还可 以与周围诸多活性氨基酸形成范德华力（VanderWaalsinteraction)。上述所形成的化 学键的综合作用，使小分子抑制剂T521牢固地"锚定"于PBD的"沟槽"内，进而阻断PBD与 其磷酸化底物蛋白的结合（图6)。分子对接结果也再次表明了小分子抑制剂T521以非共 价的竞争方式结合PlklPBD。
[0130] 实施例11小分子抑制剂T521的细胞毒性测定
[0131] 利用MTT比色实验进行。
[0132] 测定原理：
[0133] 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶 甲馈（Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO)能溶解细胞中 的甲瓒，用酶联免疫检测仪在560nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一 定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。
[0134] 测定方法：
[0135] (1)从保存细胞冻存管的液氮中取出细胞冻存管后，迅速投入37°C水浴中，轻轻 摇动使其尽快融化。然后从37°C水浴中取出细胞冻存管，用乙醇消毒后，1000 rpmX5min离 心，小心地吸去上清液，再加入ImL培养液重悬细胞并再次离心。用生长培养基适当稀释 后，接种培养瓶，接种密度以5XIO5AiL为宜。将细胞培养瓶放入C02培养箱37°C、5 %C02 静止培养。次日更换培养液，继续培养备用。
[0136] (2)以0. 25%胰蛋白酶消化单层贴壁培养的细胞，用含10%FBS的生长培养基配 成单细胞悬液，以4~5X103/mL接种于96孔细胞培养板，每孔体积200yL，同时96孔细 胞培养板的边缘孔以无菌PBS填充，尽量避免边缘效应。
[0137](3)将上述接种细胞的96孔细胞培养板放入C02培养箱，在37°C、5%C02条件下 静止培养24小时至对数生长期。
[0138] (4)准备从50yM开始以生长培养基2倍梯度稀释的化合物T521，共制备10个 梯度浓度（50yM、25yM、12. 5yM、6. 25yM、3. 13yM、l. 56yM、0. 78yM、0. 39yM、0. 19yM、 0. 09yM)，各梯度浓度的稀释液ImL。
[0139] (5)小心地吸弃各孔内的生长培养基后，将化合物T521的上述10个梯度浓度分别 加入对应96孔细胞培养板，每孔200yL，每个浓度设置5组复孔并做好相应的标记。以加 入DMSO组为阴性对照，只含正常培养基组为阳性对照，各组分别设置5组复孔。
[0140] (6)在37°C、5%C02培养条件下，化合物T521与细胞继续共培养48小时。尔后 小心地吸弃各孔内生长培养基，每孔各加入200yL新鲜生长培养基，继续培养24小时。
[0141] (7)培养24小时后，每孔加入MTT溶液22yL，37°C避光培养4小时后终止培养。 小心地吸弃各孔内培养基后，每孔加入150yLDMS0,避光震荡15min，使甲瓒充分溶解呈紫 色。
[0142] (8)选择560nm波长，在多功能微孔板检测仪上测定各孔OD值，记录并保存数据， 以GraphPadPrism5拟合化合物T521在各细胞株的生长抑制曲线并计算其EC5。值。
[0143] 本实验选用本室保存的12株临床常见的人癌细胞系和3株正常人源细胞，以MTT 比色法进行小分子抑制剂T521的细胞毒性评价。发现小分子抑制剂T521对12株肿瘤细 胞具有明显的细胞毒性，EC50值在1~5yM。但是，小分子抑制剂T521对MRC5、HEK-293 和L02代表的正常细胞的细胞毒性与肿瘤细胞的细胞毒性相比并没有显著差别，其EC5。值 在3~10yM(表4)。上述数据表明，小分子抑制剂T521在体外对肿瘤细胞和正常细胞具 有等同的细胞毒性。
[0144]表 4
[0145]
[0146] 实施例12小分子抑制剂T521对Hela细胞周期的影响
[0147] 利用流式细胞仪和Westernblot进行。
[0148] 测定方法：
[0149] 周期同步化的HeLa细胞是后续FACS和WesternBlot进行细胞周期分析的基础， 周期同步化方法如下：
[0150] (1)将HeLa细胞以0.25%胰酶消化后，以3XIO5AiL接种于6孔细胞培养板，接 种量2mL/孔。将细胞板置于37°C、5%CO2条件下培养24h至指数生长期。
[0151] (2)细胞贴壁后，小心地弃掉生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后加入 终浓度2mMThymidine的生长培养基，在37°C、5%C02条件下继续培养12h。
[0152] (3)小心地弃掉含2mMThymidine的生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。更 换新鲜的生长培养基，在37°C、5% 0)2条件下继续培养12h。
[0153] (4)轻轻地弃掉正常生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后再次加入终浓 度2mMThymidine的生长培养基，在37°C、5%CO2条件下培养12h后，此时所有的HeLa细 胞的周期将被阻滞在G1/S期。
[0154] 本案例将同步化的HeLa细胞以小分子抑制剂T521作用24h，在各设置的时间点收 集细胞并与DMSO对照组比较，以FACS和WesternBlot进行HeLa细胞周期的综合分析。
[0155] 以FACS进行HeLa细胞周期的综合分析：
[0156] (5)在上述含有细胞周期同步化的HeLa细胞6孔细胞培养板中，分别加入含有 10yM小分子抑制剂T521的新鲜培养基继续培养，在0h、8h、12h、16h、20h和24h时间点分 别收集细胞。在WesternBolt实验中，另加入40ng/mL诺考达唑作用16h作为标准M期阻 滞的阳性对照。
[0157] (6)在上述各时间点收集的细胞分别以4°C预冷的PBS漂洗细胞3次并以0. 25% 胰酶消化细胞，再以4°C预冷的PBS重悬细胞，1000 rpmX6min离心并收集细胞。
[0158] (7)小心地弃掉离心后的细胞上清液，缓慢加入4°C预冷的含70%乙醇的PBS固定 液ImL充分悬浮细胞，4°C固定30min。
[0159] (8)固定后的细胞以1200rpmX6min离心并收集细胞，小心地弃掉乙醇固定液。尔 后加入100yLPI/RNaseA溶液并充分混匀，37°C避光孵育30min。
[0160] (9)各样品做好对应的标记后，将细胞过滤到BD流式细胞管，各管再补加400yL PBS后，以FACS进行分析。
[0161] (10)将含5yM、10yM和15yM小分子抑制剂T521的新鲜培养基加入到周期同步 化的HeLa细胞中并在作用16h后收集细胞，固定步骤及PI染色步骤同上所述，以FACS进 行量效关系分析。
[0162] 或，以WesternBlot进行HeLa细胞周期的综合分析：
[0163] (5)将周期同步化的HeLa细胞以5yM、10yM和15yM小分子抑制剂T521作用 16h后，收集细胞。各收集的细胞样品分别加入60yLRIPA细胞裂解液（含100yg/mL PMSF)，充分悬浮细胞，冰浴30min，12000rpmX30min离心，小心地吸取上清液并做好对应 的标记，再以BCA法进行裂解蛋白的定量。裂解蛋白定量后，将各样品的蛋白裂解液浓度调 整为2mg/mL，每次上样量约为30~40yg/Lane。
[0164] (6)准备15%SDS-PAGE，上样量30yg/Lane。SDS-PAGE电泳结束后，将聚丙烯酰 胺凝胶和2张3mmBio-Rad滤纸放入4°C预冷的IX转移缓冲液中浸泡2~5min。
[0165] (7)将裁剪的与胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇润湿30s，再用蒸馏水洗lmin，然后 置于上述IX转移缓冲液浸泡2min。
[0166] (8)在Bio-Rad半干法转膜仪的正极上放置一张平衡过的滤纸，将PVDF膜整齐地 放在滤纸上，然后将聚丙烯酰胺凝胶平铺于PVDF膜上，最后在该凝胶上面再整齐地放置另 一张平衡过的滤纸。用洁净的试管小心地轻压，以去除夹层中的气泡，然后以上述少许IX 转移缓冲液润湿周围，使其保持一定的导电性。最后放置转膜仪的负极并压紧、压实。
[0167] (9)WesternBlot电转条件设置：恒流转膜 0? 2AX30min。
[0168] (10)电转结束后，用镊子小心地取出PVDF膜浸入TBST洗涤1次，再用镊子小心夹 出并室温晾干后，依据预染Marker标示分子量和目的蛋白分子量适当裁剪PVDF膜并做好 相应的标记。
[0169] (11)将裁剪的PVDF膜放入含5%Milk-TBST的封闭液中室温缓慢振摇2h进行封 闭。
[0170] (12)封闭结束后，取出PVDF膜，将其放入到TBST中漂洗3次，每次lOmin。漂洗 完毕后将标记好的PVDF膜放入孵育盒中进行一抗孵育反应。
[0171] (13)按照相关抗体说明书，以封闭液稀释上述抗体并将抗体稀释液置于孵育盒 中，室温缓慢振摇Ih后，4tC过夜。
[0172] (14)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次lOmin。漂洗完毕后再将 PVDF膜放入孵育盒中进行二抗孵育反应。
[0173] (15)用封闭液稀释对应的HPR-SecondaryAntibody(WB1:2000)并将其置于含 有对应一抗孵育完毕的PVDF膜的孵育盒中，室温缓慢振摇1~2h。
[0174] (16)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次lOmin。然后进行显色反应。
[0175] (17)显色反应：在PVDF膜正面（印记目的蛋白一面）加入适量增强型HRP底物 化学发光液（按照说明书配制A:B= 1:1)，立即置于凝胶成像仪中曝光5~IOs后成像。
[0176] 在流式实验中发现10yM小分子抑制剂T521可以明显地使周期同步化的HeLa细 胞发生G2/M期阻滞，延缓细胞周期的进程。在HeLa细胞周期同步化后的8h内，各组细胞 均能通过S期而开始进入G2/M期，这表明小分子抑制剂T521对HeLa细胞的S期没有产生 显著的影响；小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞16h时，与DMSO对照组相 比，其表现出极其明显的G2/M期阻滞作用，40 %左右的HeLa细胞发生明显的G2/M期阻滞； 在整个细胞周期过程中，10yM小分子抑制剂T521始终能使20 %左右的HeLa细胞发生G2/ M期阻滞。但是随着细胞周期的持续进行，仍然会有一部分细胞重新回归到正常的细胞周 期，这可能与小分子抑制剂T521中等强度的抗肿瘤活性相关（图3A、表5)。
[0177]表 5
[0178]
[0179] 依据上述实验结果，选用16h作为G2/M期阻滞的比较时间点。当5yM、10yM、 15yM小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞16h时，与DMSO对照组相比，随着 小分子抑制剂T521剂量的不断增加，HeLa细胞的G2/M期比率逐渐升高（图3)。与DMSO 对照组的G2/M期比率2. 87 %相比，5yM、10yM、15yM小分子抑制剂T521作用于周期同 步化的HeLa细胞16h后，HeLa细胞的G2/M期比率分别达到9. 82 %、39. 86 %和55. 59 %， HeLa细胞的G2/M期比率呈剂量依赖性的增加趋势（图3B、C)。上述数据表明，小分子抑制 剂T521对HeLa细胞的G2/M期阻滞作用具有明显的剂量依赖性。
[0180] 如8七6?181(^实验中，我们发现5 1^、1〇1^、15 1^小分子抑制剂了521作用1611 的HeLa细胞中PlkUCyclinBl、pHH-3随着T521剂量的不断增加而逐渐积聚。其中，15yM 小分子抑制剂T521引发的周期阻滞中含有大量的M期细胞（图3D)aPlkUCyclinBUpHH-3 在HeLa细胞周期中的大量积聚表明，小分子抑制剂T521引发了HeLa细胞的G2/M期阻滞。
[0181] 综上所述，小分子抑制剂T521可以引发HeLa细胞发生G2/M期阻滞。
[0182] 实施例13小分子抑制剂T521对HeLa细胞Plkl亚细胞定位、染色体整列、中心体 成熟及纺锤体组装
[0183] 利用激光共聚焦显微镜进行。
[0184] 测定方法：
[0185] (1)将HeLa细胞以0. 25%胰酶消化后，轻轻吹打为均匀的单细胞悬液。以3XIO4/ mL接种于6孔细胞培养板（每孔各含3片平铺的无菌盖玻片），接种量2mL/孔。将细胞板 置于37°C、5% 0)2条件下继续培养24h至指数生长期。
[0186] (2)将上述HeLa细胞周期同步化。尔后在周期同步化的HeLa细胞中各加入4yM 小分子抑制剂T521和DMSO(对照组）。做好相应标记后，将细胞板置于37°C、5%CO2条件 下继续培养IOh。
[0187] (3)取出上述细胞培养板，以PBS小心地清洗1次。HeLa细胞以甲醇于_20°C固定 15min〇
[0188] (4)小心地吸弃甲醇固定液后，HeLa细胞以PBST室温洗涤3次，每次lO