min。洗 涤完毕后以封闭液进行室温封闭60min。
[0189] (5)以封闭液稀释一抗反应混合液（PrimaryAntibody):
[0190]第 1 组：Anti-hPlklMouseMAb(IF1:1000)+Anti-y-TubulinRabbitPAb(IF 1:1500)
[0191]第 2 组：Anti-a-TubulinMouseMAb(IF1:800)+Anti-y-TubulinRabbit PAb(IF1:1500)
[0192] 将上述抗体稀释液以500yL/孔的量加入到封闭后的6孔细胞板中，室温缓慢振 摇孵育60min。另外，以封闭液孵育组作为空白对照，用以调整和校正激光共聚焦显微镜成 像的荧光强度及背景值。
[0193] (6)小心地吸弃上述一抗稀释液后，HeLa细胞以PBST室温洗涤3次，每次15min。
[0194] (7)以封闭液稀释二抗反应混合液（SecondaryAntibody):
[0195]AlexFluor-488GoatAnti-MouseIgG(IF1:1000)+AlexFluor-594Donkey Anti-RabbitIgG(IFl:1000)
[0196] 将上述抗体稀释液以500yL/孔的量加入到上述洗涤后的6孔细胞板中，室温避 光孵育60min。
[0197] (8)小心地吸弃上述二抗稀释液后，HeLa细胞以PBST室温避光洗涤3次，每次 15min〇
[0198] (9)将少许（约50yL) 2yg/mL的DAPI溶液均匀滴加到各盖玻片上，避光孵育 90s。以PBST室温避光洗涤IOmin。
[0199] (10)封片：
[0200] 将一滴ProLongGoldAntifadeMountant滴加于已标记样品名称的双凹载玻片 上，以镊子小心地夹取对应的盖玻片并以滤纸吸去盖玻片表面及边缘的水，将盖玻片黏附 细胞面向下并小心地将其放置于上述滴加封片剂的双凹载玻片上，小心地按压确数次确保 其贴牢。将上述封片完毕的载玻片放置于切片盒后，4tC避光保存。
[0201] (11)以空白对照组调整和校正激光共聚焦显微镜成像的荧光强度及背景值后，化 合物T521组和DMSO组样品以OlympusFV-1000激光共聚焦显微镜在油镜（X600)下分析 并成像，最后以FV10-ASW3.OViewer(Olympus,Japan)软件处理图像。
[0202] 激光共聚焦实验中，4yM小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞IOh 后，通过OlympusFV-1000激光共聚焦显微镜分析，与DMSO对照组相比，小分子抑制剂T521 可以明显地引发Plkl亚细胞定位（动粒）改变、染色体整列损伤及中心体片段化（图4B、 C)。在整个细胞有丝分裂期，Plkl依赖PBD使其分布于中心体、动粒及赤道板。Plkl对中 心体成熟及双极纺锤体形成进而完成胞质分裂的进程是必须的。与DMSO对照组相比，在小 分子抑制剂T521组中Plkl明显地呈弥散性分布，Plkl在动粒的定位显著地减少。Plkl在 动粒定位的减少也将使微管-动粒稳定连接形成受阻，引发染色体整列损伤。另外，在小分 子抑制剂T521组中也有较多片段化的中心体的形成，中心体片段化将极大地影响中心体 分离及中心体成熟，最终导致纺锤体组装障碍，加剧染色体整列损伤。
[0203] 在上述实验中，小分子抑制剂T521在引发Plkl亚细胞定位改变及中心体片段化 的同时，同样更加明显地引发了染色体整列损伤及纺锤体组装障碍。正是由于小分子抑制 剂T521通过干扰Plkl亚细胞定位而抑制Plkl生物学活性，使一大部分染色体不能通过动 粒与纺锤体结合而产生稳定的微管-动粒连接，进而导致染色体整列损伤。染色体整列损 伤将极大地活化纺锤体组装检查点（SpindleAssemblyCheckpoint,SAC)，抑制后期促进 复合物（AnaphasePromotingComplex,APC)的活性，引发细胞周期阻滞，延迟细胞周期进 程。在小分子抑制剂T521组中由于中心体片段化，这也将导致纺锤体组装障碍，加剧上述 染色体整列损伤及细胞周期阻滞。
[0204] 综上所述，小分子抑制剂T521通过影响Plkl亚细胞定位而抑制Plkl生物学活 性，进而导致染色体整列损伤、中心体片段化及纺锤体组装障碍而发挥抗肿瘤效应。上述实 验数据也进一步证实了PlklPBD是小分子抑制剂T521发挥抗肿瘤效应的一个重要的潜在 靶点。
[0205] 实施例14小分子抑制剂T521对HeLa细胞凋亡的影响
[0206]利用AnnexinV/PI双染法和WesternBlot进行。
[0207] 测定方法：
[0208]AnnexinV/PI双染法
[0209] (1)将HeLa细胞以0? 25%胰酶消化后，以3XIO6AiL接种于6孔细胞培养板，接 种量2mL/孔。将细胞板置于37°C、5%C02条件下培养24h至指数生长期。
[0210] (2)上述HeLa细胞培养24后，以无菌PBS清洗细胞3次，更换分别含有DMS0、 5yM、10yM、15yM小分子抑制剂T521的新鲜培养液。做好相应标记后，将细胞板置于 37°C、5% 0)2条件下继续培养24h。
[0211] (3)取出上述细胞培养板，以PBS小心地漂洗1次，再以0. 25 %胰酶消化细胞， 1000 rpmX5min离心，收集细胞。
[0212] (4)用去离子水按1:4稀释结合缓冲液（IX结合缓冲液：10mMH印es/NaOH、140mM NaCl, 2. 5mMCaCl2pH7. 4) 〇
[0213] (5)将上述消化的HeLa细胞以4°C预冷的PBS洗涤2次，用250yLIX结合缓冲 液悬浮细胞，调节其浓度为5X106/mL。
[0214] (6)取IOOyL的细胞悬液（细胞数约为5XIO5)于EP管中，再加入5yLAnnexin V-AlexaFluor488,室温避光孵育 30min〇
[0215] (7)在上述反应体系中再加入5yLPI，室温避光孵育5~10min。
[0216] (8)将上述细胞悬液过滤到BD流式管中，再补加400yLPBS并做好对应的标记， 立刻以流式细胞仪（BDBiosciences)进行检测和数据统计分析。
[0217]WesternBlot方法进行断裂的PARP检测，对HeLa细胞的晚期凋亡进行更进一步 的确证。
[0218] (1)将HeLa细胞以0.25%胰酶消化后，以3XIO6AiL接种于6孔细胞培养板，接 种量为2mL/孔。将细胞板置于37°C、5%CO2条件下培养24h至指数生长期。
[0219] (2)将上述HeLa细胞培养24后，以无菌PBS漂洗细胞3次，更换分别含有DMS0、 5yM、10yM、15yM小分子抑制剂T521的新鲜培养液。做好相应标记后，将细胞板置于 37°C、5%C02条件下继续培养24h。
[0220] (3)取出上述细胞培养板，将HeLa细胞以PBS小心漂洗1次，以0. 25%胰酶消化 细胞，1000 rpmX5min离心，收集细胞。
[0221] (4)相关抗体使用方法：
[0222] PrimaryAntibody:Anti_PARPRabbitPolyclonalAntibody(WB1:1500)4°C孵 育过夜；SecondaryAntibody:Goat_anti-RabbitIgG-HRP(WB1:3000)室温孵育Ih;ECL 10s显像。
[0223]厶111^^111￥/?1双染实验中，5 1^、1〇1^、15 1^小分子抑制剂1521作用1161^细 胞24h后，通过FACS检测，与DMSO对照组相比，随着小分子抑制剂T521剂量的不断增加， HeLa细胞的凋亡比率逐渐升高（图5A)。
[0224] 与DMSO对照组相比，5yM、10yM、15yM小分子抑制剂T521作用于HeLa细胞24h 后，HeLa细胞的早期凋亡率分别为3. 66%、5. 39%和22. 37%，其早期凋亡率呈明显的递增 趋势；HeLa细胞的晚期凋亡率分别为3. 67%、12. 7%到25. 55%，其晚期凋亡率也依然呈明 显的递增趋势。这些数据表明，小分子抑制剂T521可以明显地引发HeLa细胞发生大量的 凋亡，并且其引发的细胞凋亡具有明显的剂量依赖性（图5B)。
[0225]WesternBlot实验中，5yM、10yM、15yM小分子抑制剂T521 作用HeLa细胞 24h 后，随着T521剂量的增加，PARP逐渐发生断裂并产生89kDa的PARP片段。与DMSO对照组 相比，从5yM开始，HeLa细胞断裂的PARP逐渐增多；在15yM时，由于HeLa细胞的大量凋 亡，断裂的PARP异常增多（图5C)。产生上述现象的主要原因是小分子抑制剂T521通过干 扰Plkl亚细胞定位而影响Plkl的生物学活性，进而激活Caspase3使PARP发生大量的断 裂，促使HeLa细胞发生大量的凋亡。
[0226] 综上所述，小分子抑制剂T521可以引发HeLa细胞发生大量凋亡。
[0227] 最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案 的实质，而不用于对本发明保护范围的限制。
【主权项】
1. 式1所示小分子化合物T521 (5-乙基砜基-2- (4-氟苯基）-4-苯磺酰噁唑）或其结 构类似物在制备用于细胞学研究的制剂或药物中的应用，所述的应用基于T521或其结构 类似物结合Plkl(Polo-likekinasesl)PBD(PoloBoxDomain)从而抑制Plkl与其天然配 体结合的功能，所述的应用为： (1) 制备阻断Plkl与其配体结合的阻断剂的应用； (2) 制备阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂的应用； (3) 制备引发染色体整列损伤及纺锤体组装障碍的调节剂的应用； (4) 制备促进凋亡制剂的应用； (5) 制备抗肿瘤的药物的应用；式1 :化合物T521 (5-乙基砜基-2- (4-氟苯基）-4-苯磺酰噁唑）。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的配体为人工或天然配体，优选为人 工多肽WeelAP印tide、或天然配体GST-Map205P?。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述T521的结构类似物优选为式2所示 化合物（1-羟基-4_N-(2, 5-二甲基）-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚），式2 :1 -羟基-4-N-(2, 5-二甲基）-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的制剂或药物包括，有效量的 式1所示化合物或其结构类似物，以及必要的制剂/药用辅料。5. 由式1所示化合物或其结构类似物制备的如下制剂或药物： (1) 阻断Plkl与其配体结合的阻断剂； (2) 阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂； (3) 引发染色体整列损伤及纺锤体组装障碍的调节剂； (4) 促进调亡制剂； (5) 抗肿瘤药物。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的配体为人工或天然配体，优选为人 工多肽WeelAP印tide、或天然配体GST-Map205P?。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述T521的结构类似物优选为式2所示 化合物（1-羟基-4_N-(2, 5-二甲基）-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚）。8. 根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于，所述的制剂或药物包括，有效量的 式1所示化合物或其结构类似物，以及必要的制剂/药用辅料。9. 一种以PlklPBD活性中心的关键氨基酸空间结构为靶标的Plkl抑制剂的筛选 方法，所述的PlklPBD活性中心的关键氨基酸空间结构为Plkl蛋白的His538、Lys540、 Arg557在具备生物学活性的Plkl蛋白三级结构的空间构象中形成的立体结构，所述的筛 选方法包括： (1) 使用分子对接预测靶标和化合物的相互结合； (2) 使用生化检测方法验证二者的相互结合； 所述的生化检测方法包括但不限于，荧光偏振筛选、竞争性ELISA、等温滴定量热法。10. 使用权利要求9所述方法筛选获得的化合物，优选的，所述化合物为T521 (如式1 所示）或如式2所示化合物（1-羟基-4-N-(2, 5-二甲基）-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫 醚）。
【专利摘要】本发明涉及一种化合物T521或其结构类似物制备抗肿瘤药物的应用，所述的应用基于T521或其结构类似物结合Plk1(Polo-like？kinases1)PBD(Polo？Box？Domain)从而抑制Plk1与其天然配体结合的功能。本发明还涉及一种以Plk1？PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为靶标的Plk1抑制剂的筛选方法。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/192, A61K31/421
【公开号】CN105030767
【申请号】CN201510370118
【发明人】司书毅, 陈云雨, 张晶, 王彦昶, 蒋建东, 李妍, 李东升
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月29日