衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物与酶领域，具体是一种衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银肩病样 皮损药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 银肩病是一种反复发作的、以表皮增殖和炎症为特征，无传染性的红斑鳞肩性皮 肤病，其病因与遗传、感染、变态反应、代谢障碍及自身免疫等有关。该病病程长，外观丑陋， 后期可侵犯多种脏器，给患者身心带来极大伤害。
[0003] 治疗银肩病的药物包括全身系统用药及局部外用药物。早期及病情较轻的银肩病 主要依靠外用药物治疗，目前治疗银肩病的外用药物主要包括： 1.维生素 D3类似物 该类药物导致了银肩病外用疗法的变革，它可以抑制各种皮肤炎症和表皮增殖，有利 于增强细胞的正常角化，临床疗效较好，但是起效慢，平均6-8周后才有显著疗效，主要不 良反应是局部皮肤刺激。另外该类药物价格较高，对于皮损面积较大的患者是一笔较昂贵 的治疗费用。
[0004] 2.焦油类制剂 常用的有2%-10%煤焦油、松馏油、糠馏油及黑豆馏油等，对皮脂腺分泌及表皮基底细 胞有丝分裂和鳞肩的产生有抑制作用，故可治疗银肩病，但可致癌和致畸，目前已很少应用 于临床。
[0005] 3.蒽林制剂及皮质类固醇制剂 蒽林软膏外涂，刺激性较强；皮质类固醇制剂可抑制T细胞活化，达到治疗银肩病的目 的，是目前临床上主要采用的外用治疗药物。该类药物虽然起效快，但副作用较大，且停药 后易致反跳或转变成红皮病型或脓疱型银肩病。
[0006] 中重度银肩病需要系统用药，该类药物主要包括抗肿瘤制剂、免疫抑制剂、免疫调 节剂、维A酸类药物、抗生素及生物制剂等。这些药物多存在副作用大或者长期应用的安全 性和有效性仍不明确等缺点。
【发明内容】
[0007] 本发明就是为了解决现有药物在治疗银肩病中存在的问题，所提出的一种衣原体 蛋白Pgp3在制备抑制银肩病样皮损药物中的应用。
[0008] 本发明是按照以下技术方案实现的。
[0009] 衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银肩病样皮损药物中的应用。
[0010] 所述衣原体蛋白Pgp3与人类抗菌多肽LL-37结合抑制银肩病皮损的发展。
[0011] 本发明获得了如下的有益效果。
[0012] 本发明有效的解决了现有治疗银肩病药物副作用大、长期用药患者人身安全性和 药物有效性无法保障以及治疗费用高等问题。本发明中的衣原体蛋白来源于沙眼衣原体， 相对于化学药物来讲，副作用小，而且治疗效果明显，有望替代目前以外用激素为主的银肩 病治疗药物，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明GST-Pgp3蛋白SDS-PAGE电泳检测图； 图2是本发明Pgp3蛋白SDS-PAGE电泳检测图； 图3是本发明Pgp3蛋白浓缩后SDS-PAGE电泳检测图； 图4是本发明GST-pull down实验结果图； 图5是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠银肩病样皮损外表对比图； 图6是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验对照组皮损组织HE染色图； 图7是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验模型组皮损组织HE染色图； 图8是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验外涂高浓度组皮损组织HE染色图； 图9是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验外涂低浓度组皮损组织HE染色图； 图10是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验外涂对照组皮损组织HE染色图； 图11是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验注射高浓度组皮损组织HE染色图； 图12是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验注射低浓度组皮损组织HE染色图； 图13是本发明Pgp3蛋白干预银肩病样小鼠实验注射对照组皮损组织HE染色图； 图14是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮肤红斑积分趋势图； 图15是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损面积积分趋势图； 图16是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损厚度积分趋势图； 图17是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损总积分趋势图。
【具体实施方式】
[0014] -.核苷酸序列及氨基酸序列 1. Pgp3蛋白由沙眼衣原体质粒P0RF5编码，共795bp(Gene ID:3205528)，其核苷酸 序列如下： ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTGTATAACACTGAAAACTGCGTCTTTGCTGATAATATCAAAGTTGGGCA AATGACAGAGCCGCTCAAGGACCAGCAAATAATCCTTGGGACAACATCAACACCTGTCGCAGCCAAAATGACAGCT TCTGATGGAATATCTTTAACAGTCTCCAATAATTCATCAACCAATGCTTCTATTACAATTGGTTTGGATGCGGAAAA AGCTTACCAGCTTATTCTAGAAAAGTTGGGAGATCAAATTCTTGATGGAATTGCTGATACTATTGTTGATAGTACAG TCCAAGATATTTTAGACAAAATCAAAACAGACCCTTCTCTAGGTTTGTTGAAAGCTTTTAACAACTTTCCAATCACT AATAAAATTCAATGCAACGGGTTATTCACTCCCAGTAACATTGAAACTTTATTAGGAGGAACTGAAATAGGAAAATT CACAGTCACACCCAAAAGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAGATATTATTGCATCAAGAATGGAAGGCGGCG TTGTTCTAGCTTTGGTACGAGAAGGTGATTCTAAGCCCTGCGCGATTAGTTATGGATACTCATCAGGCATTCCTAAT TTATGTAGTCTAAGAACCAGTATTACTAATACAGGATTGACTCCGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTTTAGA AAGCGGTGTGGTATGGGTTAATGCCCTTTCTAATGGCAATGATATTTTAGGAATAACAAATACTTCTAATGTATCTT TTTTAGAGGTAATACCTCAAACAAACGCTTAA 2. Pgp3蛋白的分子量为29kDa，其氨基酸序列如下： I mgnsgfylyntencvfadnikvgqmteplkdqqiilgttstpvaakmtasdgisItvsnn 61 sstnasitigldaekayqlileklgdqildgiadtivdstvqdildkiktdpslglIkaf 121 nnfpitnkiqcnglftpsnietIlggteigkftvtpkssgsmflvsadiiasrmeggvvl 181 alvregdskpcaisygyssgipnlcslrtsitntgltpttyslrvgglesgvvwvnalsn 241 gndilgitntsnvsflevipqtna 3. LL-37蛋白的氨基酸序列 I llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes 4. PCR扩增Pgp3基因片段引物 引物? CGCGGATCCATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG 引物?? ITTTCCTTTGCGGCCGCTTAAGCGITTGITTGAGGTATTA 二· Pgp3蛋白的制备 I. GST-Pgp3蛋白的表达和鉴定 I. I PCR扩增Pgp3基因片段 以沙眼衣原体D型株为模板，以上述引物和引物为引物，PCR扩增Pgp3基因。PCR反 应条件：92°C变性30s ;55 °C退火30s ;72°C延伸30s，末次循环72°C延伸15min，总反应体 积50ul，琼脂糖凝胶电泳鉴定表达产物。
[0015] L 2 重组质粒 pGEX-6P-2-Pgp3 的构建 将PCR产物与pGEX-6P-2分别用BamH I和Not I进行双酶切处理，T4连接酶于15°C 连接4h，构建pGEX-6P-2-Pgp3重组质粒，并转化入DH5a菌(天根生化科技（北京）有限公 司；CB101-02)，用含Amp+选择培养基筛选出阳性菌落。通过1%琼脂糖电泳及基因测序对 阳性菌中提取的质粒进行鉴定。
[0016] 1. 3 重组质粒 pGEX-6P-2-Pgp3 的表达 将pGEX-6P-2-Pgp3重组质粒转化入大肠埃希菌BL21 (天根生化科技(北京)有限公司； CB105-01)中，加入SOC培养基摇匀培养后转入LB固体培养基，37°C培养过夜后挑取单克隆 菌落加入液体LB培养基增量培养，加异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达3h后 4°C、12000rpm离心5min收集菌体，PBS缓冲液重悬沉淀，加溶菌酶、Triton-X 100混匀裂 解后冰上超声破碎菌体至悬液透明，离心后收集上清。
[0017] 2. GST_Pgp3 纯化 GST-Pgp3蛋白上清液中加入经PBS缓冲液（ρΗ7·4)预洗的200ul GST磁珠 （GST beads ; 美国GenScript生物科技有限公司；L00327)，室温振荡Ih后3000rpm、4°C离心5min并弃 上清，用PBS缓冲液洗涤磁珠，上清液进行SDS-PAGE电泳检测。检测结果如图1所示，第三 泳道为GST磁珠吸附、洗脱后得到的纯化的GST-Pgp3蛋白检测情况，可见在54kDa处形成 一条单一的目的条带。
[0018] 向GST磁珠吸附、洗脱后的GST-Pgp3蛋白溶液中加入200ul PBS缓冲液和IOul PP酶以切除GST标签，室温震荡2h后离心5分钟，离心收集Pgp3上清，并进行SDS-PAGE电 泳检测。如图2所示，GST-Pgp3蛋白经PP蛋白酶切除GST标签后，SDS-PAGE电泳显示在 28kDa处出现一条蛋白条带(第三泳道)。
[0019] 3.Pgp3蛋白的浓缩 将纯化后的Pgp3蛋白加入IOkDa超滤管(美国Mi 11 ipore生物技术有限公司），加 IOml PBS缓冲液，4°C，4000 X g离心，每次20min，重复5次，收集浓缩后的Pgp3蛋白，SDS-PAGE 电泳检测。如图3所示，IOk