专利名称：树枝状大分子的金属配合物、含有该配合物的诊断试剂和制备这些配合物与试剂的方法
技术领域：
本发明涉及权利要求中所定义的主题，即本发明涉及新的树枝状大分子的金属配合物、含有这些化合物的试剂、该配合物在诊断中的应用和制备这些配合物与试剂的方法。
Magnevist(R)(Gd-DTPA/dimeglumine)是最早注册的核自旋断层X射线照相的造影剂(MRI＝磁共振成像)。该造影剂尤其适用于诊断病理部位(例如炎症、肿瘤等)。在通过静脉注射后，该化合物经肾脏排泄；实际未发现肾外排泄。
Magnevist(R)的缺陷是，经静脉注射后，该物质均匀地分散在血管腔和间隙中。因此，不可能相对于周围间隙对脉管划定界限。
为了进行灌注研究，需要一种仅仅分散到血管腔中的造影剂。这样的一种“血库试剂”使得其可能借助核自旋断层X射线照相术划定供血充足组织和供血不足组织的界限，由此诊断局部缺血。
其他应用是借助核自旋断层X射线照相术(所谓的MR-血管造影术)进行的血管照相术和血管通透性疾病(例如恶性肿瘤中)的成像造影术。
迄今为止，对多数被怀疑患有心血管疾病(这种疾病在西方工业化国家引起的死亡频率最高)的患者进行了侵入性诊断研究。在血管造影术中，目前主要是使用含碘造影剂进行X射线诊断。这些研究存在各种缺陷患者面临接受放射的危险以及有不适和紧张，这主要是由下列情况造成的与NMR造影剂相比，含碘造影剂必须使用相当高的浓度，并且不保留在血管腔中。
因此需要可以标记血管腔的NMR造影剂(血库试剂)。这些化合物的区别在于它们具有良好的相容性，而且高度有效(MRI信号强度大大增加)。
人们试图用配合试剂解决至少部分上述问题，这些试剂与大分子或生物分子结合，至今仅仅取得了非常有限的成功。
因此，例如在EP 0088695和EP 0150884中描述的配合物中顺磁中心的数目不足以满意地成像。
大分子通常适合于用作血管造影术的造影剂。但是，例如在给大鼠静脉注射白蛋白-Gd-DTPA(Radiology 1987；162205)后24小时显示出其在肝脏组织中几乎达到30％剂量。此外24小时内仅有20％的剂量得以排泄。
在EP 0233619中描述了以聚赖氨酸-Gd-DTPA为基的血库试剂。但是，这些化合物的缺陷是，这些配合物的排泄不能令人满意，因此包含在这些配合物中的重金属离子不能令人满意地排泄出去。
EP 0430863中描述的级联聚合物配合物提供了改善的排泄能力。但是，它们仍然不能在合理的时间内完全排泄，因此存在从配合物中释放金属的危险。
EP 0326226中已经描述了以碳水化合物例如葡聚糖为基的大分子造影剂。这些化合物的缺陷是它们仅仅能载带4.6％放大信号的顺磁阳离子。
因此，本发明的目的是发现新的主要用于检测血管疾病的诊断试剂，这些诊断试剂不具有上述缺陷，即找到在静脉注射后在研究过程中显示出经血管壁的低扩散性并且仍然可以定量地排泄的金属配合物。
通过本发明实现了上述目的。
已经发现，式I的树枝状聚合物配合物完全适合、并且出人意料地足以用作血管腔的NMR诊断造影剂，而不具有上述缺陷A-(X)b(I)其中A表示基本多重性b的含氮核，其中b是指含氮核的自由价的总数，为1-8，并且X表示由 个再生单元S和2n个成像基团Y组成的基团其中n是产生数目，为1、2、3或4，
S表示式II基团 其中R表示氢原子或甲基，并且对于0≤k≤n-1，α位被其他再生单元S占据，并且对于第n次产生，a位被式III或IV的成像基Y占据
其中R1彼此独立地表示氢或原子序数为21-29、39、42-44或57-83的元素的金属离子等价物，R2表示氢原子、甲基或乙基，它们任选地被1-2个羟基取代，U表示直链、支链、饱和或不饱和的C1-C20亚烷基，该基团任选地含有亚氨基、亚苯基、亚苯氧基、亚苯亚氨基、酰胺基、酰肼、羰基、酯基、氧、硫和/或氮原子，并且它们任选地被羟基、巯基、氧、硫代、羧基、羧烷基、酯基和/或氨基取代，和Z表示-CO、-NH-CO或-NHCS基团，其中该配合物含有至少8-64个上述元素的金属离子，并且游离羧酸基任选地以无机或有机碱或氨基酸的盐形式存在。
因此，本发明的树枝状聚合物配合物由含有1-8个氮原子的核组成，其中首次产生的游离价键分别被3-氨基丙基或3-氨基-2-甲基-丙基--所谓的再生单元S饱和。
其中首次产生的三个游离价键(基本多重性b＝3)为三个再生单元(或者其中基本氨的三个氢原子被三个再生单元S取代)占据的氮原子代表了最简单的树枝状核。这三个再生单元中的每一个含有一个末端氮原子，它的(两个)游离价键是a)被式III或IV的成像基团完全饱和的，或者b)各自被另一个再生单元S占据。
对于上述氮核实例的情况，第二次产生由6(3×2)个再生单元组成，它们带有同样多个末端氮原子。第二次产生的总共12(6×2)的游离价键目前可以是a)被式III或IV的成像基团饱和，或者b)重复被相同的再生单元S占据，即出现第三次产生。第三次产生之后可以任选地进行第四次。
按照本发明，由最多四次产生、但最少一次产生组成的树枝状聚合物配合物是适合的。在这种情况下，最后一次(或第n次)产生具有基本多重性b的2n/2个端氮原子，具有2n个被式III或IV的成像基团完全占据的α-位。在这种情况下，分子中所有的再生单元和成像基团都是相同的。
分子中所含的所有再生单元数目由产生次数确定，并且可以按照下式计算b·Σk=0n-12k]]>其中b表示基本多重性，n表示产生次数，k表示顺序数，从0计算到n-1。
因此，例如由三次产生形成的聚合物含有总共Σk=03-12k[=b·(20+21+22)]=bx7]]>个相同的再生单元。
对于上述氮核情况，基本多重性b＝3，如此总共得到21个(3×7)再生单元S。此外，该聚合物含有b×2n个成像基团，实际情况是有24个(3×23)。
X表示树枝状聚合配合物的一个支链，它由再生单元和相关的成像基团Y的总和组成。
对于级联核A，理论上任何含氮的核都适用，在氮原子上至多有8个游离价键。除了上述氮核之外，可以提及的有例如 基团或β-N-(R5)2基团。但是特别适合的是通式V、VI、VII或VIII基团， 其中R5表示最多具有12个碳原子的烷基、芳基或芳烷基，该基团任选地被1-4个OH基团取代，β表示与基团X的结合位点，因此β的数值等于基本多重性b，W表示最多具有12个碳原子的直链或支链亚烷基、亚芳基或芳基亚烷基，该基团任选地被1-4个氧原子间隔和/或被1-4个羟基取代，p表示1-4，m彼此独立地表示1或2，和r表示1-5。
作为以级联核A为基的胺A(H)b的实例，可以提及的是氨、三-氨基乙胺、1，4，7，10-四氮杂环十二烷(环烯)、1，4，7，10，13，16-六氮杂环十八烷、1，3-二氨基丙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，12-二氨基-4，9-二氧杂十二烷、1，4，8，11-四氮杂十一烷、1，5，8，12-四氮杂十二烷、1，5，9，13-四氮杂十三烷、二亚乙基三胺或四亚乙基四胺。
其中优选的是氨、三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺或环烯，特别优选的是1，4-二氨基丁烷。
基本多重性β等于与各核相应的胺A(II)b的氮-氢键数。因此，氨的基本多重性为3，三(2-氨基乙基)胺的基本多重性为6，二亚乙基三胺的基本多重性为5，1，4，7，10-四氮杂环十二烷的基本多重性为4。
本发明通式I树枝状聚合配合物的制备如下进行将式IX的含末端氨基的树枝状聚合物与配合剂或成像配合物的活性前体进行酰化或加成反应，然后--如果是配合剂活性前体--与上述金属的金属盐或金属氧化物反应，得到所需的聚合物连接的配合物，A-(X′)b(IX)其中A和b具有权利要求1中所述的含义，并且X′表示X，与X相比所不同的是对于n次产生，α-位不被成像基团Y占据，而是被氢原子占据。
用作起始化合物的式IX含有氨基的树枝状聚合物如WO93/14147中所述制备。
如果树枝状聚合配合物由式III的成像基团得到，通常用二亚乙基三胺五乙酸的单酐(J.Pharm.Sci.，68(1979))作为活性前体。后者按照与DE 4232925所公开的类似方法反应，得到相应的酰胺键连接的化合物。
该反应在碱存在下，在液相中进行。
合适的反应基质是例如水，极性溶剂例如四氢呋喃、二恶烷、乙腈、N-甲基吡咯烷酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等及其混合物。该反应优选在pH 8-10(即加入碱例如氢氧化钠或氢氧化钾或三乙胺)，在0-50℃、优选在室温下进行。为了反应完全，优选与2-至3-倍过量的酐进行反应。
然后按照本领域已知的方法，将如此得到的配合剂与金属盐或金属氧化物反应，得到本发明的配合物。
但是，如果由式IV的成像基团得到树枝状聚合配合物，一般用通式X化合物作为活性前体 其中R2具有上述含义，并且U′表示U或者U的前体，R6表示酸保护基和/或金属离子等价物和Z1表示异氰酸基、硫代异氰酸基、活化酸基或内酯基。
如果R6表示酸保护基，则在酰化或加成反应之后该酸保护基按照本领域已知的方式裂解，并且将如此得到的化合物与金属氧化物或金属盐反应，得到本发明的配合物。
可以提及的活化酸基的实例是例如酐、对硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰氯和用碳化二亚胺衍生物就地活化的羧酸。
作为酸保护基R6，适合的有低级烷基、芳基和芳烷基，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、苯基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、二(对硝基苯基)甲基或三烷基甲硅烷基。
酸保护基的裂解按照本领域专业人员已知的方法进行，例如通过水解、氢解、在0-50℃用在水-醇溶液中的碱进行酯的碱皂化反应，用无机酸进行的酸皂化反应，或者例如当为叔丁基酯时，用三氟乙酸皂化。
酰化反应在无机或有机碱存在下，在液相中进行。合适的反应基质是例如四氢呋喃、二噁烷、乙腈、甲酰胺、DMF、DMSO、二甲基乙酰胺、水等或其混合物。
异硫氰酸酯与所需树枝状聚合物的胺的加成反应一般在极性溶剂中进行，所述极性溶剂是例如水，醇例如甲醇、乙醇或异丙醇，四氢呋喃，二噁烷，乙腈，N-甲基吡咯烷酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺或其混合物。
类似地，异氰酸酯的加成反应优选按照文献中已知的方法在无水液相中进行(Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart，NewYork，Vol.Bd.E4(1983)，pp.768-784)。
由配合剂制备金属配合物按照专利EP 0071564、EP 0130934和DE 3401052中所公开的方法进行，即将原子序数为21-29、39、42-44或57-83的元素的金属氧化物或金属盐(例如硝酸盐、乙酸盐、碳酸盐、氯化物或硫酸盐)溶于或悬浮于水和/或低级醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇和/或N，N-二甲基甲酰胺)中，并与等量配合剂的溶液或悬浮液反应。
为了达到生理pH值，最后可以用无机和/或有机碱或氨基酸的阳离子取代酸基的酸性氢原子。
作为碱，适合的有例如钠、钾或锂的无机碱(例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)和/或有机碱，例如伯、仲和叔胺，例如乙醇胺、吗啉、葡糖胺、N-甲基-和N，N-二甲基葡糖胺，以及碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
为了制备中性配合化合物，可以向酸性配合盐的水溶液或悬浮液中加入足量所需的碱以达到所需的中性点。然后可以将所得到的溶液蒸发至干。通常，有利的是，通过加入可与水混溶的溶剂例如低级醇(甲醇、乙醇、异丙醇等)、低级酮(丙酮等)、极性醚(四氢呋喃、二恶烷、1，2-二甲氧基乙烷等)将所形成的中性盐沉淀，如此得到易于分离和易于纯化的结晶。已经证明，在反应混合物的配合过程中尽可能早地加入所需的碱是有利的，如此可以节约反应步骤。
本发明的另一个主题是含有至少一种本发明化合物的试剂。
本发明还涉及制备这些试剂的方法，其特征在于将树枝状聚合配合物溶于水中，与盖仑制剂中常用的添加剂和稳定剂一起制成适于肠道或非肠道给药的形式，以使该配合物的浓度为0.01-1.0mol/l，优选的浓度为0.1-0.5mol/l。然后将所得到的试剂任选地灭菌。根据所诊断的问题，该试剂的用量一般为每公斤体重0.01-0.3mmol剂量。
合适的添加剂是例如生理上无害的缓冲剂(例如tromethamine或二亚乙基三胺五乙酸)、少量相应的聚合树枝状配合剂的添加剂(任选地为生理相容的盐的形式，例如钾盐)以及电解质例如氯化钠和/或任选的抗氧化剂例如抗坏血酸。
理论上，甚至于可以不分离聚合配合化合物也可以制备本发明的诊断试剂。在这种情况下，必须小心地进行配合配合，以使本发明的盐和盐溶液实际上没有毒的未配合的金属离子。
这可以例如借助颜色指示剂例如二甲苯酚，通过在制备过程中对照滴定得以保证。作为最后一道保护措施纯化分离的配合盐。
本发明的其他主题如权利要求所定义。
本发明的物质符合制备NMR诊断用“血库试剂”的各项要求。这些化合物和由这些化合物制备的试剂的区别在于--有利的排泄动力学，--良好的相容性，--高度有效，机体仅需要负荷最少量的外来物质--低渗透性。
尤其是，本发明化合物(或试剂)在研究期间仅仅保留在血管腔中，这样就不会发现由于造影剂扩散到间隙中所造成的NMR图象不清晰。此外，本发明的试剂不仅仅在体外具有高度稳定性，而且在体内也表现出出人意料的高度稳定性，这样在该新的造影剂完全排泄的时间内就不会发生与配合物结合的有毒离子的释放或交换。
下列实施例用于更详细地说明本发明的主题，而非限制该主题。
下面所用的缩写“二氨基丁基-树枝状聚合物-(NH2)32”表示树枝状聚合物，它由二氨基丁基核A和具有32个末端氨基的60个再生单元(-CH2-CH2-CH2-N＜)组成。实施例1a)聚氨基树枝状聚合物二氨基丁基-树枝状聚合物-(NH2)32的[10]-羧基-3，6，9-三(羧甲基)-3，6，9-三氮杂癸酰基]衍生物将3.51克(1毫摩尔)WO 93/14147的实施例VIII中描述的32-胺溶于300毫升水中。然后用2小时，分批加入固体形式的36.02克(96毫摩尔)N3-(2，6-二氧代吗啉代乙基)-N6-(乙氧羰基甲基)-3，6-二氮杂-辛二酸(EP 0331616的实施例13a)，通过加入1N NaOH保持pH在8.5。加烷酸酐后，在pH 11再搅拌该溶液2小时，然后用Amberlite(R)IR 120(H+形式)调节至pH 5，吸滤出离子交换剂。将该溶液超滤(AMICON(R)YM 05-膜)，然后将剩余物冻干。
产量15.6克水含量(Karl Fischer)9.3％100毫克无水配合剂配合物(指示剂二甲酚橙)29.6毫克Gd3+(DTPA占居程度＞91％)b)聚氨基树枝状聚合物二氨基丁基-树枝状聚合物-(NH2)32的[10-羧基-3，6，9-三(羧甲基)-3，6，9-三氮杂癸酰基]衍生物的Gd-配合物将10.0克上述实施例所述的配合剂溶于300毫升水中，并与3.41克Gd2O3(＝2.96克Gd)混合，在80℃搅拌30分钟，冷却后调节pH至7，膜过滤并冻干。
产量12.5克淡黄色絮状冻干物水含量(Karl Fischer)8.2％Gd测定(AAS)22.9％分析(以无水物质计算)计算值C 37.08％ H 4.80％ Gd 24.58％ N 10.81％ Na 0.22％实测值C 37.83％ H 5.19％ Gd 23.10％ N 10.97％ Na 0.51％
权利要求
1.式I的树枝状聚合物配合物A-(X)b(I)其中A表示基本多重性b的含氮核，其中b是指含氮核的游离价的总数，为1-8，并且X表示由 个再生单元S和2n个成象基团Y组成的基团其中n是产生数目，为1、2、3或4，S表示式II基团 其中R表示氢原子或甲基，并且对于0≤k≤n-1，α位被其他再生单元S占用，并且对于第n次产生，a位被式III或IV的成像基Y占据， 其中R1彼此独立地表示氢或原子序数为21-29、39、42-44或57-83的元素的金属离子等价物，R2表示氢原子、甲基或乙基，它们任选地被1-2个羟基取代，U表示直链、支链、饱和或不饱和的C1-C20亚烷基，该基团任选地含有亚氨基、亚苯基、亚苯氧基、亚苯亚氨基、酰胺基、酰肼、羰基、酯基、氧、硫和/或氮原子，并且它们任选地被羟基、巯基、氧、硫代、羧基、羧烷基、酯基和/或氨基取代，和Z表示-CO、-NH-CO或-NHCS基团，其中该配合物含有至少8-64个上述元素的金属离子，并且游离羧酸基任选地以无机或有机碱或氨基酸的盐形式存在。
2.权利要求1的树枝状聚合配合物，其特征在于核A表示氮原子、基团 β-N-(R5)2或通式V、VI、VII或VIII基团， 其中R5表示最多具有12个碳原子的烷基、芳基或芳烷基，该基团任选地被1-4个OH基团取代，β表示与基团X的结合位点，因此β的数值等于基本多重性b，W表示最多具有12个碳原子的直链或支链亚烷基、亚芳基或芳基亚烷基，该基团任选地被1-4个氧原子间隔和/或被1-4个羟基取代，p表示1-4，m彼此独立地表示1或2，和r表示1-5。
3.权利要求1和2的树枝状聚合配合物，其中核A表示基团＞N-(CH2)4-N＜。
4.诊断试剂，其中在生理相容的基质中含有至少一种权利要求1-3的树枝状聚合配合物，以及任选地含有盖仑制剂常用的添加剂。
5.权利要求1的树枝状聚合配合物用于制备NMR诊断或X射线诊断用试剂的用途。
6.制备权利要求1-3的树枝状聚合配合物的方法，其中将式IX的树枝状聚合物与配合剂或成象配合物的活性前体进行酰化或加成反应，然后如果是配合剂活性前体，与上述原子序数金属的金属盐或金属氧化物反应，得到所需的配合物，A-(X′)b(IX)其中A和b具有上述含义，并且X′表示X，与X相比所不同的是对于n次产生，α-位不被成像基团Y占据，而是被氢原子占据。
7.权利要求6的方法，其中包括含有活化羧酸、异氰酸基或硫代异氰酸基的配合物或配合剂作为活性前体。
全文摘要
本发明涉及新的树枝状大分子的金属配合物，该配合物含有8-64个原子序数为21-29、39、42-44或57-83的元素的离子和式I的聚合配合配体，A-(X)其中A、X和b具有不同的含义，本发明涉及含有这些化合物的试剂以及这些试剂在诊断中的应用。本发明还涉及制备这些配合物与试剂的方法。
文档编号A61K49/00GK1138341SQ94194582
公开日1996年12月18日 申请日期1994年12月2日 优先权日1993年12月22日
发明者H·施密特威利彻, J·普拉泽克, A·穆勒, T·夫伦泽尔 申请人:舍林股份公司