专利名称：一种制备刺激响应性二氧化硅纳米粒子的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法。特别是涉及一种表面 硫代烷基氨-2-硫吡啶分子功能化的二氧化硅纳米粒子，在含巯基的有机或生物分子进攻 下发生硫硫键的断裂，释放出2-巯基吡啶小分子，从而实现二氧化硅纳米粒子对含巯基的 有机或生物分子的剌激响应特性。
背景技术：
近些年来，具有能对外界环境剌激(如pH，温度和光强度)产生响应的纳米粒 子，因为可以用在药物靶向释放和生物分离等领域而成为研究的热点。例如美国专利 US20090123544和公开号为CN 101560062的中国专利。温度和pH敏感的纳米粒子在还没 有到达目标区域就开始对环境有响应行为，因此达不到很好的靶向定位的目的，同时也不 能满足在药物控制释放哈生化检测中对分子的定向识别的要求，在实际应用中具有一定的 局限性。例如在US 20090123544专利中，改变传统对温度敏感的单一聚N-异丙基丙烯酰 胺分子，通过合成含有聚氨酯，聚酰胺以及二硫聚酰亚胺的具有生物降解功能的聚合物分 子，和聚N-异丙基丙烯酰胺分子交联获得了在pH值为7， 5， 3时，聚合物分子最低临界转变 温度分别为30. 5， 31. 0，34. 5°C。在CN 101560062中，将基片用浓硫酸和双氧水的混合溶 液进行表面清洁处理后，再进行环氧硅烷偶联剂自组装，然后再采用光引发剂进行接枝，获 得了温度剌激性响应的聚合物刷。尽管这些温度敏感性材料在生物医学领域有广泛的应 用，但这些材料不能满足现代生化检测分析及药物控制释放等领域的发展要求。因此设计 和制备具有高靶向定位剌激响应性的纳米材料仍具有重要意义。吡啶二硫键能与含巯基的 药物，目标配体或其它功能性分子在温和的反应条件下通过形成新的二硫键结合并释放出 副产物吡啶醌类小分子(参考文献D. Bontempo， K. L. Heredia， B. A. Fi sh， H. D. Maynard， J. Am. Chem. Soc. 2004， 126， 15372-15373) 。 二硫键本质上具有化学敏感性和能对各种二 硫键还原剂，特别是还原型的谷胱甘肽，具有明显的响应特性并被他们裂解(参考文献 K. L. Heredia， D. Bontempo， T. Ly， J. T. Byers， S. Halstenberg， H. D. Maynard， J. Am. Chem. Soc. 2005，127，16955-16960 ;M. El sayed， A. Hoffman, P. S. Stayton， J.Control. Release 2005， 101,47-58)。因此，通过二硫键交联表面修饰的纳米粒子，在含巯基的化合物进攻下 发生硫硫键断裂，从而可以实现制备对还原性巯基化合物具有剌激响应特性的纳米材料， 满足其在生化检测分析，药物控制释放及基因靶向治疗应用方面的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法。该方法制 备的二氧化硅纳米粒子具有很好的分子识别功能，拓宽剌激响应性材料局限于对温度，PH 值以及光强度具备剌激响应特性的领域。
本发明的目的是这样实现的 本发明的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法包括以下步骤
1)首先合成硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐(AE-S-S-Py); 1-1)将0. l-10g巯基嘧啶二硫溶解在l-100ml甲醇和0. 01_20ml乙酸组成的溶液 中，0.01-20g巯基胺盐酸盐(如巯基乙胺盐酸盐)溶解在另一l-100ml甲醇中，常温下将后 者滴加到前者反应2-48小时，之后反应液蒸发除去溶剂，得到硫代烷基氨_2-硫吡啶盐酸 盐粗产品； 2)制备粒径分布均匀的二氧化硅纳米粒子将10-200ml无水乙醇与1-lOOml的 正硅酸乙酯混合均匀，然后向混合溶液中慢慢加入10-200ml质量分数为28%的氨水，水浴 加热25-85t:搅拌反应1-24小时，离心分离，水洗至中性，制得粒径分布均匀的二氧化硅纳 米粒子； 3)制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子； 3-1)取步骤2)制得的二氧化硅纳米粒子O. 5g，分散在100ml甲苯溶液中，然后向 反应液中加入5ml氨基硅烷(如氨丙基三乙氧基硅烷)，在8(TC氮气保护条件下，搅拌反应 l-10小时，然后离心l-30分钟，经过N，N-二甲基甲酰胺洗涤，再离心分离得到氨基功能团 表面修饰的二氧化硅纳米粒子； 3-2)取步骤3-l)所制得的氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在 100mlN， N- 二甲基甲酰胺溶液中，向反应溶液中加入lOmmol 丁二酸酐，混合物在8(TC氮气 保护条件下，搅拌反应1-10小时，然后离心1-30分钟，经过二氯甲烷洗涤，再离心分离得到 羧基官能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子； 3-3)取步骤3-2)所制得的羧基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在50ml 的二氯甲烷溶液中，向混合溶液中加入縮合剂(如1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺)，最后加入l-50mg步骤1)合成的硫代烷基氨-2-硫吡啶， 氮气保护下常温搅拌反应1-48小时，然后离心分离1-30分钟，分别经过甲醇和缓冲溶液洗 涤，再离心分离得到剌激响应性二氧化硅纳米粒子； 4) 二氧化硅纳米粒子的剌激响应性将上述步骤3-3)所制得的剌激响应性二氧 化硅纳米粒子分散在缓冲溶液(如PBS)中，将巯基化合物(如还原型谷胱甘肽)加入到剌 激响应性二氧化硅纳米粒子缓冲溶液中(如0. 1M PBS，pH 7. 4)，振荡反应1-24小时，离心 分离，取上层清液作紫外光谱检测，在343nm处出现明显吸收峰，此峰归属于硫硫键断裂生 成的小分子2-巯基吡啶。2-巯基吡啶小分子的生成证明二氧化硅纳米粒子对含巯基的化 合物具有良好的分子识别功能，并且有明显的剌激响应特性。 在上述的技术方案中，将步骤1-1)得到的硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐粗产品进
行提纯，采用乙醚洗涤，乙醇溶解，再乙醚沉淀的工艺，产率20% -90% ; 在上述的技术方案中，所述的氨基硅烷包括氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲
氧基硅烷； 在上述的技术方案中，所述的縮合剂包括N， N' - 二环己基碳二亚胺和4- 二甲氨 基吡啶或1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
在上述的技术方案中，所述的缓冲溶液成分包括氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 (即PBS)，pH值为7.4 ; 在上述的技术方案中，所述的硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐为硫代氨乙基-2-硫 吡啶盐酸盐或硫代氨丙基_2-硫吡啶盐酸盐；
4
在上述的技术方案中，所述的巯基氨盐酸盐包括巯基乙胺盐酸盐或巯基丙胺盐 酸盐； 在上述的技术方案中，所述的巯基化合物包括含巯基的有机或生物分子，如还原 型谷胱甘肽，巯基乙酸，巯基乙醇，巯基丙醇，2， 4- 二氨基-6-巯基嘧啶，巯基丙酸，L-半胱 氨酸，2-巯基苯胺中的一种； 在上述的技术方案中，所用的反应试剂均从市场上购买，且纯度至少为化学纯，或 者化学纯以上的试剂。 本发明与现有技术比较具有以下优点 化学共价偶联的方法使二氧化硅纳米粒子表面功能化，与传统的修饰方法包括物 理吸附、物理化学气相沉积、静电相互作用相比具有效率高、选择性好、产物稳定，并能使纳 米粒子表面修饰分子具有多样性的特点。通过该方法在二氧化硅纳米粒子表面形成硫代烷 基氨_2-硫吡啶盐酸盐自组装单分子层，从而具有很好的识别含巯基的有机或生物分子的 能力，该纳米粒子具有剌激响应性高，稳定性好的特点。
图1是利用本发明的方法制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子示意图。 图2利用本发明的方法制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子进行剌激响应性实验
时，硫硫键断裂，生成小分子2-巯基吡啶的紫外光谱图，其中纵坐标为紫外吸光强度，横坐
标为波长。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细地说明
实施例1 : 制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的具体步骤如下
1)合成硫代烷基氨_2-硫吡啶盐酸盐 将1. lg(5mmo1)巯基嘧啶二硫溶解在10ml甲醇和0. 2ml乙酸组成的溶液中， 0. 25g(2. 2mmo1)巯基乙胺盐酸盐溶解在另一个10ml甲醇中，在常温下将后者滴加到前者 后反应48h。反应后减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物(硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐粗 产品)。在50ml乙醚洗涤后，产物溶解在10ml乙醇中并用400ml乙醚沉淀得到白色固体 0. 4g。产率:77%,H NMR: S ppm(400M，CDC13)8. 66(d，lH)，7. 75(t，lH)，7. 48(d，lH)，7. l(t， 1H) ， 3. 46 (t， 2H) and 2. 8 (m， 2H)。
2)制备二氧化硅纳米粒子 50ml无水乙醇与5ml的正硅酸乙酯混合均匀，然后向混合溶液中慢慢加入50ml质 量分数为28%的氨水，水浴加热6(TC搅拌反应24小时，离心分离，水洗至中性，制得粒径分 布均匀的二氧化硅纳米粒子。
3)制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子 取O. 5g二氧化硅纳米粒子分散在100ml甲苯溶液中，然后加入5ml氨丙基三乙氧 基硅烷，在8(TC氮气保护条件下，搅拌反应6小时，然后离心15分钟，经过N， N-二甲基甲酰 胺洗涤，再离心分离得到氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子。将制得的氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在100ml N，N-二甲基甲酰胺溶液中，向反应溶液中加入 lOmmol 丁二酸酐，混合物在8(TC氮气保护条件下，搅拌反应4小时。然后离心20分钟，经过 二氯甲烷洗涤，再离心分离得到羧基官能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子。将羧基功能团 表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在50ml的二氯甲烷溶液中，向混合溶液中加入縮合剂 1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(8mmo1)和N_羟基琥珀酰亚胺(20mmol)， 最后加入30mg硫代烷基氨_2-硫吡啶，氮气保护下常温搅拌反应24小时，然后离心分离20 分钟，分别经过甲醇和PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤，再离心分离得到剌激响应性二氧化硅 纳米粒子。 4) 二氧化硅纳米粒子的剌激响应性 取上述制得的剌激响应性二氧化硅纳米粒子分散在缓冲溶液中，将0. 2mol *L—1还 原型谷胱甘肽加入到剌激响应性二氧化硅纳米粒子缓冲溶液中，振荡反应12小时，离心分 离，取上层清液作紫外光谱检测，在343nm处出现明显吸收峰，此峰归属于硫硫键断裂生成 的小分子2-巯基吡啶，谱图如图2所示。通过2-巯基吡啶小分子的生成，二氧化硅纳米粒 子对含巯基的化合物具有良好的分子识别功能，并且有明显的剌激响应特性。
本实施例所用的反应试剂均从市场上购买的分析纯试剂。
实施例2 : 按照实施例1中1)的步骤，用巯基丙胺盐酸盐制备硫代烷基氨-2-硫吡啶 盐酸盐。3g(13.6mmo1)巯基嘧啶二硫溶解在40ml甲醇和1ml乙酸组成的溶液中。 4. 95g(54. 4mmo1)巯基丙胺盐酸盐溶解在另一个40ml甲醇中。在常温下将后者滴加到前者 后反应48h。反应后减压蒸发除去溶剂得粗产品。在100ml乙醚洗涤后，产物溶解在50ml 乙醇中并用400ml乙醚沉淀得硫代烷基氨_2-硫吡啶盐酸盐。 按照实施例1中3)的步骤，用氨丙基三甲氧基硅烷处理二氧化硅纳米粒子。取 0. 5g 二氧化硅纳米粒子分散在100ml甲苯溶液中，然后加入5ml氨丙基三甲氧基硅烷，在 6(TC氮气保护条件下，搅拌反应3小时，然后离心15分钟，经过N，N- 二甲基甲酰胺洗涤，再 离心分离得到氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子。 将羧基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在50ml的二氯甲烷溶液中，向 混合溶液中加入N， N' -二环己基碳二亚胺(lOmmol)和4-二甲氨基吡啶(lmmol)，最后加 入30mg硫代烷基氨_2-硫吡啶，氮气保护下常温搅拌反应24小时，然后离心分离20分钟， 分别经过甲醇和PBS缓冲溶液洗涤，再离心分离得到剌激响应性二氧化硅纳米粒子。
按照实施例1中4)的步骤，取制得的剌激响应性二氧化硅纳米粒子分散在缓冲溶 液中，将0. 2mol L—1巯基丙醇加入到剌激响应性二氧化硅纳米粒子缓冲溶液中，振荡反应 24小时，离心分离，取上层清液作紫外光谱检测。
其余步骤与实施例1相同。
实施例3 : 按照实施例1中1)的步骤，将0. lg(O. 5mmo1)巯基嘧啶二硫溶解在5ml甲醇和 0. lml乙酸组成的溶液中，O. 025g(0. 2mmo1)巯基乙胺盐酸盐溶解在另一个5ml甲醇中，在 常温下将后者滴加到前者后反应24h。反应后减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物(硫代烷 基氨_2-硫吡啶盐酸盐粗产品)。在15ml乙醚洗涤后，产物溶解在5ml乙醇中并用40ml乙 醚沉淀得到白色固体O. lg。产率67% ,H NMR : S ppm(400M， CDC13) 8. 56 (d， 1H) ， 7. 65 (t，
61H) ， 7. 42 (d， 1H) ， 7. 1 (t， 1H) ， 3. 43 (t， 2H) and 2. 6 (m， 2H)。 按照实施例1中2)的步骤，10ml无水乙醇与1ml的正硅酸乙酯混合均匀，然后向 混合溶液中慢慢加入10ml质量分数为28%的氨水，水浴加热6(TC搅拌反应24小时，离心 分离，水洗至中性，制得粒径分布均匀的二氧化硅纳米粒子。 按照实施例1中4)的步骤，巯基化合物还包括巯基乙酸，巯基乙醇，2，4-二氨 基_6-巯基嘧啶，巯基丙酸，L-半胱氨酸，2-巯基苯胺。
其余步骤与实施例1相同。
实施例4 : 按照实施例1中1)的步骤，将10g(46mmo1)巯基嘧啶二硫溶解在100ml甲醇和 20ml乙酸组成的溶液中，2. 5g(22mmo1)巯基乙胺盐酸盐溶解在另一个100ml甲醇中，在常 温下将后者滴加到前者后反应48h。反应后减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物(硫代烷基 氨-2-硫吡啶盐酸盐粗产品)。在150ml乙醚洗涤后，产物溶解在100ml乙醇中并用400ml 乙醚沉淀得到白色固体3. 8g。产率:71%;^ NMR : S ppm(400M，CDCl3)8. 62(d， 1H) ， 7. 65(t， 1H) ， 7. 43 (d， 1H) ， 7. 1 (t， 1H) ， 3. 42 (t， 2H) and 2. 8 (m， 2H)。 按照实施例1中2)的步骤，200ml无水乙醇与20ml的正硅酸乙酯混合均匀，然后 向混合溶液中慢慢加入200ml质量分数为28%的氨水，水浴加热4(TC搅拌反应24小时，离 心分离，水洗至中性，制得粒径分布均匀的二氧化硅纳米粒子。
其余步骤与实施例1相同。
权利要求
一种制备刺激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，包括以下步骤1)首先合成硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐将0.1-10g巯基嘧啶二硫溶解在1-100ml甲醇和0.01-20ml乙酸组成的溶液中，0.01-20g巯基胺盐酸盐溶解在另一1-100ml甲醇中，常温下将后者滴加到前者反应2-48小时，之后反应液蒸发除去溶剂，得到硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐粗产品；2)制备粒径分布均匀的二氧化硅纳米粒子将10-200ml无水乙醇与1-100ml的正硅酸乙酯混合均匀，然后向混合溶液中慢慢加入10-200ml质量分数为28％的氨水，水浴加热25-85℃搅拌反应1-24小时，离心分离，水洗至中性，制得粒径分布均匀的二氧化硅纳米粒子；3)制备刺激响应性二氧化硅纳米粒子3-1)取步骤2)制得的二氧化硅纳米粒子0.5g，分散在100ml甲苯溶液中，然后向反应液中加入5ml氨基硅烷，在80℃氮气保护条件下，搅拌反应1-10小时，然后离心1-30分钟，经过N，N-二甲基甲酰胺洗涤，再离心分离得到氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子；3-2)取步骤3-1)所制得的氨基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在100mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，向反应溶液中加入过量的丁二酸酐，混合物在80℃氮气保护条件下，搅拌反应1-10小时，然后离心1-30分钟，经过二氯甲烷洗涤，再离心分离得到羧基官能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子；3-3)取步骤3-2)所制得的羧基功能团表面修饰的二氧化硅纳米粒子分散在50ml的二氯甲烷溶液中，向混合溶液中加入缩合剂，最后加入1-50mg步骤1)合成的硫代烷基氨-2-硫吡啶，氮气保护下常温搅拌反应1-48小时，然后离心分离1-30分钟，分别经过甲醇和缓冲溶液洗涤，再离心分离得到刺激响应性二氧化硅纳米粒子。
2. 按权利要求1所述的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于采用乙 醚洗涤，乙醇溶解，再乙醚沉淀的工艺将步骤1)得到的硫代烷基氨_2-硫吡啶盐酸盐粗产 品进行提纯。
3. 按权利要求1所述的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于步骤 3-1)中所述的氨基硅烷包括氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。
4. 按权利要求1所述的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于步骤 1)中所述的硫代烷基氨_2-硫吡啶盐酸盐包括硫代氨乙基-2-硫吡啶盐酸盐或硫代氨丙 基-2-硫吡啶盐酸盐。
5. 按权利要求1所述的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于步骤1) 中所述的巯基氨盐酸盐包括巯基乙胺盐酸盐或巯基丙胺盐酸盐。
6. 按权利要求1所述的制备剌激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于步骤4) 中所述的巯基化合物包括含巯基的有机或生物分子为还原型谷胱甘肽，巯基乙酸，巯基乙 醇，巯基丙醇，2， 4- 二氨基-6-巯基嘧啶，巯基丙酸，L-半胱氨酸，2-巯基苯胺中的一种。
全文摘要
本发明提供一种制备刺激响应性二氧化硅纳米粒子的方法，该方法是在二氧化硅纳米粒子表面通过硅烷化处理，得到末端带羧基官能团的纳米粒子，用合成的硫代烷基氨-2-硫吡啶盐酸盐通过化学共价偶联的方法在纳米粒子表面形成自组装单分子层，然后和还原型的谷胱甘肽混合，通过硫硫键的断裂生产巯基吡啶小分子，离心后取上层清液紫外检测在343nm处有明显吸收峰，以此证明硫硫键对含硫化合物的刺激响应性，由此制备对含硫的有机或生物分子刺激响应性的二氧化硅纳米粒子。该方法制备的纳米粒子具有很好的分子识别功能，刺激响应性高，稳定性好的特点。
文档编号C01B33/18GK101792150SQ20101013261
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者伍继君, 周阳, 王仕兴, 秦博, 谢克强, 马文会, 魏奎先 申请人:昆明理工大学