专利名称：大环内酯化合物的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种大环内酯化合物，即他克莫司(tacrolimus)或西罗莫司(sirolimus)或来自发酵液的其天然存在衍生物和类似物的分离方法。
背景技术：
大环内酯化合物或大环内酯类是多元内酯环。用作抗生素的红霉素是众所周知的这种大环内酯的例子。其它大环内酯物例如他克莫司和西罗莫司通常被用作免疫抑制剂。
在美国专利US 4,894,366和欧洲专利EP 184,162中首先描述了他克莫司，一种对于T-淋巴细胞具有选择性抑制作用的大环内酯。他克莫司也被描述在一些科学著作中H.Tanaka et al.J.Am.Chem.Soc.1987，109，5031-5033和T.Kino et al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255。
在美国专利US 3,929,992中首先描述了西罗莫司，也称为雷帕霉素。西罗莫司也被描述在一些科学著作中C.Vezina et al.J.Antibiot.1975，28，721-726，S.N.Sehgal et al.J.Antibiot.1975，28，727-731。
子囊霉素，一种大环内酯，是他克莫司的天然类似物。以下论文中描述了子囊霉素H.Hatanaka et al.J.Antibiot.1988，41，1592-1599，M.Morisaki at al.J.Antibiot.1992，45，126-132。专利EP 358,508和GB 2,269,172中描述了他克莫司的其它天然衍生物和类似物。
虽然已经描述了两种化合物的全合成(EP 378,318和K.C.Nicolaou et al.J.Am.Chem.Soc.1993，115，4419)，然而用于制备他克莫司和西罗莫司的优选方法是发酵。
从发酵液中分离他克莫司和西罗莫司两者是困难的，这是由于它们在这些大环内酯生物质中浓度低，并且还由于事实上大环内酯存在于固相(菌丝体)和液相(过滤发酵液)两者之中。因此，经济地分离大环内酯化合物的方法需要(1)分离菌丝体和(2)菌丝体和过滤发酵液两者的分离加工，例如T.Kino et al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255中所述。专利申请WO 03/68980中描述了另一种可能性，该申请要求保护利用疏水性有机溶剂直接萃取发酵液。
发明概述本发明方法使得能够加工全部发酵液。从菌丝体萃取大环内酯化合物是通过将适当的可与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液中来完成的。由此大环内酯化合物被转移到液相中，然后将萃取的菌丝体分离。然后通过用不与水混溶的溶剂萃取来进一步加工液相(含水萃取液)以得到有机萃取液。然后将有机萃取液部分蒸发，将残余物转移到甲苯以得到甲苯浓缩液。然后利用已经用丙酮极化的甲苯作为流动相通过硅胶色谱法进一步提纯该甲苯溶液。然后将含有大环内酯化合物的成分浓缩，并且使残余物从适当的溶剂中结晶以得到所想要的大环内酯化合物。
在该方法的另一实施方式中，在用不与水混溶的溶剂进行处理之前没有将含水萃取物从菌丝体中分离出来，可将不与水混溶的溶剂直接加入菌丝体在含水萃取物中的悬浮液中，然后可将有机萃取物从三相体系统中分离出来。
本发明的详细说明将适当的可与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液来将大环内酯化合物萃取到液相中，这种可与水混溶的溶剂可减少脂肪族醇或酮的共萃取。优选溶剂是丙酮、2-丙醇和1-丙醇。可使用乙醇来萃取大环内酯化合物，但是它没有丙酮和/或2-丙醇方便，因为乙醇可与分离出的大环内酯化合物反应。通过将可与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液中而得的含水萃取物可通过过滤或沉淀，优选通过离心分离而被从萃取的菌丝体中分离出来。将得到澄清的含水萃取物，可将其在没有任何蒸发的条件下进一步进行处理，也可将该含水萃取物在没有固相分离的条件下进行处理。
不管菌丝体被分离还是没有分离，将含水萃取物进行进一步加工，包括将不与水混溶的溶剂加入含水萃取物中以及将两相或三相体系混合。由此，将大环内酯化合物萃取到有机相，同时大部分镇重成分停留在水相中。不与水混溶的溶剂可以是任何不与水混溶的有机溶剂，除了脂族烃之外。优选溶剂是甲苯、二甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷、叔丁基甲基醚和异丁基酮。本发明公开了大环内酯化合物的提纯和该产物的浓缩，因为只有非常小量的不与水混溶的溶剂可被加入含水萃取物中以将大环内酯化合物定量转移到有机相，如实施例所示范的。甲苯是优选的溶剂，因为使用过的溶剂回收简单，这是由于甲苯和丙酮或2-丙醇的沸点差别相当大。
大环内酯被萃取到有机相之后，将分离的有机相在真空下浓缩。然后利用用丙酮逐步极化的甲苯通过硅胶色谱法将所得浓缩液进一步提纯。通过蒸发有机萃取液而得的浓缩物可被直接装填到色谱柱，根据本发明方法的最终操作是如实施例所述从适当溶剂中结晶含有所需大环内酯化合物的色谱馏分。
实施例实施例1将通过链霉菌种(Streptomyces sp.)的深层培养制备他克莫司而得的全部发酵液10升是用10升丙酮稀释并且将该悬浮液搅拌4小时。通过过滤分离固相并且用1000ml甲苯将滤液萃取两次。将甲苯萃取液合并并且在减压下将甲苯蒸发以形成体积约为100ml的浓缩液。将该浓缩液装填到100g硅胶(Lichroprep Merck 60，63-200μm)填充的色谱柱。将色谱柱首先用甲苯(约300ml)清洗，然后用甲苯和5-30％(v/v)丙酮的混合物清洗。将含他克莫司的馏分(TLC监测)合并，将其蒸干以制得残余物。将残余物(3.7g)溶解在2-丙醇(10ml)和20ml水中，并将30ml己烷加入该溶液，通过在冷冻设备(约为+2℃)中将该溶液冷却来完成他克莫司的结晶。通过过滤将结晶他克莫司分离，得到了1.4g结晶他克莫司。
实施例2将通过链霉菌种(Streptomyces sp.)的深层培养制备西罗莫司而得的全部发酵液10升用10升2-丙醇稀释以形成悬浮液。将该悬浮液搅拌4小时。通过过滤分离固体颗粒并且用1000ml甲苯将滤液萃取三次。将甲苯萃取液合并并且在减压下蒸发到体积约为100ml，将该浓缩液装填到100g硅胶(Lichroprep Merck 60，63-200μm)填充的色谱柱。将色谱柱首先用甲苯(约300ml)清洗，然后用甲苯和5-30％(v/v)丙酮的混合物清洗。将含西罗莫司的馏分(TLC监测)合并，将其蒸干以制得残余物。将残余物(5.5g)溶解在乙酸乙酯(20ml)中，并将50m己烷加入该溶液，通过将该溶液静置在冷冻设备(约为+2℃)中直到出现结晶来完成西罗莫司的结晶。通过过滤将结晶西罗莫司分离，得到了2.1g结晶西罗莫司。
实施例3将通过链霉菌种(Streptomyces sp.)的深层培养制备他克莫司而得的全部发酵液10升用10升丙酮稀释并将该悬浮液搅拌2小时。然后加入2升甲苯并将该混合物再搅拌2小时。最后在离心分离机上加工该混合物，得到了3.2升有机萃取物。如实施例1中所述进一步加工该有机萃取物。
权利要求
1.一种从发酵液中分离大环内酯化合物的方法，其包括以下步骤a)用可与水混溶的有机溶剂稀释发酵液而得到一种含水萃取物，b)用PH值约为5-12的不与水混溶的溶剂萃取所述含水萃取物以得有机萃取物，c)将所述有机萃取物部分蒸发而得到大环内酯化合物的浓缩液，d)采用甲苯和丙酮的混合物作为流动相利用硅胶将所述浓缩液层析而得到含大环内酯化合物的馏分，e)将含大环内酯化合物的馏分浓缩；以及f)从适当的溶剂中结晶残余物。
2.权利要求1中所述的方法，其中所述可与水混溶的有机溶剂选自乙醇、1-丙醇、2-丙醇或丙酮。
3.权利要求2中所述的方法，其中所述可与水混溶的有机溶剂是2-丙醇或丙酮或2-丙醇和丙酮的混合物。
4.权利要求1中所述的方法，其中在用不与水混溶的溶剂进行处理之前通过过滤或沉淀将所述含水萃取物从固相分离出来。
5.权利要求1中所述的方法，其中在用不与水混溶的溶剂进行处理之前没有将所述含水萃取物从固相分离出来。
6.权利要求1中所述的方法，其中所述不与水混溶的溶剂选自甲苯、二甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷、叔丁基甲基醚或甲基异丁基酮。
7.权利要求6中所述的方法，其中所述不与水混溶的溶剂是甲苯。
8.权利要求1中所述的方法，其中所述发酵液是指全部发酵液。
9.权利要求6中所述的方法，其中所述全部发酵液是指通过培养产生大环内酯化合物的微生物链霉菌种(Streptomyces sp.)而得的悬浮液。
10.权利要求1和9所述的方法，其中所述大环内酯化合物是指他克莫司或西罗莫司或这些化合物的天然存在的衍生物或类似物。
11.权利要求1中所述的方法，其中所述大环内酯化合物的浓缩液是指含大环内酯化合物的甲苯溶液。
12.权利要求1中所述的方法，其中将所述浓缩液引入硅胶填充柱，并且将所述柱用丙酮逐步极化后的甲苯清洗。
13.权利要求12中所述的方法，其中甲苯和丙酮的体积比至多为1∶1。
14.权利要求1中所述的方法，其中将所述含有大环内酯化合物的馏分浓缩成干残余物。
15.权利要求1中所述的方法，其中用于他克莫司结晶的适当溶剂是2-丙醇和水的混合物。
16.权利要求15中所述的方法，其中2-丙醇和水的体积比为1∶1至1∶3。
17.权利要求15中所述的方法，其中所述结晶是通过添加己烷来完成的。
18.权利要求17中所述的方法，其中对己烷的数量没有限制。
19.权利要求1中所述的方法，其中用于结晶他克莫司或西罗莫司的适当溶剂是二异丙基醚或者乙酸乙酯或丙酮和己烷的混合物。
20.权利要求19中所述的方法，其中乙酸乙酯或丙酮和己烷的体积比为1∶1至1∶5。
全文摘要
虽然大环内酯化合物不溶于水，但是在发酵液的液相中发现了高得惊人的产物部分。因此，加工全部发酵液，即通过微生物培养制备所需大环内酯化合物而得的悬浮液是高度可取的。本发明教导了一种利用便宜和环保上可接受的溶剂来加工全部发酵液的方法。
文档编号C07D498/18GK101031653SQ200580030110
公开日2007年9月5日 申请日期2005年9月9日 优先权日2004年9月10日
发明者M·布奇塔, L·茨瓦克, J·萨特克 申请人:伊瓦克斯制药有限公司