(如 式1所示）或如式2所示化合物（1-羟基-4-N-(2, 5-二甲基）_磺酰胺基-萘-2-羧甲基 硫醚）
【附图说明】
[0047] 图1、T521的结构及基本功能，1A，T521的分子结构；1B，T521的量效关系曲线； 1C，T521专一的抑制PlklPBD;1D，T521与WeelA磷酸肽的竞争ELISA实验；1D，T521与 GST-Map205?的竞争ELISA实验；1E，T521在HeLa细胞中的细胞毒性。
[0048] 图2、T521与PlklPBD结合方式验证，2A，T521的时间依赖性抑制作用；2B，T521 的温度依赖性抑制作用；2C，质谱法鉴定T521/PBD结合模式；2D，T521/PlklPBD结合动力 学实验。
[0049] 图3、T521的功能验证，3A，T521时间依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；3B， T521剂量依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；3C，T521引发剂量依赖性的G2/M期阻滞的 定量分析；3D，WesternBlot分析T521引发G2/M期阻滞。
[0050] 图4、T521细胞学分布验证，4A，T521引发剂量依赖性前中期细胞阻滞的定量分 析；4B，激光共聚焦实验（Plkl亚细胞定位改变）；4C，激光共聚焦实验（染色体整列损伤）。
[0051] 图5、T521促进肿瘤细胞凋亡，5A，T521引发HeLa细胞的大量凋亡；5B，T521引发 细胞大量凋亡的定量分析；5C，WesternBlot分析PARP的大量断裂。
[0052] 图6、T521和PlklPBD分子对接示意图。
【具体实施方式】
[0053] 实施例1.细胞的培养
[0054] 人成骨肉瘤细胞MG63、人成骨肉瘤细胞SaOS-2、人骨肉瘤细胞U-20S、人骨髓 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人乳腺癌细胞MCF-7、人子宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞 此1'-116、人结肠癌细胞取'-29、人肝癌细胞11印62、人肝癌细胞此17402、人前列腺癌？03、人 肺癌A459、人胚肺成纤维细胞MRC-5、人胚肾细胞HEK-293,人肝细胞L02,所有细胞均为贴 壁细胞，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，用PBS漂洗细胞后弃掉，之后加适量 胰酶，在室温下消化约2-10min，弃掉消化液，立即加入含10%FBS的培养基，以抑制胰蛋白 酶活力，用弯头吸管反复轻轻吹打培养瓶内细胞，使细胞完全脱离瓶底且吹打使之分散为 单个细胞悬液。再按1:3-1:6比例接种细胞悬液于新的细胞瓶内，然后补加适量完全培养 基，放入培养箱继续培养。培养条件：37 °C，5 %CO2。
[0055] 实施例2化合物T521对PLKlPBD抑制活性的测定
[0056] 本活性测定采用荧光偏振（FP)高通量筛选模型进行化合物活性的测定。
[0057] 测定原理：
[0058] 主要基于荧光分子的偏振性与其受激发时荧光分子的旋转速度密切相关的原理。 当荧光分子受平面偏振光激发时，如果荧光分子在受激发时保持静止状态，那么发射光将 位于同样的偏振平面；如果荧光分子在受激发时保持旋转状态，那么发射光将位于与激发 光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检 测发射光光强（发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迀移率有 关）。如果分子量较大，受激发时荧光分子的旋转速度较慢，则发射光偏振程度较高；如果 分子量较小，受激发时荧光分子的旋转速度较快，则发射光相对于激发光平面将去偏振化。 因此，本研究拟建立的荧光偏振高通量筛选方法将以FlTC-Poloboxtide((FITC-GPMQSpTPL NG-OH;MW: 1583. 61;Purity> 95% ;Aex/Aem:485/535nm，由上海强耀生物科技有限公司 合成）作为PlklPBD的模拟底物，从而进行靶向PlklPBD的小分子抑制剂的活性测定。
[0059] 测定方法：
[0060] (1)将400nMPlklPBD溶液以30yL/孔依次加入到384孔板中，将IOmM的T521 进行倍比稀释后，以终浓度 100yM、50yM、25yM、12. 5yM、6. 25yM、3. 12yM、l. 56yM和 0. 78yM依次加入到384孔板中并做好对应的准确记录，以同时加入0. 3yLDMSO孔作为阴 性对照（NegativeControl，0%Inhibition);以仅含有 60yL30nMFITC-Probe孔为阳性 对照（PositiveControl, 100%Inhibition)。将其混勾后室温缓慢振摇，孵育60min〇
[0061] (2)将60nMFITC-Probe以30yL/孔依次加入到384孔板中的上述各反应孔中， 将其混匀后室温缓慢振摇，避光孵育15min，以多功能微孔板检测仪进行mP检测。
[0062] (3)用如下方程计算待测化合物抑制率：
[0064] 并以GraphPadPrimer5拟合抑制曲线确定化合物T521的表观IC5。。
[0065] 以FP实验对化合物T521进行量效关系分析，表观IC5。~1. 22yM(图1B)，能在 体外抑制PlklPBD的活性。
[0066]分别以FITC-GPMQTSpTPKNG-〇H(MW: 1624. 72;Purity>95 %Xex/ 入em:485/535nm)和FITC-GPLATSpTPKNG-0H(MW:1699.81;Purity> 95 %;Xex/ 入em:485/535nm)作为Plk2PBD2和Plk3PBD模拟底物，以同法检测小分子抑制剂T521对 GST-Plk2PBD和GST-Plk3PBD的选择性抑制作用。当小分子抑制剂T521在上述FP实验 体系终浓度达到500yM时，我们仍然没有发现其对GST-Plk2PBD和GST-Plk3PBD产生明 显的抑制作用（图1C)。上述实验表明，小分子抑制剂T521对PlklPBD的抑制作用具有较 好的体外选择性。
[0067] 选用HeLa细胞作为肿瘤细胞的代表细胞，以MTT方法进行小分子抑制剂T521的 细胞毒性初步评价。在上述实验中，我们发现小分子抑制剂T521对HeLa细胞具有明显的 细胞毒性，其IC5。值约为4.43yM(图1F，表4)。
[0068] 实施例3化合物T521对WeelA磷酸化多肽介导的竞争ELISA实验
[0069] 本活性测定采用WeelA磷酸化多肽介导的竞争ELISA实验进行。
[0070] 测定原理：
[0071] WeelAPhosphop印tide(C-EEEGFGSSpSPVKSPAAP-〇H)是人工合成的PlklPBD的 底物Weel磷酸化模拟肽（SpSmotif)，其可以与PlklPBD蛋白发生特异结合反应。WeelA Peptide中的Cysteine疏基可与96孔板表面的马来酰亚胺基团发生共价反应，进而固定含 有巯基的生物大分子或多肽。
[0072] 测定方法：
[0073] IOOyL/孔4yMWeelAP印tide包被板子，37 °C孵育2h;PBST洗涤3次，每次 2min;加入 200yL/孔BlockingBuffer封闭，37°C2h;PBST洗涤 3 次，每次 2min;在 0.4yM PlklPBD溶液中分别加入终浓度为 400yM、200yM、100yM、50yM、25yM、12. 5yM、 6. 25yM、3. 13yM、l. 56yM的小分子化合物T521，以加入2yLDMSO组作为对照，将上述反 应体系于室温反应45min，然后以IOOyL/孔依次加入到封闭后的包被WeelAp印tide的96 孔板中（设立3组复孔），37°CX60minPBST洗涤3次，每次2min;加入100yL/孔Mouse Anti-HisPrimaryAntibody(1:2000)，37°C孵育 60min;PBST洗涤 3 次，每次 2min;加入 100yL/ 孔Goat-anti-MouseIgG-HRPSecondaryAntibody(1:2000)，37°C孵育 60min; PBST洗涤 3 次，每次 2min;加入 100yL/ 孔TMBSubstrateSolution，37°C避光反应 5min; 加入50yL/孔2MH2SO4终止反应；以多功能酶标仪进行OD45。检测并分析数据。
[0074] 在WeelAp印tide介导的竞争ELISA实验中，发现与DMSO对照组相比，随着T521 浓度的逐渐升高，与包被的WeelApeptide结合的PlklPBD蛋白逐渐减少，导致OD45。逐渐 减低（图1D)。上述结果表明，T521通过结合PlklPBD蛋白而阻断其与WeelAP印tide的 相互作用。
[0075] 实施例4化合物T521阻断GST-Map205?和PlklPBD相互作用
[0076] 本活性测定采用的竞争ELISA实验进行。
[0077] 测定原理：
[0078]DrosophilaMap205 (Microtubule-associatedprotein205)是一类分布于微管 并广泛参与细胞有丝分裂调控过程的大分子蛋白。Map205通过PBM结构域与PBD结构域相 互作用，在有丝分裂间期和胞质分裂过程中将Plkl"锚定"在微管上，在间期和M期转化进 程中发挥重要的调控作用。在Map205的作用下，实现了Plkl生物学活性在细胞内的精细 调控和Plkl在微管的亚定位。但是，PlklPBD与Map205的相互作用是非磷酸化依赖的相 互作用，Map205也是迄今为止发现的唯一一个以非磷酸化形式与PlklPBD相互作用的底 物蛋白。鉴于Map205?和其他磷酸化底物蛋白（WeelA、CdC25C等）相比的原核表达优势 和实验室现有条件，采用操作简便的原核表达体系进行GST-Map205?(276-325aa)的高效 表达与快速纯化，建立模拟底物蛋白Map205?介导的竞争ELISA实验，确证小分子抑制剂 T521能否有效地靶向结合PlklPBD而阻断Map205?/PlklPBD的相互作用。
[0079] 测定方法：
[0080] (l)Map205?的原核表达与分离纯化
[0081] 从GenBank检索Map205?(Residues276-325aa)的基因序列，在目的基因片 段两端各加入BamHI(ggatcc)和XhoI(etcgag)酶切位点并进行目的基因片段的 人工合成。合成后的基因片段在酶切后，直接连接PGEX-4T-1表达载体；将上述构建的 pGEX-4T-l-Map205PBM重组质粒转化表达宿主菌E.coliBL21 (DE3)感受态细胞，随机挑 取的单菌落接种于5mLAmpRLB液体培养基于37°C震荡培养过夜，以终浓度20%的甘油 于-80°C保存菌种备用；将活化的GST-Map205PBM重组工程菌10yL接种于5mLAmpRLB液 体培养基于37 °C震荡培养IOh后，再将其转接于200mLAmpRLB液体培养基中，37°C震荡培 养，生长至0? 9左右时，加入0? 5mMIPTG，37°C诱导4h，4°C3300rpmX30min收集菌 体沉淀。将收集的菌体沉淀重悬于IOmLTBS后，置于冰上并以超声波裂解菌体，待菌体悬 液澄清后结束裂解，4°C12000rpmX30min离心，收集裂解上清液；裂解后的上清液进行饱 和硫酸铵分级沉淀后，再采用琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）层析柱进行分离纯化。分离纯 化后的GST-Map205PBM进行透析，最后进行GST-Map205PBM蛋白浓度测定。
[0082] (2)GST-Map205?介导的竞争ELISA实验进行
[0083] 100yL/ 孔 10yg/mLGST-Map205?包被板子，37°C孵育 2h;PBST洗涤 3 次，每次 2min，再加入 200yL/ 孔BlockingBuffer，37°C封闭 2h;PBST洗涤 3 次，每次 2min;3yg/ mLPlklPBD溶液中分别加入终浓度为 400yM、200yM、100yM、50yM、25yM、12. 5yM、 6. 25yM、3. 13yM、I. 56yM的小分子化合物T521，以加入2yLDMSO组作为对照，将上述 反应体系于室温反应45min，然后以100yL/孔依次加入到封闭后的包被GST-Map205PBM 的96孔板中（设立3组复孔），37°C反应45min;PBST洗涤3次，每次2min;加入100yL/ 孔MouseAnti-HisPrimaryAntibody(1:2000)，37°C反应 45min;PBST洗涤 3 次，每次 2min;加入 100yL/孔Goat-anti-MouseIgG-HRPSecondaryAntibody(UOOO)JTaC反 应 45min;PBST洗涤 3 次，每次 2min;加入 100yL/ 孔TMBSubstrateSolution，37°C避光 反应5min(蓝色）；加入50yL/孔2MH2SOjI止反应（黄色），以多功能酶标仪进行OD45。 检测并分析数据。
[0084] 在GST-Map205?介导的竞争ELISA实验中，发现与DMSO对照组相比，随着T52