，该方法的目的是通过生产抗体治疗铜绿假单胞菌感染，而不是预防疫苗。另外，该方法有个缺点即因为所有感染是由具有不同血清学型和免疫学型的不同铜绿假单胞菌株引起的，它们就不能都只用一种单克隆抗体来治疗。也就是说，单克隆抗体治疗法不能有效地用于治疗所有铜绿假单胞菌感染的患者。
为了扩大这种方法的有效治疗，已经开发了同时施用多种类型的抗体，它基于这些抗体已调查过的交叉反应性。其中，收集来自铜绿假单胞菌感染的患者的血，并检验以鉴定该感染铜绿假单胞菌菌株的血清学类型和/或免疫学类型。然后让病人施用适合于该鉴定类型的单克隆抗体。但是，该方法需要许多时间，因此不能用于那些病情急需治疗的患者。
在现有技术中，已经提出将铜绿假单胞菌菌株中分离的细胞壁蛋白用作疫苗的抗原[参见Vaccine，Vol.7“ExperimentalstudiesontheprotectiveefficacyofaPseudomonasaeruginosavaccine”，1988]。但是，上述参考文献中提出的方法使用四种普通铜绿假单胞菌菌株，即NN170041、NN170015、NN868和NN170046，它们是未减毒的，因此就出现了与铜绿假单胞菌菌株自身毒性相关的问题。另外，因为在从这样的铜绿假单胞菌菌株制备蛋白质组合疫苗的过程中，细胞可能被破坏将存在于细胞质中的异源核酸和毒性高分子物质，脂多糖(LPS)释放到培养基中。然后这些物质就作为杂质被混入制成的疫苗中，这使得在使用该疫苗时需要更小心谨慎，同时也可能限制了其用途。
因此，本发明人广泛地研究以找到能有效诱导抗铜绿假单胞菌抗体的工具，该工具表现有良好的致免疫(即抗原)活性而几乎没有因为铜绿假单胞菌菌株自身内在毒性而产生的危险。因此，本发明人证实，当从被铜绿假单胞菌感染的病人中分离出的铜绿假单胞菌菌株按照它们的免疫型而被分成7种，然后将每种纯菌株经多次通过合适的动物宿主从而使该种纯菌株减毒时，就能获得新型、安全且减毒的铜绿假单胞菌菌株。这些菌株的细胞壁蛋白，不仅在制备用于抗铜绿假单胞菌感染的预防疫苗中有用，而且也能被用作抗体诱导物从而在动物体内产生用于铜绿假单胞菌感染的免疫球蛋白。根据本发明，所产生的免疫球蛋白对多种铜绿假单胞菌感染包括严重的情况均表现优异的治疗效果。
因此，本发明的一个目的是提供一种新型、安全且减毒的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有能显示抗原性而无铜绿假单胞菌菌株自身毒性的细胞壁蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种诱导免疫应答的疫苗以使接受该疫苗的患者防止因铜绿假单胞菌所引起的随发疾病。
本发明的另一个目的是提供一种制备该疫苗的方法。
本发明还有一个目的是提供一种用于治疗铜绿假单胞菌感染的治疗剂，该治疗剂包含至少一种用于铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白。
本发明还有一个目的是提供一种制备该免疫球蛋白的方法。
前述已概括了本发明更贴切的一些目的。这些目的应仅仅被理解为本发明更贴切的一些特征和应用的例证。通过在该公开范围内以不同方式应用本公开的发明或改型本发明均能获得许多其它有益的结果。因此，参考发明概要、说明优选具体方案的细节描述以及由权利要求书定义的发明范围并连同附图就可能获得本发明的其它目的及对本发明更深更全面的理解。
本发明的一个具体方案涉及新型、安全且有效的减毒铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有能显示抗原性而无铜绿假单胞菌菌株自身毒性的细胞壁蛋白。更具体地说，本发明涉及安全减毒的铜绿假单胞菌菌株，该菌株是通过下列步骤获得的从被铜绿假单胞菌感染的病人中分离出铜绿假单胞菌菌株，根据Fisher-Devlin免疫型将分离出的微生物菌株分成7类，对每种免疫型选择单一的具有代表性的菌株，并对这7类铜绿假单胞菌菌株中的每一类，将被选出的菌株通过重复注射/分离/再注射进实验动物内的步骤而纯化，并选择最减毒的菌株。
本发明的另一个具体方案是指一种新型的疫苗以及制备用于预防铜绿假单胞菌感染的该疫苗的方法。通过以下步骤制备该疫苗按下所述从7类安全减毒的铜绿假单胞菌菌株中的每一类中分离出基本纯态的细胞壁蛋白，并进一步纯化分离出的细胞壁蛋白，然后优选地将从至少3类减毒铜绿假单胞菌菌株中获得的经纯化的细胞壁蛋白混合。根据本发明，在制备疫苗中优选使用等量的来自该3类细胞壁蛋白。
本发明的另一个具体方案是一种用于铜绿假单胞菌感染的治疗剂，以及制备该治疗剂的方法。该治疗剂含有至少一种由下述方法制备的免疫球蛋白培养至少一种安全减毒的铜绿假单胞菌菌株，分离细胞壁蛋白，提纯分离出的细胞壁蛋白，然后将纯细胞壁蛋白作为抗体诱导剂注入实验动物中以诱导免疫球蛋白。
上面已概括了本发明较贴切和重要的特征，这样就能更好地理解本发明下述的详细描述，而且能充分了解本发明对现有技术的贡献。下文描述的本发明的其它特征构成了本发明权利要求书的主题。本领域的技术人员能领会到这里公开的观点和特定的方案是易于用作改型或设计其它结构以实施本发明相同目的的基础。另外，本领域的技术人员也能认识到这样的等同构造并没有脱离权利要求书中所提出的本发明的精神和范围。
附图的简要说明为了全面理解本发明的实质和目的，可参考下列有关附图的详细说明
图1表示根据本发明从减毒铜绿假单胞菌菌株分离出的经纯化的细胞壁蛋白的SDS-PAGE检测结果；图2是表示已静脉注射入本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白的雄性鼠的体重变化的曲线图。
铜绿假单胞菌的Fisher-Devlin免疫型被分为7类，第1类至第7类。在本发明中，选择具有Fisher免疫型1至7的铜绿假单胞菌菌株作为减毒处理的菌株，这是因为它们能在被铜绿假单胞菌感染的绝大部分(即90～95%或更多)患者的血液中被检测到。特别是在这7类铜绿假单胞菌中，1型和3型是在被铜绿假单胞菌感染的患者中最常被检测出的菌株。然而，本发明的学说可用于对抗任何一种铜绿假单胞菌菌株以提供保护或治疗。
本发明的安全减毒的铜绿假单胞菌菌株可通过下述步骤获得从被确定具有铜绿假单胞菌感染的病人血液中分离纯态7类铜绿假单胞菌菌株中的每一类，然后用重复纯化过程使分出的菌株减毒。如此获得的安全减毒铜绿假单胞菌菌株为所有的7类并分别指定为CFCPA10142(Fisher型1)，CFCPA20215(Fisher型2)，CFCPA30720(Fisher型3)，CFCPA40057(Fisher型4)，CFCPA50243(Fisher型5)，CFCPA60534(Fisher型6)和CFCPA70018(Fisher型7)。其中CFCPA是“CheilFoodandChemicalPseudomonasaeruginosa”的首字母缩写，它是由本发明的发明人就职的Cheil食品与化学品公司(CheilFoodandChemicalsInc.)和主题菌株的名称铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)组成。
通过上述重复纯化过程而获得的减毒铜绿假单胞菌菌株具有与相应亲本菌株基本相同的表现型和微生物学性质，但在制备用于预防铜绿假单胞菌感染的疫苗抗原中表现出新的有益的性质，而无减毒前亲本菌株所具有的任何致病性。因此，本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株被认为是新型的微生物菌株。这些菌株于1993年5月12日保藏于韩国联邦培养物保藏中心的韩国微生物培养物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms即KCCM)，该中心是根据《布达佩斯条约》的国际保藏机构，对CFCPA10142的保藏编号为KCCM10029，对CFCPA20215为KCCM10030，对CFCPA30720为KCCM10031，对CFCPA40057为KCCM10032，对CFCPA50243为KCCM10033，对CFCPA60534为KCCM10034和对CFCPA70018为KCCM10035。
生产减毒铜绿假单胞菌菌株的纯化过程一般重复进行直至该菌株表现出所需的LD50值。尽管纯化过程或步骤的次数决定于技术人员熟练程度、亲本菌株的毒性等，但是纯化步骤优选地进行3至7次，例如直到铜绿假单胞菌的LD50至少为2×107个细胞。根据本发明在鼠中这样获得的新型减毒铜绿假单胞菌菌株的LD50值优选地为2.0×107个细胞或更多。
本发明还提供了用于抗铜绿假单胞菌感染免疫的疫苗，该疫苗是通过下列步骤制备的根据本发明从上述获得的每一种新型减毒铜绿假单胞菌菌株分离纯态细胞壁蛋白，然后进一步纯化被分离出的细胞壁蛋白，并以一定混合比例，优选地按等量将来自每种要求免疫的所需铜绿假单胞菌菌株的这样获得的已纯化的细胞壁蛋白结合。也就是说，用于每种菌株的量要足以在一特定宿主型中诱导抗该菌株的免疫。
另外，本发明提供了一种制备抗铜绿假单胞菌免疫的疫苗的方法，其特征在于在发酵罐中培养减毒铜绿假单胞菌菌株；同时保持最适宜生长的条件以获得铜绿假单胞菌菌团。按照一系列过程处理所获得的微生物菌团以获得所需的细胞壁蛋白，该过程包括通过用有机溶剂处理而萃取细胞壁蛋白，根据分子量分级，超离心。将从7类减毒的铜绿假单胞菌菌株获得的细胞壁蛋白以所需的比例，优选地按等量而在适当条件下相互结合。
如上所述根据本发明制备疫苗的方法总结如下
表1分离和纯化减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白及制备疫苗的方法 下文中将参考制备本发明疫苗的方法而更明确地解释该疫苗的组成。
根据本发明为了制备预防铜绿假单胞菌的疫苗，首先在适宜大小的发酵罐中分别培养7类减毒铜绿假单胞菌菌株，即CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA70018。作为本目的的培养基，胰蛋白大豆肉汤或优选的如下所述的特定培养基都适用于上述铜绿假单胞菌的培养。
特定的培养基包括蔗糖(30 g/l)，蛋白胨(15 g/l)，MgSO4(0.5 g/l)，CaCO3(5 g/l)，KH2PO4(1 g/l)，FeSO4(5 mg/l)，CuSO4(5 mg/l)和ZnSO4(5 mg/l)。该特定培养基是由本发明人唯一设计用于铜绿假单胞菌菌株的培养，而且是新型的。因此，这种特定培养基是包括在本发明范围内。当铜绿假单胞菌菌株在该特定培养基中培养时，菌团的产率至少比在胰蛋白大豆肉汤中培养的菌团高30%(按菌体干重计)。因此，使用该特定培养基是优选的方案。
在这种菌团培养步骤中，最佳培养条件为温度37℃，通气率1vvm(体积/体积·分)，投种量为培养基溶液的5%v/v，在搅拌速率为100rpm下先培养2小时，然后在600rpm下培养10至20小时，优选为12至16小时。
培养完成后，第二步用离心或类似方法将沉淀的菌体细胞从培养液中分离。第三步用有机溶剂处理分离出的菌体细胞使微生物失活，同时去除细胞壁脂质成份。在第三步中，优选选用的有机溶剂为丙酮、氯仿、乙醇、丁醇等，最优选的为丙酮。
接着，第四步包括重复萃取细胞壁蛋白，即5至6次萃取，而同时要不破坏细胞本身以使细胞内容物去掉。为了这个目的，将微生物细胞保存在溶液中例如磷酸缓冲液、tris缓冲液和类似物，优选的是磷酸缓冲液，同时用搅拌器或匀浆器作用以提取细胞壁蛋白。提取最好在4℃100rpm至2000rpm搅拌下进行。另外，在第四步中需特别小心防止细胞的破坏，这样所需的细胞壁蛋白就能和细胞质中的有毒蛋白分开。因此，在提取过程中需要通过检测作为细胞质标记酶的乳酸脱氢酶或已糖激酶的存在以确定细胞是否被破坏而进行连续测定。
然后，将按照上述步骤在上清液中获得的减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白通过第一次和第二次超滤而进行分级以获得仅具有分子量为10，000至100，000的蛋白质。在这步中，所得到的细胞壁蛋白的分子量在10，000至100，000范围内是非常重要的。因为分子量小于10，000的细胞壁蛋白不能提供通过动物实验所确定的所需预防效果，而分子量大于100，000，可能会因为高分子脂多糖(LPS)的存在而引起毒性作用。
具有分子量为10，000至100，000的从7类铜绿假单胞菌的每一类分离出的细胞壁蛋白分别进一步通过超离心而纯化以除去可能存在的任何少量的脂多糖。然后进行除去任何菌体物质的步骤以最终获得减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白，该蛋白是非致病性的并有足够的纯度可用作抗铜绿假单胞菌感染的预防性疫苗。
然后将从这7类减毒铜绿假单胞菌菌株获得的细胞壁蛋白以某一特定比例混合以制成疫苗。考虑到在减毒前亲本铜绿假单胞菌菌株的病发频率，应该将从至少3类，优选的为4类或更多，最优选的是由所有7类的铜绿假单胞菌菌株中获得的细胞壁蛋白混合而进行细胞壁蛋白的结合。尽管混合比例随着得到要结合的细胞壁蛋白的铜绿假单胞菌菌株类型而变化，但是优选的是将细胞壁蛋白以等量的比例混合。
例如，本发明的优选的疫苗组成是含有从CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534获得的细胞壁蛋白以1∶1∶1.5∶0.5、1∶1∶1∶1或0.5∶1.5∶1.5∶0.5的混合比例制成的疫苗，或含有从CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA70018获得的所有细胞壁蛋白以基本等量的混合比例制成的疫苗。疫苗中从每种铜绿假单胞菌菌株制得的细胞壁蛋白混合物的最少量是在预定的宿主/病人中要足以诱导免疫的最少量。
如果需要，除了上述获得的细胞壁蛋白组分外，根据本发明用于抗铜绿假单胞菌感染的预防性疫苗还可包括药物上可接受的赋形剂，例如氢氧化钙、磷酸钙、ISCOM(免疫刺激复合物)、SAF-1(Syntex佐剂配方1)、SAFm(改型的Syntex佐剂配方)和本领域技术人员所熟知的类似赋形剂。
对于用作抗铜绿假单胞菌感染的预防疫苗，其给药量随着可能接触铜绿假单胞菌的客体的性别、年龄、体重、健康状况等而不同，但一般为0.5至2.5mg的来自每种减毒菌株的细胞壁蛋白混合物。该量通常是由干重为0.1g至0.5g的菌团获得(相应于0.5至2.5g菌团湿重)。优选的给药途径是通过肌肉注射。
根据本发明的另一方面，从本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株获得的纯态细胞壁蛋白也能用作抗体诱导剂以在实验动物中诱导免疫球蛋白。因此，本发明提供了一种治疗铜绿假单胞菌感染的治疗剂，该治疗剂含有将通过上述分离和纯化而制得的纯细胞壁蛋白注射进实验动物体内以诱导产生抗铜绿假单胞蛋白而生产的免疫球蛋白。
特别是，根据上面具体说明的过程从本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株获得的分离和提纯的细胞壁蛋白是一种用于接种于实验动物，例如绵羊、兔等，以诱导形成相关抗体的抗原。收集实验动物的血液，然后分离血清。用已知的方式处理已分离的血清从而获得所需的纯态免疫球蛋白。为此，按照在相关技术领域熟知的方法可以从分出的血清中分离纯化免疫球蛋白(参见PracticalImmunology，3rdEd.(1989)，292～294]，例如，通过将分出的血清与蒸馏水混合，把该混合物加至DEAE-纤维素(二乙氨乙基纤维素)使得免疫球蛋白被吸收，除去上清液，然后用磷酸缓冲液将吸收有免疫球蛋白的DEAE纤维素洗涤几次从而获得纯化的免疫球蛋白。
在治疗铜绿假单胞菌感染的治疗剂中使用的免疫球蛋白是通过用含有一定比例的从多种减毒铜绿假单胞菌菌株种中分离出的细胞壁蛋白混合物使实验动物免疫而获得的。为此，可以使用通过用混合物使实验动物免疫而获得的结合免疫球蛋白，该混合物包括一定比例的，优选为等量比例的从7类铜绿假单胞菌菌株的每一类中获得的每一种细胞壁蛋白。然而，当考虑到每种免疫球蛋白的交叉反应性时，用一种包括以1∶1∶1∶1的比例的如下4类减毒铜绿假单胞菌菌株CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534的每一类中分离出的细胞壁蛋白的混合物使实验动物免疫而获得的免疫球蛋白，对该免疫球蛋白因全部具有Fisher型1、2、3、4、5、6和7的铜绿假单胞菌菌株所引起的感染均有显著的治疗效果，这是用于治疗由铜绿假单胞菌引起的疾病的优选组合免疫球蛋白治疗剂。
本发明用于铜绿假单胞菌的免疫球蛋白可配制成冷冻干燥形式或液体形式的药物组合物，如果需要的话，还可包括药物上可接受的载体，例如稳定剂、防腐剂、等渗剂及类似物。可使用的药物上可接受的载体优选包括，例如对冷冻干燥制剂有甘露糖醇、乳糖、蔗糖、人类白蛋白等；对液体制剂有生理盐水、注射用水、磷酸缓冲液、氢氧化铝等。
免疫球蛋白的剂量随用药对象的年龄、体重、性别和一般健康状况，铜绿假单胞菌感染的严重程度以及施用的组合免疫球蛋白成份而变化。免疫球蛋白一般以对成人通过静脉注射途径施用每天每千克体重0.1mg至1000mg，优选1mg至100mg。
通过下述实施例能更具体地说明本发明，但本发明绝不受这些实施例的限制。
实施例1从被铜绿假单胞菌感染的患者中分离铜绿假单胞菌菌株及其鉴定从被铜绿假单胞菌感染的病人中取260个不同血液样品中的每一个中，无菌收集约1至5 ml的等分样品并在室温下静置1小时。血液在冰箱里4℃下保藏过夜后，以1500×g(g重力)在4℃下离心10分钟从而除去固体物质并获得上清液的血清。以1∶10(血清对溶液)的比例用磷酸缓冲液(每升中NaH2PO41.15 g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.766g)稀释上述所得的血清，然后将其涂布于事先制备好的加入1.0至1.5%琼脂的胰蛋白大豆肉汤培养平板上。在通气条件下保持37℃恒温的培养箱中使培养平板温育12个小时或更长。将这样获得的培养物转移到新鲜培养平板，然后通过已知的微生物纯分离方法在分离纯态的所需的微生物[参见Thomas D.Brook和Michael T.Madigan，Biology of Microorganisms(1988)，5th Ed.pp 32-33，Prentice Hall Englewood Cliffs，New Jersey]。
对于被分离的铜绿假单胞菌菌株，它们的血清学和免疫学特征已被公开(参见Bergey′sManual)，而且根据J.Gen.Microbiol，130，631-644，1984中描述的分析方法用商品化分析设备进行确定。将每类铜绿假单胞菌菌株接种于含有5ml胰蛋白大豆肉汤的试管中，然后在通气条件下37℃培养以调整菌体浓度使其保持在650nm可见光下的吸收值约为2.0或更大。
从该培养溶液中无菌取出1ml等分样品并以6000×g在4℃下离心10分钟。移去上清培养液并加入等量的无菌盐水使沉淀的微生物悬浮。将装在设备中的15μl每种试验血清和对照血清(普通兔血清)加至96孔微量培养板的每个小孔中，并与15μl上述获得的微生物悬浮液混合以确定在10到30分钟内是否出现絮凝。在该研究中，因为具有阳性絮凝的小孔中的微生物菌株与被加入的血清有相同的血清型，所以就能容易地鉴别所分离的微生物。
实施例2从每种被分离的铜绿假单胞菌菌株中选择减毒的铜绿假单胞菌菌株为了使铜绿假单胞菌菌株减毒以获得用于制备疫苗的安全微生物，选择具有不同免疫型的每类铜绿假单胞菌菌株的一种菌株，然后通过重复纯化过程使其减毒。
在这一过程中，选择毒性铜绿假单胞菌菌株GN 11189(Episome Institute，Japan)作为对照，当GN 11189的2.0×106个细胞被静脉(或腹膜内)注射进重20到25g的雄性ICR鼠中后，该菌株在3天内显示100%的致死率。
在与实施例1相同条件下，在胰蛋白大豆肉汤液体培养基中培养具有不同免疫型的上述选择的铜绿假单胞菌菌株中的每一种，然后以6000×g在4℃离心10分钟。将获得的细胞沉淀悬浮于10ml的生理盐水中，在上述相同条件下再离心，然后用新鲜的生理盐水稀释使细胞含量调节至每ml5×105、5×106、5×107和5×108个细胞。通过静脉(或腹膜内)注射的途径将每种细胞稀释液施用给包括10只ICR鼠的一组。对于对照组，将2.0×106个细胞的量的GN11189施用给每一对照动物。在对照组中3天内致死率为100%时，从最高细胞含量下仍存活的ICR鼠中无菌分离出铜绿假单胞菌菌株。把该分离出的铜绿假单胞菌菌株涂布于胰蛋白大豆琼脂平板培养基上。按照上文提到的微生物纯分离方法分离每种纯态微生物菌株。
根据上述方法，将第一次减毒的所有7种微生物重复通过ICR鼠约3至7次直到每种菌株均达到至少2.0×107个细胞的所需LD50。每种最终减毒的铜绿假单胞菌菌株的以LD50表示的安全值列于下表2中。
表2根据本发明选择的减毒铜绿假单胞菌菌株的安全值 上文提到的所有7种微生物的LD50值至少为2.0×107个细胞。因此，可以确定已选择出了减毒的微生物。
实施例3鉴定减毒铜绿假单胞菌菌株将经灭菌的10%(w/v)溴化十六烷基三甲胺加至液体营养培养基(pH7.2～7.4)中使其最终浓度为0.3%(v/v)，该经灭菌的溴化十六烷基三甲胺是通过在121℃下高压灭菌锅内蒸气灭菌15分钟而制备的。无菌操作取10ml等分的所获得的培养基至试管中，在该试管里将1滴经过上述实施例2纯化分离的每种减毒铜绿假单胞菌菌株进行接种并在30至37℃下培养12至16小时。从微生物生长的试管中取出0.5 ml培养液涂布于作为铜绿假单胞菌分离培养基的溴化十六烷基三甲胺琼脂的培养基平板上，然后温育该平板。将通过颜料形成法第一个被鉴定为铜绿假单胞菌的菌落转移，并在用于检测氢化荧光素的铜绿假单胞菌琼脂培养基( 蛋白胨3号(oxoid)2%，甘油(二重蒸馏)1%，K2HPO4(无水的)0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂1.5%(w/v)，pH 7.2)上培养，然后在用于检测绿脓菌素的铜绿假单胞菌琼脂培养基(蛋白胨(Difco)2%，甘油(二重蒸馏的)1%，K2SO4(无水的)1%，MgCl2(无水的)0.14%，琼脂1.5%(w/v)，pH 7.2)上培养，然后再进行形态学试验、营养需求和氧化酶试验的检测以确定铜绿假单胞菌的存在。使用铜绿假单胞菌抗原试剂盒按照IATS分类系统确定所选择的铜绿假单胞菌的类型，然后用Fisher免疫-血清型进行分类。所得的结果示于下列表3中。
表3选择铜绿假单胞菌菌株及它们的血清型和保护范围的标准 实施例4减毒铜绿假单胞菌菌株的生理特性(1)已确定了pH值对实施例2中7种铜绿假单胞菌菌株的每一种的生长速率的影响。将每种微生物菌株接种于pH值为7.2的50ml胰蛋白大豆肉汤中，然后以搅拌速率为200rpm的通气状态下37℃预培养12～16小时。将每种预培养的菌团菌株以最终浓度为1%(v/v)接种至500mlpH值分别为3.0、5.0、7.0和9.0的新鲜胰蛋白大豆肉汤中，然后在上述相同条件下37℃在发酵罐中培养。在这期间，每间隔2小时对每种培养基取样，然后通过分光光度仪测定样品在600nm处的吸光率以确定菌团的浓定。所得的结果如下列表4所示。
表4pH值对微生物生长速率的影响 注+生长，-不生长从表4可以看出，在极酸性条件下，例如pH3.0时，本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株不生长，但是，在pH5.0至pH9.0培养基条件下菌株的生长率基本相同或相似。因此，本发明中的所有7种微生物在很宽的pH值范围均能很好地生长。(2)根据上述(1)中的相同方法，确定了温度变化对铜绿假单胞菌菌株生长速率的影响。将7种减毒铜绿假单胞菌菌株的每一种接种于pH值为7.0的50ml胰蛋白大豆肉汤中，然后在搅拌速率为200rpm的通气条件下37℃时预培养12至16小时。将每种预培养的菌株接种至pH值为7.0的500ml胰蛋大豆肉汤中，然后在与上述相同的条件下温度分别保持在25℃、30℃、37℃和42℃的发酵罐中培养。在这期间，通过分光光度计测定600nm处培养液的吸光率而确定每个发酵罐中的生长率。结果如表5所示。
表5温度变化对微生物生长速率的影响 注+生长，-不生长从表5可以看出，所有7类减毒铜绿假单胞菌菌株在37℃生长最好，在30℃、25℃生长也好。然而，与在其它温度下的生长速率相比，在42℃下7种铜绿假单胞菌菌株的每一种都呈现相当慢的生长速率。
(3)下述实验是确定碳源对减毒铜绿假单胞菌菌株的生长速率的影响。将7种减毒铜绿假单胞菌菌株的每一种接种至pH值为7.0的50ml胰蛋白大豆肉汤中，然后在搅拌速率为200rpm的通气条件下37℃时，培养12～16小时。将培养基在无菌条件下以6000×g4℃下离心10分钟而收集菌体，然后将该收集的菌体重新悬浮于10ml的生理盐水中。分别将上述获得的每50μl微生物悬浮液接种至含有不同碳源(如下)的5 ml M9培养基(Na2HPO4·7H2O 12.8g，KH2PO43g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g)，然后培养12小时。对于每一培养液通过测定600 nm处的吸光率而确定微生物生长的程度。
表6碳源对减毒铜绿假单胞菌菌株生长特性的影响 注+生长，-不生长碳源对减毒铜绿假单胞菌菌株生长特征的影响表明其形式与碳源对普通铜绿假单胞菌菌株生长特征的影响(参见Bergey′sManual)基本相同或相似。然而，应注意的是尽管已报导铜绿假单胞菌一般不利用甘露糖，但是本发明的减毒铜绿假单胞菌在含甘露糖的培养基上也呈现一定生长。
从上述可以看出，本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株能在通气条件，选择的温度、pH等条件下，在含有碳源、氮源、无机化合物、氨基酸、维生素和其它营养物的普通培养基上进行培养以获得菌团。来自所得菌体的细胞壁蛋白可用于制备铜绿假单胞菌疫苗。
作为培养减毒铜绿假单胞菌菌株的碳源，可以使用各种碳水化合物如葡萄糖、甘露糖醇、果糖等和各种有机酸如乙酸、丙酮酸、乳酸等。对氮源，可以使用各种有机和无机的铵盐、蛋白胨、酵母浸提物、酪蛋白水解物以及其它含氮的物质。作为无机化合物，可以使用硫酸镁、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸亚铜、硫酸锌、磷酸氢钾、磷酸二氢钾等。优选的是在通气条件下25至37℃时培养，例如通过平板培养或诸如摇床培养或通气喷嘴器培养的液体培养。在培养过程中，培养基的pH值优选保持在pH5～9。优选地将培养12～16小时的培养液通过离心而获得的菌团用作下述的制备疫苗的起始物质。实施例5减毒铜绿假单胞菌菌株的培养(1)在一个5L的发酵罐中将根据实施例2获得的铜绿假单胞菌菌团按下所述培养以大量生产。将每1L蒸馏水溶解30g胰蛋白大豆肉汤获得的2.5L培养基溶液调节至pH7.2，灭菌，然后引入5L的发酵罐。培养条件是培养温度为37℃，通气速率为1vvm，接种量为得自实施例2的减毒铜绿假单胞菌菌体培养液的5%(v/v)，搅拌速率在最初的2小时保持在100rpm，然后在600rpm的固定搅拌速率下继续培养12至16小时。尽管所获得的菌体量依赖于铜绿假单胞菌菌体的类型而多少有些不同，但是每升培养液的平均产量大约为8g(干重)菌体。
(2)如上述(1)的相同培养条件下，培养7种减毒铜绿假单胞菌菌体的每一种，但是在培养铜绿假单胞菌的特定培养基上培养，该特定培养基包括葡萄糖(30 g/l)，蛋白胨(15 g/l)，MgSO4(0.5 g/l)，CaCO3(5 g/l)，KH2PO4(1 g/l)，FeSO4(5 mg/l)，CuSO4(5 mg/l)和ZnSO4(5 mg/l)。使用这种特定的培养基，对每种微生物菌株大约能获得10.4 g至10.5g(干重)的菌体。因此，使用这种特定的培养基能提供至少比在胰蛋白大豆肉汤中获得的产率高30%(基于干重)的菌体产率。
实施例6来自减毒假单胞菌菌株的细胞壁蛋白的部分纯化为了制备抗铜绿假单胞菌疫苗，需部分纯化来自七种减毒铜绿假单胞菌菌株的每一种所制得的细胞壁蛋白。下文中，使用第3类菌株，即CFCPA30720(KCCM10031)作为一个典型的例子。然后，其它减毒的铜绿假单胞菌菌株也可通过下述相同的纯化方法获得部分纯化的细胞壁蛋白。
将上述实施例4(2)中使用的2.5 L特定培养基引入5 L发酵罐中，然后在保持上述相同的培养条件下培养12至16小时。培养完毕时，以6000×g在4℃将2.5 L培养液离心20分钟以除去上清液。将沉淀出的细胞在4℃下再悬浮于磷酸缓冲溶液中(每升中Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.766g，pH=7.2)，再离心，然后用相同的磷酸缓冲液洗涤。对所获得的130 g细胞，加入相当于原始湿菌细胞体积3倍的丙硐(约390 ml)，将该混合物在4℃静置12小时或更长时间。将丙硐从被沉淀的细胞中除去，然后再对残留物加入相当于原始湿菌细胞体积2倍的新鲜丙酮(约260 ml)。搅拌所获得的混合物5～10分钟，然后以8000×g在4℃离心20分钟。移去上清液丙酮，并向残留物中加入相同体积的丙酮。搅拌该混合物并按照上述相同的方式离心除去上清液。在室温下将沉淀出的细胞置于平板上干燥以除去丙酮。加入250ml上述相同的磷酸缓冲液使已干燥的微生物再次悬浮，这样最终的浓度就能被调节至10%(v/v)。用匀浆机以500～1500rpm的速度处理所获得的混合物10分钟，同时保持温度在4℃而提取细胞壁蛋白。以8000～10000×g将所获得的悬浮液离心30分钟以获得上清液。分离出沉淀的细胞，加入相同体积的磷酸缓冲液再次悬浮，然后在与第一次提取的相同条件下进行第二次提取以获得上清液。
使用如第一次提取方法相同的条件，重复提取细胞壁蛋白5～6次，同时要小心不能破坏(溶解)任何细胞。可通过测定作为细胞质标记物质的特定蛋白质，例如乳酸脱氢酶或已糖激酶，来确定细胞的破坏。收集提取出的上清液(每一种该上清液均经过检验以保证细胞壁蛋白已被提取而不掺有细胞质蛋白，乳酸脱氢酶和已糖激酶)，搅拌，然后以10000×g在4℃最后再离心30分钟以获得澄清的上清液。如此获得的蛋白质溶液仅包括基本纯的细胞壁蛋白，用蛋白质定量分析法调节使得蛋白浓度保持在1mg/ml至2mg/ml的量。接着用10～15%浓度梯度电泳法确定蛋白溶液的纯度。结果，能鉴定出存在有分子量为10，000～100，000范围内的所需细胞壁蛋白(参见图1)。
实施例7精蛋白的纯化实施下列步骤使浓度为1～2mg/ml的精制细胞壁蛋白溶液纯化以使仅含有有效的组分。
首先使2～2.5L的粗细胞壁蛋白溶液通过Pellicon盒式系统中的分子量100，000截断膜过滤器以除去分子量超过100，000的蛋白质分子。按照这一方法，分子量低于100，000的蛋白质以滤液形式回收，而将分子量大于100，000的蛋白质不断循环以从分子量低于100，000的小分子中分离出。
最终浓缩蛋白质溶液成10～20%原始体积，用20～25 L(蛋白质溶液初始体积的10倍量)的无菌磷酸缓冲液(每升中Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.766g)连续洗涤以回收90%或更多的分子量小于100，000的蛋白质。将作为滤液而被分离出的分子量小于100，000的蛋白质通过相同系统中的分子量10，000截断膜过滤器以除去分子量小于10，000的蛋白质和其它杂质，同时浓缩分子量10，000至100，000的蛋白质到1 mg/ml的浓度。
最后，超离心上清液以除去脂多糖(LPS)和与细胞壁相关的片断，它们可能以痕量存在于上述所获得的上清液中。以180，000×g至200，000×g在4℃超离心3小时。除去沉淀后，将所获得的上清液通过0.2μm过滤器的过滤灭菌以获得250至260mg用于抗铜绿假单胞菌感染的预防性疫苗的蛋白质成分。
实施例8纯化来自具有不同免疫型的减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白按照实施例5、实施例6和实施例7中描述的用于制备CFCPA30720铜绿假单胞菌菌株疫苗组合物的培养和提纯微生物的相同方法处理本发明的剩余6种减毒铜绿假单胞菌菌株，即CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA70018。这样获得的最终铜绿假单胞菌疫苗制品在10～15%浓度梯度SDS-PAGE上显示具有与CFCPA30720相同的谱带图形。另外，与标准分子量标记比较的结果可确定疫苗组合物中含有的所有蛋白质的分子量均在10，000至100，000范围内(图1)。
实施例9用结合抗原进行交叉保护能力试验按照实施例7和8中方法进行过分离和纯化步骤后的从每种减毒铜绿假单胞菌菌株中获得的细胞壁蛋白以0.2 mg/kg的量腹膜内施用给重23至25g 6周龄的ICR雄性鼠使该动物免疫。每组有10至15个试验动物。免疫作用后一周，从每组的2至3只鼠中取血样进行ELISA(与酶相关的免疫吸收剂测试)。对于剩余的ICR鼠，以实施例2表2中列出的每种微生物菌株最初LD50值的10至50倍的量注射相应于各种免疫型的野生型铜绿假单胞菌菌株。连续检查一周抗每种铜绿假单胞菌菌株的保护效果。结果是，所有试验组都表现出抗相应铜绿假单胞菌菌株的保护效果，而且对所有收集的血液进行的ELISA试验也显示良好的正值，这意味着在免疫应答上的改善。
在本发明中，为了制备能显示抗由任何型铜绿假单胞菌菌株引起的感染的通用保护作用的疫苗，处理4种减毒铜绿假单胞菌菌株(三种铜绿假单胞菌菌株最常在人体感染中检测出，一种铜绿假单胞菌菌株如果被感染就很难治愈，即，CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534)，以获得细胞壁蛋白，该细胞壁蛋白以等量的比例结合；然后，检测抗每种免疫型铜绿假单胞菌菌株的交叉保护能力。
如上所述，从4类减毒铜绿假单胞菌菌株分离出的细胞壁蛋白以等重量比(1∶1∶1∶1)结合。将该结合的细胞壁蛋白以腹膜内施用给ICR雄性鼠中，以使该试验动物免疫。将0.3 ml磷酸缓冲液(每升中Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.766g)施用给对照组。免疫作用一周后，将铜绿假单胞菌以从1×108个细胞至1×104个细胞以10倍为系列的5种不同浓度稀释液腹膜内施用给用铜绿假单胞菌疫苗免疫的试验组中的每一组以及用磷酸缓冲液免疫的对照组；清数实验动物的存活数以计算效能指数(EI)。所得结果列于如下表7中，其中效能指数被定义为实验组的LD50值除以对照组的LD50值。从表7可以看出，具有从4种减毒铜绿假单胞菌菌株，即CFCPA 10142，CFCPA 20215，CFCPA 30720和CFCPA 60534获得的细胞壁蛋白的疫苗具有抗每种免疫型铜绿假单胞菌菌株EI值为3.0至18或更多。因此，当考虑到具有至少为2的EI值的疫苗就被认为是具有良好的免疫学效果时，可以看出本发明的疫苗对由7种铜绿假单胞菌菌株中任何种引起的感染均有良好的保护作用。
表7用4种不同种的减毒铜绿假单胞菌菌株制备的抗各种微生物的铜绿假单胞菌疫苗的交叉保护能力试验激发菌株免疫型血清型EI值CFCPA10142的亲本菌株1069.5CFCPA20215的亲本菌株201113CFCPA30720的亲本菌株302>18CFCPA40057的亲本菌株4013CFCPA50243的亲本菌株50104.5CFCPA60534的亲本菌株6078.4CFCPA70018的亲本菌株7057
使用从3种减毒铜绿假单胞菌菌株CFCPA10142，CFCPA30720和CFCPA20215(组Ⅰ)中获得的所得制备的细胞壁蛋白混合物，以及从所有7种减毒铜绿假单胞菌菌株(组Ⅱ)中所得制备的细胞壁蛋白混合物(其中全部细胞壁蛋白都以等量比例存在)以代替4类蛋白的混合物以外，根据如上所述的步骤，检查这2类抗每种铜绿假单胞菌感染的疫苗的交叉保护能力。所得结果示于表8。
表8由3类(组Ⅰ)或7类(组Ⅱ)减毒铜绿假单胞菌菌株获得的抗每种微生物的疫苗的交叉保护能力试验激发菌株实验组中的LD50EI值(-)对照组中的LD50组I组IICFCPA10142的亲本菌株14.39.2CFCPA20215的亲本菌株12.010.7CFCPA30720的亲本菌株>18.015.0CFCPA40057的亲本菌株2.58.3CFCPA50243的亲本菌株4.010.6CFCPA60534的亲本菌株3.79.7CFCPA70018的亲本菌株2.812.9从上述的实验结果可以看出，因为本发明的混合蛋白组合疫苗是由来自至少3种具有相互不同免疫型的不同种减毒铜绿假单胞菌制备的细胞壁蛋白组成，所以与仅有一类的普通抗原相比，该疫苗表现出极佳的抗任何铜绿假单胞菌免疫型的保护效果。也就是说，尽管本发明疫苗的效能指数随着得自减毒铜绿假单胞菌菌株中所择的微生物的种类和数目、从该微生物中所获得的细胞壁蛋白的混合比例、免疫学程序和方法等而变化，但是可以证实的是本发明的疫苗对抗所有目前出现于医院和病人中的铜绿假单胞菌菌株是有效的。
实施例10细胞壁蛋白的毒理实验为了制备用于预防由铜绿假单胞菌引起的感染的组合疫苗，应保证作为组合疫苗所使用的细胞壁蛋白本身的安全性以及如实施例2所述的微生物菌株本身的安全性。在本实施例中，部分纯化细胞壁蛋白，然后在实验动物如小鼠中检查它们的安全性。确切地说，用胰蛋白大豆肉汤作为培养基在一个5L发酵罐中培养每种减毒微生物，然后按照实施例5、6和7中所述过程进行处理。将从减毒铜绿假单胞菌菌株提取出的细胞壁蛋白上清液收集到一起，以10000×g在4℃再离心30分钟以除去可能存在于溶液中的细小颗粒。将获得的细胞壁蛋白通过Amicon膜过滤器进行过滤以获得分子量范围为10，000至100，000的细胞壁蛋白混合物，将该混合物浓缩至1mg/ml蛋白浓度，然后用0.2μm过滤器灭菌以获得用于毒理试验的蛋白源。
在本毒理实验中，使用的实验动物是重20至22g的ICR雄性鼠。对实验组，将蛋白源以20mg/kg和100mg/kg的量静脉注射。给对照组以25ml/kg的量施用生理盐水。从表9和附图2可以看到，实验组在用药后第一天时对体重增加有轻微抑制，但用药后第二天和第二天后就表现出正常的生长且无特殊症状。另外，即使在第7天和第7天之后在每种器官中也没有发现特别的变化和症状。
表9对减毒铜绿假单胞菌菌株的细胞壁蛋白源的急性毒理试验组别剂量受验者存活/受验者注实验组A20mg/kg2020/20体重无变化实验组B100mg/kg1515/15仅在第一天体重有变化对照组生理盐水1515/15体重无变化实施例11细胞壁蛋白抗原性的测定使用通过与实施例10中相同的方法部分纯化减毒铜绿假单胞菌菌株所获得的细胞壁蛋白作为抗原，并以0.1mg/kg或0.2mg/kg的量静脉注射至ICR鼠中以使该实验动物免疫。免疫作用一周，从鼠组中的每只鼠取一定量的血液，从收集到的血液中分离出血清，并按照ELISA方法确定该抗体的形式。[J.Clin.Microbiol.15，1054-1058，1982]。
首先，将在包衣缓冲液(0.05 M含有NaHCO32.85 g，Na2CO31.70g，H2O1的碳酸盐缓冲液，pH9.6)中被调节至0.1 mg/ml浓度的实施例10中制备的抗原100μl加至96孔微量培养板的每一个孔中，然后在室温下反应2小时，或在4℃下反应12至14小时，使蛋白质粘附于培养板上。
除去水性溶液后，在每个培养板小孔中加入200μl1%的牛血清白蛋白(BSA)，然后在室温下反应1小时从而封闭孔中不与蛋白质连结的剩余部分。
在本实验中，使用未被免疫鼠的血清作为用于对照组的抗体。反应完成时，用磷酸缓冲液(pH7.0～7.2)将培养板再洗涤5～6次，并将100μl第二类抗体即兔-抗鼠免疫球蛋白-过氧化物酶结合物加至每个孔中并在常温下反应1小时。
然后，用相同的磷酸缓冲洗液(pH7.0～7.2)剧烈地将培养板洗涤7次或更多次。将在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.0)中浓度调节至0.3至0.4mg/ml的作为底物的正苯二胺二氢氯化物50μl加至培养板的每个孔中，并在无光条件下反应20分钟。然后将50μl1N的硫酸分别加入以停止孔中的反应。用分光光度计测定每种反应液在490nm的吸收率。
表10抗每种微生物细胞壁蛋白抗体形成(490nm)
从表10可以看出，在实验组中0.1或0.2mg/kg抗原的用药量造成比对照组中高2～5倍的免疫力。
实施例12用于铜绿假单胞菌的免疫球蛋白的生产将实施例7获得的蛋白溶液施用给兔子以产生相应的免疫球蛋白。虽然采用从减毒铜绿假单胞菌菌株CFCPA30720获得的细胞壁蛋白作为典型的例子，但也可将相同的方法应用于其它减毒铜绿假单胞菌菌株。
将实施例7中从CFCPA 30720菌株获得的细胞壁蛋白溶液0.5至1ml(含有100至200μg的细胞壁蛋白)以7天的间隔接种于白化病兔中三次。然后，以有规律的间隔以每只兔中取血样，并分离血清。将100 ml分离出的兔血清与300 ml蒸馏水混合，并在4℃将混合物加至500 g(湿重)的DEAE-纤维素中。在4℃将所获得的混合物彻底摇振1小时，静置，然后将上清液分离并除去。每次用200 ml 0.01M的磷酸缓冲液(每升中Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.766g，pH 8.0)将剩余的残渣洗涤3次以获得具有96%或更高纯度的600 mg免疫球蛋白IgG。
实施例13免疫球蛋白对铜绿假单胞菌感染的治疗效果对于上述实施例12中获得的抗铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白，按照下述方法检定它们对铜绿假单胞菌感染的治疗效果。下述每组用10只小鼠。
将Fisher免疫型1、2、3、4、5、6和7的每种致病铜绿假单胞菌菌株1.0～3.0×106个细胞腹膜内注射进每只小鼠中以导致铜绿假单胞菌感染。注射后2～6小时内，将用于每种菌株的经纯化的免疫球蛋白以每只小鼠0.1～2 mg的量静脉注射入每只小鼠中以检查它们的治疗效果。
在对照组中，静脉注射0.5ml生理盐水而不是免疫球蛋白。在本实验中，使用的免疫球蛋白是CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534，或者这4种免球蛋白以等量的比例的混合物。
结果，仅接受生理盐水的对照组在48小时内的致死率为50%或更多，72小时后是100%。而接受相应免疫球蛋白的试验组72小时后的存活率为80%或更多。因此，可以证明，免疫球蛋白对于由具有相应Fisher免疫型的致病铜绿假单胞菌菌株引起的感染的治疗是有效的。但是单一免疫球蛋白对于由具有Fisher免疫型4和5的致病铜绿假单胞菌菌株引起的感染没有这样的效果。
另一方面，接受以重量比为1∶1∶1∶1的4种免疫球蛋白结合物的小鼠组因为它们的交叉反应性，所以即使对Fisher4和5型的铜绿假单胞菌也有优异的治疗效果。因此，本发明的结合免疫球蛋白组合物对于由具有全部Fisher免疫型的铜绿假单胞菌菌株引起的感染可用作有效的治疗剂。本实验的结果总结于表11和12中。
表11单独或结合使用免疫球蛋白的免疫学保护作用用于制备免疫球蛋白的菌株免疫型免疫学保护范围仅CFCPA20215菌株2Fisher型3、7仅CFCPA60534菌株6Fisher型3、7仅CFCPA10142菌株1Fisher型2、1仅CFCPA30720菌株3Fisher型6
表12抗铜绿假单胞菌菌株免疫球蛋白的免疫学保护的相互关系 实施例14结合的免疫球蛋白对铜绿假单胞菌感染的治疗效果培养在实施例13中选择的4种减毒铜绿假单胞菌菌株即CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534，并按照实施例5、6和7中相同的步骤进行萃取，以获得细胞壁蛋白的结合组合物，然后按照实施例13的相同方法将该结合组合物以1周的间隔1.5至2mg的量接种至山羊中3次以大量获得结合的铜绿假单胞菌免疫球蛋白，并根据已知的方法将该免疫球蛋白纯化[参见PracticalImmunology，3rdEd.，(1989)，pp292-294]。
为了确定上述获得的经纯化的结合免疫球蛋白对不同Fisher免疫型的致病铜绿假单胞菌的免疫学保护作用和治疗效果，将每种免疫型的致病铜绿假单胞菌菌株以每只小鼠1.0至3.0×106个细胞的量接种至预先已注射过三次结合免疫球蛋白组合物的一组小鼠中(6组每组20只小鼠)和另一组小鼠中(6组每组10只小鼠，它们均没有接受免疫球蛋白组合物)，从而观察结合免疫球蛋白的免疫保护作用。另外，在另一小鼠组中(6组每组10只小鼠)首先接种致病铜绿假单胞菌菌株，2～6小时后对每只重约20至25 g小鼠按0.1至5 mg的量静脉注射上述获得的结合免疫球蛋白组合物，从而观察本发明的免疫球蛋白组合物的治疗效果。
结果，可以证实本发明的结合免疫球蛋白组合物具有80%或更高的免疫学保护作用以及75%或更高的治疗效果(以7天后的存活率(%)确定)，而所有对照组在3天内都死亡。
因此，可以确定本发明的结合免疫球蛋白组合物可用作有效的药剂，并表现出优良的治疗效果和免疫学保护作用。
实施例15免疫球蛋白的配制按照实施例14相同的方法将细胞壁蛋白结合物施用至公羊中以获得经分离和纯化的结合铜绿假单胞菌免疫球蛋白，该细胞壁蛋白结合物是通过如实施例5、6和7相同的方法培养和提取在实施例13中选择的4种减毒铜绿假单胞菌菌株即CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534而获得的。然后，用各种药物上可接受的载体制备使得每kg体重施用1至100mg抗体免疫球蛋白。将配制的免疫球蛋白施用给感染有铜绿假单胞菌的小鼠以确定用于免疫球蛋白的各种载体对免疫球蛋白效果的影响。结果是，在液体制剂中将注射用生理盐水或磷酸缓冲液作为载体对免疫球蛋白制剂具有很高的效能，在冷冻干燥制剂中使用甘露糖醇、蔗糖或乳糖作为载体的免疫球蛋白制剂表现出高效能。另一方面，在冷冻干燥制剂中使用人类白蛋白和本发明的铜绿假单胞菌免疫球蛋白降低了免疫球蛋白的功效；在液体制剂中，使用氢氧化铝作为药物载体功效也很低。实验结果总结于表13中。
表13药物载体对铜绿假单胞菌免疫球蛋白功效的影响制剂型成份功效经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++++甘露糖醇(5～20%)冷冻干燥制剂经纯化的结合免疫球蛋白组合物++++乳糖(5～20%)经纯化的结合免疫球蛋白组合物++++蔗糖(5～20%)经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++人类白蛋白(1～5%)经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++++生理盐水液体制剂经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++++用于注射的蒸馏水经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++++磷酸缓冲液经纯化的结合免疫球蛋白组合物+++氢氧化铝+溶剂实施例16配制的免疫球蛋白组合物的功效将使用由实施例15的试验结果所确定的能提供高功效的磷酸缓冲液配制的免疫球蛋白进行测试，以确定它作为预防和治疗剂对撕伤、烧伤、创伤等二级皮肤感染的功效。按照烧伤试验程序使一只小鼠受伤[参见J.Infect.Dis.131，688-691，1975]。将每毫升磷酸缓冲液中含有0.5至1mg结合铜绿假单胞菌免疫球蛋白的液体制剂配制成喷雾剂，然后将其用于实验组中小鼠的烧伤部分，以确定其与未用免疫球蛋白喷雾剂处理过的对照组进行的效果比较。本实验的结果是，用免疫球蛋白-磷酸缓冲液喷雾剂处理过的小鼠组比未被处理过的组具有显著较高的存活率。因此，可以证实本发明含有铜绿假单胞菌免疫球蛋白的制剂对铜绿假单胞菌感染具有优异的保护作用和优异的治疗效果。本实验的结果如下表14所示。
表14烧伤试验的结果存活率接种铜处理小鼠绿假单24小时48小时72小时96小时数目细胞或更长烧伤(用免疫20局部20/2019/2016/2016/20球蛋白处理)接种烧伤(不用免20局部18/204/200/20疫球蛋白处理)接种对照组10不接10/1010/1010/1010/10种如上所述，本发明的每种减毒铜绿假单胞菌菌株相对于时野生型或致病种均是很安全的。同时，由于从中获得的细胞壁蛋白具有优越的安全和交叉保护特性及优异的中和抗体形成能力，所以该细胞壁蛋白不仅可用作预防铜绿假单胞菌感染的疫苗，也可用作实验动物中抗体诱导物以产生能用作铜绿假单胞菌感染的治疗剂的免疫球蛋白。因此，可以看出本发明的减毒铜绿假单胞菌菌株对制备用于铜绿假单胞菌感染的预防疫苗和治疗剂是十分有用的微生物。
权利要求
1.一种减毒铜绿假单胞菌菌株，该菌株在鼠中具有至少2.0×107个细胞的LD50，是通过从被感染铜绿假单胞菌的患者中根据免疫型分离出纯态铜绿假单胞菌，并将该分离出的菌株重复纯化使其减毒而获得的。加入CFCPA编号，但该编号可能是非必须的，审查员可能在权利要求书中需要Fisher型。
2.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10029(CFCPA10142)。
3.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10030(CFCPA20215)。
4.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10031(CFCPA30720)。
5.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10032(CFCPA40057)。
6.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10033(CFCPA50243)。
7.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10034(CFCPA60534)。
8.根据权利要求1的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有韩国联邦培养物保藏中心的保藏号KCCM10035(CFCPA70018)。
9.使用至少一种选自下列物组中的铜绿假单胞菌菌株制备抗铜绿假单胞菌感染的免疫疫苗韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10029(CFCPA10142)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10030(CFCPA20215)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10031(CFCPA30720)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10032(CFCPA40057)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10033(CFCPA50243)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10034(CFCPA60534)的铜绿假单胞菌菌株，和韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10035(CFCPA70018)的铜绿假单胞菌菌株，
10.一种抗由铜绿假单胞菌引起的疾病的免疫方法，该方法通过将非致病性抗原以足够在需要该免疫的人体中能诱导免疫应答的量注射入该人体从而预防由铜绿假单胞菌引起的随发疾病，该非致病性抗原包括选自下列物组中的至少一种减毒铜绿假单胞菌菌株而获得的细胞壁蛋白韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10029(CFCPA10142)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10030(CFCPA20215)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10031(CFCPA30720)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10032(CFCPA40057)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10033(CFCPA50243)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10034(CFCPA60534)的铜绿假单胞菌菌株，和韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10035(CFCPA70018)的铜绿假单胞菌菌株，
11.根据权利要求10的方法，其中从一种减毒铜绿假单菌菌株获得的细胞壁蛋白具有的分子量范围是10，000-100，000。
12.根据权利要求10的方法，其中通过肌内注射施用该细胞壁蛋白。
13.一种用于诱导抗由铜绿假单胞菌引起的疾病的免疫应答的非致病性疫苗，该疫苗包括由至少一种选自下列物组中的减毒铜绿假单胞菌菌株而获得的细胞壁蛋白混合物，从而诱导免疫应答以预防由铜绿假单胞菌引起的疾病韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10029(CFCPA10142)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10030(CFCPA20215)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10031(CFCPA30720)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10032(CFCPA40057)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10033(CFCPA50243)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10034(CFCPA60534)的铜绿假单胞菌菌株，和韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10035(CFCPA70018)的铜绿假单胞菌菌株，
14.根据权利要求13的疫苗，其中减毒铜绿假单胞菌菌株包括至少选自CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA70018中的3种菌株。
15.根据权利要求14的疫苗，其中减毒铜绿假单胞菌菌株包括CFCPA10142，CFCPA20215和CFCPA30720。
16.根据权利要求14的疫苗，其中减毒铜绿假单胞菌菌株选自CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720和CFCPA60534。
17.根据权利要求14的疫苗，其中减毒铜绿假单胞菌菌株是CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA700187种菌株。
18.根据权利13～17中任一所述的疫苗，其中从存在的每种减毒铜绿假单胞菌菌株中获得的细胞壁蛋白是以等量存在的。
19.根据权利要求13的疫苗，还包括药物上可接受的载体。
20.一种用于制备抗铜绿假单胞菌感染免疫的非致病性疫苗的方法，该方法包括a)从被铜绿假单胞菌感染的病人中收集铜绿假单胞菌；b)选择并分离出至少一种纯态铜绿假单胞菌；c)在一级培养基中培养经纯化的分离出的铜绿假单胞菌；d)通过不断注射进实验动物中而使每种纯的培养菌株减毒并对每种经减毒的铜绿假单胞菌菌株选出最减毒的菌株；e)在二级培养基上培养每种减毒的铜绿假单胞菌菌株；f)从培养基上分离出减毒铜绿假单胞菌；g)用有机溶剂处理分离出的铜绿假单胞菌使其失活并除去细胞壁脂质成分；h)从经处理的铜绿假单胞菌中提取细胞壁蛋白同时通过测定作为细胞质标记酶的乳酸脱氢酶或已糖激酶的存在来确定铜绿假单胞菌的细胞是否被破坏；i)将提取的细胞壁蛋白进行超滤以选择那些分子量仅在10，000至100，000范围内的细胞壁蛋白；j)超离心细胞壁蛋白以进一步除去任何脂多糖和任何细菌物质；k)回收纯态选出的细胞壁蛋白；l)使用选择出的细胞壁蛋白作为诱导免疫的抗原物质而制备疫苗。
21.根据权利要求20所述的方法，其中提取是通过将处理过的铜绿假单胞菌细胞置于缓冲液中进行操作的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中的缓冲液是选自磷酸缓冲液和tris缓冲液。
23.根据权利要求20所述的方法，其中细胞壁蛋白的提取是通过静置菌团或用搅拌器或匀浆器作用于被处理的铜绿假单胞菌细胞而进行操作的。
24.根据权利要求23的方法，其中的搅拌器是在4℃以100～2000rpm进行操作。
25.根据权利要求20的方法，其中的提取进行5～6次。
26.根据权利要求20的方法，其中的有机溶剂选自丙酮、氯仿、乙醇、丁醇，最优先的有机溶剂是丙酮。
27.根据权利要求20的方法，其中被分离的铜绿假单胞菌菌株包括CFCPA10142，CFCPA20215，CFCPA30720，CFCPA40057，CFCPA50243，CFCPA60534和CFCPA70018。
28.根据权利要求20的方法，其中二级培养基选自胰蛋白大豆肉汤和包括，蔗糖(30g/l)，蛋白胨(15g/l)，MgSO4(0.5g/l)，CaCO3(5g/l)，KH2PO4(1g/l)，FeSO4(5mg/l)，CuSO4(5mg/l)和ZnSO4(5mg/l)的培养基。
29.根据权利要求20的方法，其中减毒铜绿假单胞菌的培养条件包括温度37℃，通气速率1vvm(体积/体积·分钟)和接种量为培养基溶液的5%v/v，同时培养是在前2个小时搅拌速率为100rpm然后以600rpm持续10～20小时，优选12～16小时的条件下进行。
30.一种用于培养选自下列物组中的减毒铜绿假单胞菌菌株的培养基，该培养基包括每升中含葡萄糖30g，蛋白胨15g，MgSO40.5g，CaCO35g，KH2PO41g，FeSO45mg，CuSO45mg和ZnSO45mg韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10029(CFCPA10142)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10030(CFCPA20215)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10031(CFCPA30720)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10032(CFCPA40057)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10033(CFCPA50243)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10034(CFCPA60534)的铜绿假单胞菌菌株，和韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10035(CFCPA70018)的铜绿假单胞菌菌株，
31.一种用于治疗已感染病人中的铜绿假单胞菌感染的治疗剂，该治疗剂包括至少一种特异性抗至少一种铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是通过将从至少一种选自下述物组的减毒铜绿假单胞菌菌株中获得的细胞壁蛋白注射至合适的宿主中诱导而得的韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10029(CFCPA10142)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10030(CFCPA20215)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10031(CFCPA30720)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10032(CFCPA40057)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10033(CFCPA50243)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10034(CFCPA60534)的铜绿假单胞菌菌株，韩国联邦培养物保藏中心保藏号为KCCM10035(CFCPA70018)的铜绿假单胞菌菌株，其注射量要足以在所说的宿主中诱导免疫应答以引发所述的免疫球蛋白的产生，从而至少减少由铜绿假单胞菌引起疾病的不适作用的量进行。
32.根据权利要求31的治疗剂，该治疗剂含有抗各种相应于Fisher免疫型1、2、3、4、5、6和7的铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白。
33.根据权利要求31的治疗剂，该治疗剂含有抗任何4种相应于Fisher免疫型1、2、3、4、5、6和7的铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白。
34.根据权利要求31的治疗剂，该治疗剂含有抗任何三种相应于Fisher免疫型1、2、3、4、5、6和7的铜绿假单胞菌菌株的免疫球蛋白。
35.根据权利要求31的治疗剂，该治疗剂是冷冻干燥的形式。
36.根据权利要求35的治疗剂，该治疗剂还包括一种选自甘露糖醇、乳糖、蔗糖和人类白蛋白的适宜的药物上可接受的载体。
37.根据权利要求31的治疗剂，该治疗剂是液体形式，并且还包括适宜的药物上可接受载体。
38.根据权利要求31的治疗剂，其制成的药物剂形有注射剂、片剂、胶囊、眼滴剂、喷雾剂或膏剂。
全文摘要
本发明涉及新型、安全的减毒铜绿假单胞菌菌株，特别是CFCPA 10142(KCCM 10029)，CFCPA 20215(KCCM 10030)，CFCPA 30720(KCCM 10031)，CFCPA 40057(KCCM 10032)，CFCPA 50243(KCCM 10033)，CFCPA 60534(KCCM 10034)和CFCPA 70018(KCCM 10035)的菌株，该菌株是通过根据Fisher-Devlin免疫型分离出纯态的铜绿假单胞菌，然后将被分离出的菌株重复纯化而获得的。另外，本发明还涉及一种用于抗铜绿假单胞菌感染的免疫疫苗，该疫苗包括从减毒假单胞菌菌株获得的分子量在10,000至100,000范围内的细胞壁蛋白，一种含有由细胞壁蛋白在实验动物内诱导的免疫球蛋白的用于治疗铜绿假单胞菌感染的治疗剂，以及它们的制备的方法。减毒菌株的细胞壁蛋白组分是非致病性、安全的，而且表现出优异的抗体形式，适用于制备疫苗和治疗剂。该细胞壁蛋白具有对不同铜绿假单胞菌菌株的优异交叉保护能力和优异的抗体诱导性质。
文档编号A61P31/04GK1112356SQ94190491
公开日1995年11月22日 申请日期1994年6月2日 优先权日1993年6月7日
发明者金炫洙, 朴完济, 文武相, 刘王敦, 鲁甲秀, 李东亿, 河硕勋, 俞利安, 李南仲, 赵良济, 洪璇杓, 金济学, 金达显, 金泳枝 申请人:第一制糖株式会社