1浓 度的逐渐升高，与包被的GST-Map205?结合的PlklPBD蛋白逐渐减少，导致OD45。逐渐减低 (图1E)。上述结果表明，小分子抑制剂T521可以有效地阻断GST-Map205?与PlklPBD的 相互作用。
[0085] 实施例5小分子抑制剂T521的成药性初步评价
[0086]利用ADMETPredictor6. 0(PharmogoCo.，Ltd.)软件进行。
[0087] 测定原理：
[0088] ADMET(药物的吸收，分配，代谢，排泄和毒性）药物动力学方法是当代药物设计 和药物筛选中十分重要的方法。药物早期ADMET性质研究主要以人源性或人源化组织功能 性蛋白质为"药靶"，体外研究技术与计算机模拟等方法相结合，研究药物与体内生物物理 和生物化学屏障因素间的相互作用。药物早期ADME/T性质评价方法可有效解决种属差异 的问题，显著地提高药物研发的成功率，降低药物的开发成本，减少药物毒性和副作用的发 生，并能指导临床合理用药。
[0089] A:Absorption:药物从作用部位进入体循环的过程
[0090]Ddistribution:药物吸收后通过细胞膜屏障向各组织、器官或者体液进行转运 的过程
[0091] M:Metabolism(Biotransformation):药物在体内受酶系统或者肠道菌丛的作用 而发生结构转化的过程
[0092] E:Excretion:药物以原型或者代谢产物的形式排出体外的过程
[0093]T:Toxcity:药物对机体的毒性
[0094] 作用：药物筛选（Drugscreening)药物设计（Drugdesign)药物合成（Drug synthesis)评价制剂（Drugformulation/Biopharmaceutics)中草药研究（TCMherbs research);特点：1基于细胞或生物大分子的分析方法：小样品、高内涵和高通量分析能 力；能够阐明药物性质的分子机理；建立结构-药物性质定量构效关系2人源材料的应用
[0095] 测定方法：
[0096]利用ADMETPredictor6. 0(PharmogoCo.，Ltd.)软件对小分子抑制剂T521进行 ADMET中主要的药理学性质进行了初步的预测分析。
[0097] 小分子抑制剂T521药理学相关的主要理化性质预测的数据（表2)表明，小分子 化合物T521可能具有较低的血浆蛋白结合率和血脑屏障通透性，虽具有一定的肝毒性但 其CYP450抑制作用较低并具有适中的脂溶性，表明，T521具有成为成药先导化合物的开发 潜力。
[0098]表 2
[0099]
[0100] 实施例6小分子抑制剂T521与PlklPBD结合方式的研究
[0101]本活性测定采用等温滴定量热法（IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)。
[0102] 测定原理：
[0103]ITC(IsothermalTitrationCalorimetry)是一种研究生物热力学与生物动力学 的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过 程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多 独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具 有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高（本仪器最小可检测热功率 2nW，最小可检测热效应0. 125uJ，生物样品最小用量0. 4ug，温度范围2°C-80°C，滴定池体 积I. 43ml)。实验时间较短（典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间）， 操作简单（整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射 量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据）。测量时不需 要制成透明清澈的溶液，而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽 管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以 得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系 中的各种特异过程。用途广泛，包括：蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用 和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质_小分子相互作用以及酶-抑 制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作 用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
[0104] 测定方法：
[0105] 将ITC200的样品池和滴定注射器清洗干净，通过水滴水的实验观察噪音水平，确 认其是否清洗干净。滴定实验使用的PlklPBD样品以PBS透析后配成浓度为30yM的 PlklPBD滴定液，同时全部滴定实验操作中均以PBS为滴定缓冲液，反应温度25°C;取出进 样针，检查是否干净，并用缓冲液润洗3次。用进样针慢慢吸取300yLPlklPBD(30yM) 样品，小心去除针管中的气泡。将进样针垂直插入样品池，直到针头触到样品池底部，然后 将进样针略微提起约1mm，缓慢匀速向下推注射器活塞，直至样品池金属管口有溢出。将 进样针进行几次连续的小幅度的吹打，将样品池内可能存在的气泡赶出。慢慢地将进样针 抽出，吸走金属管口处的溢出的样品。用同样的方法在参比池中加入超纯水；将约60yL 小分子化合物T521 (ImM)样品加入PCR管中，将PCR管的管盖打开并固定在卡槽中，使用 SyringeFill命令对滴定注射器进行加样。加样完毕后，将滴定注射器放入样品池中； 按照控制软件的操作要求，在AdvancedExperimentalDesign模式下，本滴定实验主要参 数设置如下：CellTemperature25°C;ReferencePower5ycal/s!InitialDelay60s；CellConcentration30yM；StirringSpeed1000RPM；VolumeL5yL!Duration3s; Spacingl50s。使用同样的设置，用同样的样品滴定PBS缓冲液作为空白对照。最后，以 ORIGIN7.0软件（OriginLab)进行实验数据分析并拟合滴定曲线。
[0106] 以ImM小分子抑制剂T521对30yMPlklPBD蛋白进行滴定。在本滴定实验过程 中，观察到了放热现象的产生。这说明，在其相互作用的过程中的确有由于氢键的较快速生 成而出现的能量变化。在不断调整并优化实验体系后，在每一次的滴定实验完毕后，都没有 观察到滴定热量曲线的平台期。产生这种现象的原因可能与T521/PlklPBD在相互作用过 程中，水桥式氢键较慢的生成速率有关。
[0107] 实施例7小分子抑制剂T521时间、温度依赖性抑制实验
[0108] 依然采用荧光偏振（FP)的方法，除各反应的孵育时间为10min、20min、40min、 60min、80min、100min(时间依赖性）和各反应的反应温度为20°C、25°C、30°C(温度依赖 性）外，其余方法步骤与实施例2相同。
[0109] 结果表明，小分子抑制剂T521的抑制作用具有明显的反应时间依赖性（图2A)。 随着小分子抑制剂T521与PlklPBD反应时间的不断延长，其对PlklPBD与FITC-Probe 结合的抑制作用也不断增强，表观IC5。逐渐减小（表3)。小分子抑制剂T521的抑制作用还 具有明显的反应温度依赖性（图2B)。随着小分子抑制剂T521与PlklPBD反应温度的不 断升高，其对PlklPBD与FITC-Probe结合的抑制作用也不断增强，表观IC5。逐渐减小（表 3) 〇
[0110] 表 3
[0111]
[0112] 实施例8小分子抑制剂T521/PlklPBD结合模式的质谱法鉴定实验
[0113] 本实验以MALDI-T0F/T0F质谱学方法鉴定PlklPBD与小分子化合物T521的结合 模式，根据PlklPBD与饱和量的小分子化合物T521反应前后的分子量的变化即可判断其 结合模式。
[0114] 实验样品的制备：
[0115] 样品①：含 0? 70mg/mL(20yM)PlklPBD的PBS溶液；
[0116] 样品②：10yMPlklPBD+500yMT521(MW:395. 44)室温孵育Ih后的反应体系溶 液。
[0117] 各取2yg上述样品分别以C4-Zip-Tip脱盐后，收集样品（~10yL)。各 取IyL样品再加入等量的芥子酸（sinapinicacid)均匀混合，然后以MALDI-T0F/ TOF(UltrafIeXtreme,Bruker)在2, 000amu/s的条件下采集数据，上述采集的数据再以 FlexAnalysis(Bruker)软件进行数据分析并计算上述样品中PlklPBD蛋白的精确分子 量，比较各样品中的PlklPBD蛋白分子量的变化即可推断PlklPBD/T521的结合模式。在 上述实验中，我们以MALDI-T0F/T0F质谱法对小分子抑制剂T521/PlklPBD结合模式进行 了鉴定与分析。与对照组样品①相比，样品②中的PlklPBD蛋白的分子量并没有发生明显 的改变，PlklPBD蛋白与小分子化合物T521并没有发生共价键式结合反应（图2C)。上述 实验表明，小分子抑制剂T521与PlklPBD以非共价键的作用方式进行了牢固而紧密的结 合。
[0118] 实施例9小分子抑制剂T521/PlklPBD结合动力学实验
[0119] 将终浓度2yM、4yM和8yM的小分子抑制剂T521按照下述方法进行实验：
[0120] 30yL400nMPlklPBD+0. 3yL200yM/400yM/800yMCompoundT521 室温缓慢 振摇，孵育Xmin-加入30yL60nMFITC-Probe室温缓慢振摇，避光孵育15min-检测mP 值并以GraphPadPrimer5拟合曲线并确定小分子抑制剂T521抑制率与反应时间的关系， 以此实验数据反映小分子抑制剂T521/PlklPBD复合物的解离/聚合情况。Xmin指各反 应的孵育时间为l〇min、20min、40min、60min、80min、100mir^P!120min。
[0121] 由于反应时间的限制，将反应时间终点设置到120min。从反应时间IOmin到反应 时间120min，随着反应时间的不断延长，T521的抑制率也随之发生明显的升高。其中4yM 和8以]?的丁521在反应时间7〇111111至12〇111111时，其抑制率始终维持在90%~97%，在反应 的时间终点依然没有发现T521/PlklPBD复合物的明显解离（图2D)。上述实验说明，小 分子抑制剂T521与PlklPBD的相互结合过程是一个典型的慢速结合、慢速解离的"慢上慢 下"过程。
[0122] 实施例10分子对接
[0123] 利用DiscoveryStudio4. 0 软件（DesignedbyAccelrysInc.SanDiego,CA) 软件进行。
[0124] 测定原理：
[0125] 分子对接（MolecularDocking)是指配体与受体之间通过能量匹配和几何匹配而 互相识别的过程，其主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用力、范德华力等。近年来，随着 计算机辅助药物设计技术的飞速发展，分子对接技术已成为基于结构的药物设计和计算机 辅助药物设计的重要方法之一C3DiscoveryStudio4. 0软件（DesignedbyAccelrysInc. SanDiego,CA)是目前全球应用最为广泛的计算机辅助设计平台之一，其在计算分子模拟 和药物设计领域都有着极其广泛的应用。
[0126] DiscoveryStudio4. 0软件有多个模块，主要功能包括：蛋白质的表征（包括蛋 白质-蛋白质相互作用）、同源建模、分子力学计算、分子动力学模拟、基于结构药物设计 (包括配体-蛋白质相互作用、全新药物设计和分子对接）、基于小分子的药物设计（包括 定量构效关系、药效团、数据库筛选、ADMET)和组合库的设计与分析等。
[0127] 测定方法：
[0128] 在以DiscoveryStudio4. 0软件进行的小分子抑制剂T521和PlklPBD的分子 对接中，我们选择roBproteinDataBank)中4H71结构，并根据其结合的Poloxin及TQ 化合物进行小分子化合物活性中心的遴选和定义，确定选择直径为9A。
[0129] 使用DiscoveryStudio4. 0软件将小分子抑制剂T521与PlklPBD的活性中心 (PDBcode4H71)进行分子对接。小分子抑制剂T521完全"锚定"在由PBl和PB2形成 的狭小"沟槽"内并趋于稳定，T521分子结构中的苯磺酰基的氧原子与PBD结构中的水化 His538、Lys540侧链形成较为牢固的氢键。His538、Lys540侧链与磷酸肽pThr/pSer形成 的"钳式"（Pincer-likebond)氢键结构对于PBD与磷酸肽的结合是极其重要的。另外，T521分子结构中的苯环、噁唑环可以与PBD结构Arg557产生Ji键（Pibond)，T521