aster Auto将组织均化（1， lOOrpm、10分钟）。离心（3，OOOrpm、室温、10分钟)分离后，将上清液作为玻璃体基质试样。在 使用前将制备的玻璃体基质试样在超低温冷柜中冷冻保存(设定温度：一 80°C)。
[0170]提取玻璃体后，用生理盐水洗涤视网膜表面。采集视神经乳头附近的脉络膜视网 膜，将其放入到装有〇.5mL含有10mg/mL氟化钠的2%甲酸及2个氧化锆珠(3mm)的2mL管(皮 重已知）中。测定装有脉络膜视网膜的管的重量。利用Shake Master Auto进行均化（1， 100印111、10分钟），然后添加0.51]11^甲醇并进行搅拌。进行离心（11，000印111、4°(3、10分钟），将 上清液作为脉络膜视网膜基质试样。在使用前将其在超低温冷柜中冷冻保存(设定温度：一 80°〇〇
[0171 ]使用内标，利用高效液相色谱/串联质谱仪(HPLC/MS/MS)，确定玻璃体内及用氟化 钠进行了抗分解处理后的脉络膜视网膜组织中的化合物A的含量。以在玻璃体部分包含玻 璃体内观察到的团的状态进行分析。
[0172] 需要说明的是，将在各时间点由各兔眼得到的化合物A的残存率或浓度分别相加， 然后除以分析的眼睛的总数，从而计算出化合物A的平均残存率或浓度。该实验中，在各时 间点示出2只兔的眼睛的平均值(在各时间点为3或4只眼）。
[0173] 玻璃体中的化合物A的残存率通过下述方式进行计算:测定化合物A的浓度后，将 浓度值乘以玻璃体重量，然后除以化合物A的给予量。该测定值表示给予后采集组织时间时 的包含团的玻璃体中的化合物A的残存量。
[0174]脉络膜视网膜中的浓度通过下述方式进行计算:计算出测定的化合物A的量后，用 其除以分析中使用的脉络膜视网膜的量。该测定值表示由玻璃体组织送达至脉络膜视网膜 的化合物A的浓度。
[0175] 4一 3.试验结果及考察
[0176] 将在注入4周后、8周后、12周后及28周后的玻璃体内存在的化合物A的残存率（％) 及注入4周后的脉络膜视网膜中的化合物A的浓度(yg/g)示于表4。
[0177] [表 4]
[0178]
[0179]由表4可知，与比较例1的制剂相比，实施例10及11的制剂显示出足够高的玻璃体 内残存率及脉络膜视网膜浓度。由以上结果确认了本发明的组合物在向玻璃体内给予时具 有优异的持续释放性。
[0180] 5.药理试验
[0181] 使用VEGF诱发兔视网膜血管通透性增高模型，评价化合物A的聚乙二醇400制剂的 有用性。需要说明的是，已有通过在玻璃体内给予VEGF而使脉络膜视网膜的血管通透性增 高的报道（Invest Ophthalmol Vis Sci ·2013;54(1):503 -11.)，VEGF已被广泛用于伴有 视网膜/脉络膜血管异常的病症(例如，糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉 阻塞、视网膜动脉阻塞、渗出型老年黄斑变性等)的制作。
[0182] 5 - 1.受试制剂的制备
[0183] 向1.5g本化合物A中添加12mL聚乙二醇400(日油株式会社），进行搅拌，确认溶解 后，适量添加聚乙二醇400,使总量成为15mL。
[0184] 5 -2.试验方法
[0185] (药物给予方法）
[0186] 对兔肌内给予5 %氯胺酮注射液及2%赛拉嗪注射液的混合液(7:1) lmL/kg进行全 身麻醉，向眼中滴加0.5 %托品酰胺一 0.5 %盐酸苯福林滴眼液进行散瞳。然后，使用27G针， 以不损伤晶状体以及视网膜的方式向玻璃体内注入5yL化合物A溶液（=0.5mg/ eye)。需要 说明的是，按照同样方式向基剂给予组的兔给予聚乙二醇400。
[0187] (VEGF诱发兔视网膜血管通透性增高模型制作方法）
[0188] 给予药物2个月后，对兔肌内给予5%氯胺酮注射液及2%赛拉嗪注射液的混合液 (7:1 )lmL/kg进行全身麻醉，向眼中滴加0.5%托品酰胺一0.5%盐酸苯福林滴眼液进行散 瞳。然后，使用27G针，以不损伤晶状体以及视网膜的方式向玻璃体内注入I OyL的VEGF (50μ g/mL)。需要说明的是，按照同样方式向正常组的兔给予PBS(磷酸缓冲液)以代替VEGF。
[0189] (评价方法）
[0190] 给予VEGF 2天后，向兔静脉内给予0.1mL/kg的10%荧光素 (fluorescein)溶液。给 予荧光素2小时后，利用荧光光度测定法测定玻璃体中的荧光素浓度，将其作为视网膜血管 通透性的指标。
[0191] 然后，按照式1，计算出所给予的药物对VEGF引起的视网膜血管通透性增高的抑制 率（％)。将结果示于表5。需要说明的是，各组的例数为8,将其平均值用于计算抑制率。
[0192] [式1 ]视网膜血管通透性抑制率（％ ) = (Ay-Az)/(Αγ-Αχ) X 100
[0193] Αχ:基剂（=聚乙二醇400)给予+PBS给予组的玻璃体中荧光素浓度
[0194] Ay:基剂（=聚乙二醇400)给予+VEGF给予组的玻璃体中荧光素浓度
[0195] Az:化合物A给予+VEGF给予组的玻璃体中荧光素浓度
[0196] [表 5]
[0198]由以上结果可以确认，化合物A的聚乙二醇400制剂即使在向玻璃体内给予2个月 后也对VEGF诱发的视网膜血管通透性增高有优异的抑制效果。由此表明本发明的组合物对 糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、渗出型老年黄 斑变性等与视网膜/脉络膜血管异常相关的眼后段疾病长期持续地具有显著的效果。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其含有式(1)表示的化合物或其盐及聚乙二醇，式中， R1表不氨原子、面素原子、径基、Cl-6烷基、被1个或多个面素原子取代的Cl-6烷基、Cl-6烧 氧基或被1个或多个面素原子取代的Cl-6烷氧基； R2表示氨原子、Cl-6烷基、Cl-6烷基幾基或被1个或多个径基取代的Cl-6烷基幾基。2. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，式(1)中， Rl表示Cl-6烷氧基或被1个或多个面素原子取代的Cl-6烷氧基； R2表示Cl-6烷基幾基或被1个或多个径基取代的Cl-6烷基幾基。3. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，式(1)中， Rl表示被1个或多个面素原子取代的Cl-6烷氧基； R2表示被1个或多个径基取代的Cl-6烷基幾基。4. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，式（1)表示的化合物为2-[[[2-[(径基乙酷 基)氨基]一 4-化晚基]甲基]硫基]一 N-[4 -（立氣甲氧基)苯基]一 3-化晚甲酯胺。5. 如权利要求1~4中任一项所述的药物组合物，其中，聚乙二醇的平均分子量在100~ 2000的范围内。6. 如权利要求1~4中任一项所述的药物组合物，其中，聚乙二醇的平均分子量在200~ 600的范围内。7. 如权利要求1~4中任一项所述的药物组合物，其中，聚乙二醇为阳G400。8. 如权利要求1~7中任一项所述的药物组合物，其中，在所述药物组合物中，聚乙二醇 的含量为70~99.99 % (w/w)。9. 如权利要求1~8中任一项所述的药物组合物，其中，式（1)表示的化合物或其盐的含 量为 0.01 ~20%(w/v)。10. 如权利要求1~9中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗眼部疾病。11. 如权利要求10所述的药物组合物，其中，眼部疾病为老年性黄斑变性、糖尿病性视 网膜病、早产儿视网膜病、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、视网 膜血管瘤样增生、近视性脉络膜新生血管、糖尿病性黄斑水肿、眼肿瘤、放射性视网膜病变 (radiation retinopathy)、虹膜红变、新生血管性青光眼或增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)o12. 如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于玻璃体内给予。13. 如权利要求12所述的药物组合物，所述药物组合物每1次给予1~10化L。14. 如权利要求12或13所述的药物组合物，所述药物组合物周1次~3年1次的间隔 给予。15. -种将式（1)表示的化合物或其盐稳定化的方法，所述方法是通过将式（1)表示的 化合物或其盐溶解在聚乙二醇中而进行的。16. 如权利要求15所述的方法，其中，式（1)表示的化合物为2-[[[2-[(径基乙酷基） 氨基]-4-邮晚基]甲基]硫基]-Ν-[4-(Ξ氣甲氧基巧基]-3-邮晚甲酯胺。
【专利摘要】本发明涉及含有式(1)表示的化合物或其盐及聚乙二醇的药物组合物。
【IPC分类】A61P27/02, A61P35/00, A61K31/444, A61P3/10, A61K9/08, A61K47/34, A61P27/06
【公开号】CN105555271
【申请号】CN201480051151
【发明人】村井健二, 山田和人
【申请人】参天制药株式会社
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月18日
【公告号】CA2924628A1, EP3047850A1, WO2015041294A1