专利名称：鉴别赤潮球形棕囊藻的核苷酸序列、核酸分子探针和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法检测环境(海洋)微型生物的技术领域，具体地说，是涉及一种用于鉴别赤潮生物——球形棕囊藻的核苷酸序列以及核酸分子探针和用其鉴别赤潮棕囊藻的方法。
背景技术：
棕囊藻Phaeocystis是全球广布的海洋微藻，有的种类可大量繁殖，形成赤潮，给水产养殖业造成严重损失。近年来，有害棕囊藻赤潮的发生在全球有扩增的趋势。面对日益恶化的海洋环境，赤潮发生频率不断增加，因此，对沿海海域诱发赤潮发生的原因进行快速准确的检测、鉴定及监控是目前赤潮生物学和环境学研究的热点之一。但是，棕囊藻大多数种类的生活史和生殖过程复杂，有胶质群体阶段和游动的单细胞形态等。胶质群体阶段虽然体积较大，但并不具有客观性，易受环境等其它因素影响；而游动的单细胞阶段体积非常微小(3～8μm)，形态和生理的多样和复杂性性使得棕囊藻种间鉴定的非常困难，传统分类鉴别难度较大。
迄今为止，国际上有关棕囊藻对海洋生态系统的影响等方面的研究已有不少报导，但是尚未见有关棕囊藻基因快速鉴别的技术的研究报导。近年来，随着海洋及内陆水体富营养化的加剧，棕囊藻赤潮分布范围及出现频率明显增加，尤其是球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)，在热带海域呈明显扩增趋势。如1997年底在我国东南沿海水面首次发生大规模的球形棕囊藻有害赤潮，1999年7月又再次发生。这两次赤潮的持续时间长，危害大，对该海区造成了灾难性破坏性。对赤潮藻的研究已引起人们的高度重视。鉴于棕囊藻分类鉴定中存在的问题，采用新方法新技术快速识别棕囊藻种源具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供棕囊藻赤潮原因种基因鉴别的标准和技术，它可以从遗传本质上客观准确地鉴别球形棕囊藻。具体包括1.提供用于球形棕囊藻种源鉴定的基因片段；2.提供来源于上述基因片段的球形棕囊藻专一性核酸分子探针；3.提供利用上述核酸分子探针鉴别球形棕囊藻的方法。
本发明的发明人在对棕囊藻不同种类的研究中发现，棕囊藻的rDNA间隔区是一个高变的区域，不同种之间差别较大，而种内个体间相对保守，尤其是ITS区某些区域，在种内个体间非常保守，而种间变化相对较大。因此可根据序列这些特征，合成专一性的核酸分子探针，建立快速、准确鉴别赤潮原因种的分子生物学方法，用于棕囊藻的特异性检测。
本发明提供的用于鉴别棕囊藻的核苷酸序列来源于球型棕囊藻(Phaeocystis globosa，为97、99年诱发我国东南沿海海域的赤潮藻之一)的rDNA间隔区(即核糖体rRNA基因转录间隔区)序列，该序列的结构特征如序列表中的序列1(<210>1)所示。
该序列(<210>1)可通过如实施例1所述的方法得到或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。
本发明的球形棕囊藻专一性核酸分子探针是以上述球形棕囊藻rDNA间隔区核苷酸序列为基础，并通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它蓝藻种类比较设计出来的。该分子探针为rDNA间隔区中的1段或2段23个核苷酸组成的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10％的序列。
本发明的上述球形棕囊藻专一性核酸分子探针优选为序列表中<210>2或/和<210>3所示的序列(分别简称为PhaeoF和PhaeoR)。
本发明的上述球形棕囊藻专一性核酸分子探针，可按照预先根据球形棕囊藻rDNA间隔区序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。该探针可以通过放射性同位素、酶、生物素、荧光剂或化学荧光素结合进行标记。
本发明的上述球形棕囊藻专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与球型棕囊藻专一性反应，但不与其它棕囊藻或其它真核藻的DNA发生反应。所以，利用该核酸分子探针，通过PCR方法或核酸分子杂交法可以快速、准确地鉴别球形棕囊藻。
本发明所提供的球形棕囊藻鉴别方法，可采用核酸分子杂交法或PCR方法，分述如下；核酸分子杂交法采用前面所述的本发明的核酸分子探针(优选为PhaeoF或/和PhaeoR)，以通用的核酸分子杂交方法(例如Southern杂交或点杂交)对棕囊藻进行鉴定。具体步骤和过程(包括探针的标记和待测样品的预处理)，按常规的分子生物学方法进行。
该方法可以对海水自然生长的棕囊藻样品直接检测，也可以先将样品中的棕囊藻DNA提取扩增，再加以检验。
PCR方法以前面所述的本发明的核酸分子探针(优选为PhaeoF和PhaeoR)为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作过程进行。采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴别蓝藻，而且样品用量少。
由于本发明所提供的核酸分子探针为球形棕囊藻的专一性序列，因此在样品未知的前提下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，快速方便检测。并且通过探针的标记，定量检测棕囊藻的个体数，起到预防预报的作用，避免海洋灾害的发生。
序列表中的<210>1序列是球型棕囊藻rDNA间隔区多核苷酸序列，其中带下划线的部分(58-80bp和683-705bp)分别为本发明的球型棕囊藻专一性寡核苷酸分子探针PhaeoF和PhaeoR。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明实施例1球形棕囊藻rDNA间隔区多核苷酸序列的制备用牙签或枪尖挑取少量球形棕囊藻藻体，放入含100微升提取缓冲液(1％SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-HCl pH7.6)的小指管中，摇匀，65℃保温0.5-2小时，用DPS纯化试剂[包括玻璃粉，6MNaI，洗液(84mM Tris-HCl，40uM EDTA，60％乙醇，80mM KAc)]纯化后，晾干，加入50-100微升PCR反应液(100微升；引物为LH25’CGTAGGTGAACCTGCGGA AGGAT 3’0.5微升；引物为Dla5’TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT 3’0.5微克；Taq DNA聚合酶2.5单位，加无菌水定容至100微升)，加50微升矿物油，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应94℃ 5min，94℃、55℃和72℃各1min，30个循环，然后是72℃ 5min。反应完成后，去除矿物油，用PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Germany)纯化PCR产物，得到所需的核苷酸序列。纯化后的PCR产物于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷酸组成与排列。实施例2球形棕囊藻专一性核酸分子探针PhaeoF和PhaeoR的制备在获得球形棕囊藻rDNA间隔区核苷酸序列的基础上，将所得序列与其它棕囊藻或真核藻同源序列进行排列比较，得出PhaeoF和PhaeoR(分别为序列表中<400>1所示的58-80bp和683-705bp)的核苷酸组成和排列是用于球形棕囊藻鉴别的良好寡核苷酸片段。根据PhaeoF和PhaeoR的核苷酸组成的排列，在商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>2和<210>3序列所示的核苷酸组成与排列。实施例3球形棕囊藻的鉴别(常规PCR方法)1.样品预处理用牙签或枪尖挑取少量样品，放入含20微升提取缓冲液中(1％SDS，10mM EDTApH8.0，10mM Tris-HCl pH7.6)，摇匀，用DPS纯化试剂[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mM Tris-HCl，40uM EDTA，60％乙醇，80mM KAc)]纯化后，晾干，备用。
2.100微升PCR混合液中成分球形棕囊藻专一性探针PhaeoF 0.5微克球形棕囊藻专一性探针PhaeoR 0.5微克10X Taq DNA聚合酶缓冲液 10微升2mM dNTP溶液10微升Taq DNA聚合酶 2.5单位以上用无菌水定容为100微升3.PCR操作取2个0.5毫升小指管，分别加入20微升PCR混合液，然后一管加入样品DNA，另一管加入PCR混合液(对照)，各管中加50微升矿物油，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应94℃ 5min，94℃、55℃和72℃各1min，30个循环，然后是72℃ 5min。反应完成后，每管加入5微升载样液(30％Fcol，0.25％溴酚蓝)。取4微升点样于2％的琼脂糖凝胶中，电泳结果显示采用引物PhaeoF/PhaeoR进行PCR检测，若样品中含有球形棕囊藻为阳性反应，不含球形棕囊藻则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了PhaeoF/PhaeoR的专一性。
本方法具体有如下优点(1)简便快速。常规DNA制备需1至数小时，该方法在样品预处理时只需求20-30分钟即可恨扩增时间除外)。
(2)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。
(3)准确、灵敏度高，PhaeoF/PhaeoR为球形棕囊藻专一性核分子探针，若为其它藻类，为阴性反应。
(4)不使用有毒试剂。
序列表<110>中山大学<120>鉴别赤潮原因种球形棕囊藻的核酸分子探针与方法<160>3<210>1<211>830<212>DNA<213>球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)<220><221>misc_feature<222>(245，754)<223>n＝a或g或c或t<220><221>misc_feature<222>(111，468)<223>r＝a或g<220><221>misc_feature<222>(37，45，118)<223>y＝c或t<400>1ttaccggtat ccattccgaa ccccgtgcga acgggcycct gctcytgctt tttggatgga60gtaggggccg ccggtcgtcttcgcgacggc ctctgcgtgc cgcctcccgc rcctgtgygg 120cgcgggttgg gggcgcgtgg gcatgcggcc gcgcgtggca attctgaatt gccgcgagcg 180cgccgttcgg gagcgtgccg attcttcggc ttgctccgcc ccaccccacc gcgcgcgcga 240gtctntttag actcgcgcgc gccccaccac aaacctaacc acaactcctg tcgaaggata 300tcttggctcc cgcaacgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga 360attcagtgaa tcatcgagac tttgaacgca catggcattt ccaagtttcg cttggaagta 420tgttccttcg agtggagttc ccaccccacc tcggtggcgc cccccccrcg ggggcgcggc 480cggaggcggc ctctggcgcg cattcggttg cgcgtcactg gctgaagctg gggagtgcgg 540ggcgtgcgct ccgggcgccg gcccggcgat ttgtccgggt tggcgttccg gggtgttgcg 600ctccagatgg gcccgagcgg ttcccatcgg cgtgctagtg gcgtctcctc gcgagcgccg 660acggtcgctg atgtgcgtgc cgctcgatct cgtgccggtc tgggttcaca ggcgatccct 720tttgcgagcg cgcggtccgc ctcccagccg cgcnatcgtt gcgcggcggc gagggcgcct 780ttatgtgcgc cctgcgtctg aacctcctcc atcgaatgga tcaagactac830<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核苷酸序列比较而设计，以作为核酸分子探针用于赤潮生物球形棕囊藻的专一性检测<400>2ggagtaggggccgccggtcgtct<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核苷酸序列比较而设计，以作为核酸分子探针用于赤潮生物球形棕囊藻的专一性检测<400>3acccagaccggcacgagatcgag
权利要求
1.一种用于鉴别海洋赤潮球形棕囊藻的核苷酸序列，其特征是该序列来源于海洋赤潮原因种球形棕囊藻rDNA转录间隔区的核苷酸序列，具体序列为ttaccggtat ccattccgaa ccccgtgcga acgggcycct gctcytgctt tttggatggagtaggggccg ccggtcgtct tcgcgacggc ctctgcgtgc cgcctcccgc rcctgtgyggcgcgggttgg gggcgcgtgg gcatgcggcc gcgcgtggca attctgaatt gccgcgagcgcgccgttcgg gagcgtgccg attcttcggc ttgctccgcc ccaccccacc gcgcgcgcgagtctntttag actcgcgcgc gccccaccac aaacctaacc acaactcctg tcgaaggatatcttggctcc cgcaacgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcagaattcagtgaa tcatcgagac tttgaacgca catggcattt ccaagtttcg cttggaagtatgttccttcg agtggagttc ccaccccacc tcggtggcgc cccccccrcg ggggcgcggccggaggcggc ctctggcgcg cattcggttg cgcgtcactg gctgaagctg gggagtgcggggcgtgcgct ccgggcgccg gcccggcgat ttgtccgggt tggcgttccg gggtgttgcgctccagatgg gcccgagcgg ttcccatcgg cgtgctagtg gcgtctcctc gcgagcgccgacggtcgctg atgtgcgtgc cgctcgatct cgtgccggtc tgggttcaca ggcgatcccttttgcgagcg cgcggtccgc ctcccagccg cgcvatcgtt gcgcggcggc gagggcgcctttatgtgcgc cctgcgtctg aacctcctcc atcgaatgga tcaagactac
2.一种以权利要求1的核苷酸序列为基础而设计的赤潮球形棕囊藻专一性核酸分子探针，其特征是该核酸分子探针来源于权利要求1所述核苷酸序列中的1段或2段23个核苷酸的长的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10％的序列。
3.按照权利要求2所述的核酸分子探针，其特征是其核苷酸序列为PhaeoF5’ggagtaggggccgccggtcgtct 3’或PhaeoR5’acccagaccggcacgagatcgag 3’，或者为PhaeoF和PhaeoR。
4.用权利要求2或3所述的核酸分子探针鉴别赤潮球形棕囊藻的方法，其特征是采用权利要求2或3所述的核酸分子探针，以通用的核酸分子探针杂交方法进行检验鉴定，具体步骤和过程按常规的分子生物学方法进行。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征是所说的核酸分子探针为权利要求3所述的PhaeoF或/和PhaeoR。
6.用权利要求2或3所述的核酸分子探针鉴别赤潮球形棕囊藻的方法，其特征是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的2个核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征是所说的核酸分子探针为权利要求3所述的PhaeoF和PhaeoR。
全文摘要
本发明属于利用分子生物学方法检测海洋环境微生物的技术领域。本发明提供了球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)rDNA间隔区核苷酸序列及来源于该序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别海洋自然水域棕囊藻种源的方法。利用本发明，可方便、快速、准确地鉴别海洋赤潮原因种球形棕囊藻，具有客观、准确、自动化等特点。
文档编号C07H21/00GK1403590SQ0213485
公开日2003年3月19日 申请日期2002年9月29日 优先权日2002年9月29日
发明者陈月琴, 邵鹏, 周惠, 屈良鹄 申请人:中山大学