涂3次，每孔用4%多聚甲醒固定20min后，吸出液体，DPBS洗涂， 甘油封片，激光共聚焦测定各孔细胞中光敏剂的巧光强度巧x:480nm;Em:660nm)。
[0088] 如图1所示，光敏剂1在叶酸受体阳性细胞化eLa)中的巧光强度明显大于在叶酸 受体阴性细胞（A549)中的巧光强度，即叶酸受体阳性细胞对该光敏剂的吸收明显强于叶 酸受体阴性细胞，且运种内吞作用被大量加入的自由叶酸所抑制，说明运种内吞作用是由 肿瘤细胞表面的叶酸受体介导的。
[008引实施例8 :本发明对人宫颈癌化La细胞株的细胞毒性作用
[0090] 将5XIOYml的化La细胞接种到可拆卸的96孔培养板中，培养至对数生长期 后分为15个组，除正常对照组外其余各组分别加入不同浓度的光敏剂1，使其终浓度分 别为 120ymol/L(Cl)、60ymol/L(C2)、30ymol/L(C3)、15ymol/L(C4)、7. 5ymol/L(C5)、 3. 8ymol/L(C6)、I. 9ymol/L(C7)、0. 9ymol/L(CS)、0. 5ymol/L(C9)，每组 4 个复孔。培养 24h后，移去培养液，冷PBS洗3次，换用新鲜培养液，除正常对照组外，其余9个浓度组分 别单独用红光治疗仪垂直照射3min。光照后继续于解箱中培养2地，然后每孔加MT溶液 20yU5mg/mlinPBS)，培养地后弃上清，加入150y1DMS0,振动lOmin，用酶标仪测定 570nm波长处吸收值，WDMSO空白孔调零，并按下式计算细胞存活率（SR) :SR=实验组OD 值/对照组OD值X100%。
[0091] 如图2所示，在所试验的浓度范围内，其光毒性随浓度的增加而增加，当浓度为 15ymol/L时，化La细胞的存活率已降低到20. 1%。
[0092] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的 条件下，可进行各个条件的适当变化。可W理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利 要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
【主权项】
1. 一种还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂，其特征在于，所述光敏剂结构如式III所 示：其中，η = 1 ~5, m = 20 ~227。2. -种用于合成如权利要求1所述光敏剂的卟吩中间体，其特征在于，所述卟吩中间 体结构如式I所示：'5' 其中，η = 1~5。3. 如权利要求2所述的卟吩中间体，其特征在于，所述卟吩中间体是由间-四羟基苯基 卟吩（mTHPC)、2-(η-羟烷基）-二硫吡啶与三光气缩合形成；优选地，所述2-(η-羟烷基） 二硫R比啶选自2-(轻甲基）二硫R比啶、2-(2-轻乙基）二硫R比啶、2-(3-轻丙基）二硫R比啶、 2-(4-羟丁基）二硫吡啶和2-(5-羟戊基）二硫吡啶中的一种；更优选地，选自2-(2-羟乙 基）二硫啦啶、2-(3-轻丙基）二硫啦啶和2-(4-轻丁基）二硫啦啶的一种。4. 一种用于合成如权利要求1所述的光敏剂的叶酸PEG半胱酰胺中间体，其特征在 于，所述叶酸PEG半胱酰胺中间体由叶酸与聚乙二醇二胺、半胱氨酸缩合形成；优选地，叶 酸PEG半胱酰胺中间体的结构如式II所示：其中，Fol为叶酸基团，m = 20~227。5. -种制备如权利要求1所述的光敏剂的方法，其特征在于，所述方法包括： 1)等摩尔的间-四羟基苯基卟吩（mTHPC)、2-(n-羟烷基）-二硫吡啶与等摩尔的三光 气避光缩合反应，然后经柱层析分离纯化，得到含碳酸酯键和双硫键的卟吩中间体；其中， 反应温度彡〇°C且< 50°C，优选为20°C~40°C ;反应时间彡0. 5小时且< 40小时，优选为 2~20小时； 2) 聚乙二醇二胺（NH2PEGNH2),与等摩尔的叶酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后 经柱层析分离纯化，得到叶酸PEG胺；其中，所述聚乙二醇二胺的平均分子量为1000~ 10000,优选为1000~5000 ;反应温度彡(TC且< 100 °C，优选为20°C~60 °C ;反应时间 彡0. 5小时且< 100小时，优选为5~50小时； 3) 步骤2)生成的叶酸PEG胺与等摩尔的半胱氨酸在缩合剂催化下避光缩合反应，然后 经过柱层析分离纯化，得到叶酸PEG半胱酰胺中间体；其中，反应温度多(TC且< KKTC，优 选为20°C~60°C ;反应时间彡1小时且彡50小时，优选为2~20小时； 4) 等摩尔的卟吩中间体与叶酸PEG半胱酰胺中间体发生巯基与双硫键的置换反应，然 后，经柱层析分离纯化，得到靶向光敏剂；其中，反应温度多〇°C且< 50°C，优选为20°C~ 60°C ;反应时间彡0. 5小时且< 20小时，优选为1~10小时。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)是在反应溶剂I中进行的，所述反应 溶剂I选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)和二甲亚砜（DMSO)中的 一种。7. 如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤2~4是在反应溶剂II中进行的， 所述反应溶剂II为二甲亚砜（DMSO)。8. 如权利要求5~7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中反应物 与缩合剂的摩尔比为10:1~1:10,优选为1:1~1:5 ;所述的缩合剂为N，N-二环己基碳 二亚胺（DCC)或N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)和N-羟基二酰亚胺的混合物；优选地，所 述N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)与N-羟基二酰亚胺的摩尔比为10:1~1:10,更优选为 2:1~1:2 ;优选地，所述N-羟基二酰亚胺为N-羟基琥珀酸亚胺（NHS)或N-羟基-5-降冰 片烯-2, 3-二甲酰亚胺（HONb)，更优选为N-羟基琥珀酸亚胺（NHS)。9. 如权利要求5~8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)~步骤4)所述的柱层 析分离纯化是通过下述方法实现的： 以反相硅胶或离子交换树脂为固定相，以质子溶剂或质子溶剂与极性溶剂的混合液为 流动相；其中， 质子溶剂选自水、甲醇、乙醇、醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸-氯化钠缓冲液、氨水-醋酸 胺缓冲液中的一种；极性溶剂选自四氢呋喃、氯仿、乙腈或二氧六环中的一种；所述质子溶 剂与极性溶剂的体积比为10:0~1:10。10. 如权利要求5~9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述叶酸PEG胺是经 离子交换树脂柱层析纯化的，其中，流动相选自水、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液或氨水-醋酸 胺缓冲液； 步骤1)所述卟吩中间体、步骤3)所述叶酸-PEG半胱酰胺中间体以及步骤4)所述靶 向光敏剂是经由反相硅胶柱层析纯化的，其中，流动相选自水、乙腈或水与乙腈的混合液， 所述水与乙腈的混合液中水与乙腈的体积比为1: 〇- 1: 5。
【专利摘要】本发明提供了一种还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂，所述光敏剂是由间-四羟基苯基卟吩(mTHPC)和叶酸基团通过碳酸酯键、二硫键及PEG链依次连接形成的缀合物。本发明还提供了用于制备所述光敏剂的卟吩中间体和叶酸PEG半胱酰胺中间体。本发明进一步提供了所述靶向光敏剂的制备方法。本发明提供了一种具有良好肿瘤靶向性和光动力活性及水溶性的光敏剂，通过在分子结构中引入双硫键和碳酸酯键，使得目标光敏剂在进入细胞后，可在肿瘤细胞的强还原性环境中发生巯基和双硫键的交换反应及分子内的亲核取代反应，从而完整地释放出mTHPC，保证了mTHPC的光动力活性不会因结构的改变而有所降低。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/48, A61K41/00
【公开号】CN105343878
【申请号】CN201510854058
【发明人】李东红, 李鹏熙
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月30日