专利名称：：八棱丝瓜蛋白1及其编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白一-八棱丝瓜蛋白l及其编码基因与其在制备抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒的药物中的应用。技术背景从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-InactivatingProtein,简称RIP)，核糖体失活蛋白是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑制细胞内蛋白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNAN-糖苷酶或叫多核苷酸'腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根据蛋白分子及其基因的结构，RIP可以分为3类，类型lRIP是具RNAN-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物栝楼块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称TCS)，白泻根蛋白(Bryodin，简称BRY),苦瓜种子的a，0_苦瓜蛋白(a，p-Momorcharin，简称MMA，MMB)和丝瓜(Luffacylindrica)种子的丝瓜蛋白a,b(Luffina，b简称LUA,LUB)。类型2RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物蓖麻种子的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由一条具有RNAN-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接而成的。类型3RlP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-inducedprotein),它是由具有RNAN-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成，例如来自大麦的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1核糖体失活蛋白，例如天花粉蛋白、苦瓜蛋白、丝瓜蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤，抗病毒活性，特别是抗艾滋病毒活性。葫芦科丝瓜属植物主要有两个栽培种，一是普通丝瓜(LuffacylindricalRoem.或LuffaaegyptiacaMill.)，一般就叫丝瓜(中国植物志，中国高等植物图鉴)；一是八棱丝瓜(LuffaacutangulaRoxb.)，又叫棱角丝瓜(中国高等植物图鉴)，广东丝瓜(中国植物志)。ZL97112602.X提供了从八棱丝瓜种子中分离出的类型lRIP——八棱丝瓜蛋白l(Luffaculin1,简称LAl)，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为28kDa，其N端氨基酸顺序为Asp-Val-Ser-Phe-Ser，具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。CN1473847A提供了八棱丝瓜蛋白1的等电点、二级结构、糖苷酶活性和抗肿瘤活性及其应用。林峻凯等(林峻凯，陈明晃，谢捷明，等，八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其理化性质[J]，中国生物化学与分子生物学报，2002，18，609—613)，从八棱丝瓜种子中提取到八棱丝瓜蛋白1，测定其分子量为28kD，等电点为8.86，具有RNAN—糖苷酶活性，细胞对蛋白质合成有抑制活性，及体外对肿瘤细胞较强的抑制活性，认为可以用于或构成免疫毒素治疗癌症。陈明晃等人(陈明晃，石小莉，叶晓明，等，八棱丝瓜蛋白1的二级结构及其生物活性[J]，结构化学，2004，23，232-236)报道了八棱丝瓜蛋白1的N端顺序，用CD谱测定二级结构及对肿瘤细胞的抑制活性。陈明晃等人(ChenMH,YeXM,ShiXL，etal:Uiffaculins，ribosome-inactivatingproteinfromtheseedsofLuffaacutangula[J].TOXICOLOGY.2003,19148)报道了八棱丝瓜蛋白1的抗肿瘤活性。谢捷明等(谢捷明，陈明晃，许盈，等，八棱丝瓜蛋白1对B16细胞的诱导分化作用[J]，2005,12,1521-1524)报道了八棱丝瓜蛋白1对B16细胞的诱导分化作用。侯晓敏等(HouXM,ChenMH,XieJM，etal:Crystallizationandpreliminarycrystallogr即hicstudiesofluffaculin1，aribosome-inactivatingproteinfromtheseedsofUiffaacutangula)报道了八棱丝瓜蛋白1的初步结晶学研究。上述专利和文献表明，提取自八棱丝瓜种子的核糖体失活蛋白一八棱丝瓜蛋白1，是类型1核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤，抗病毒作用等多种生物学功能，尤其八棱丝瓜蛋白1具有较强的抗肿瘤活性，并报道了八棱丝瓜蛋白1的诱导肿瘤细胞分化的作用，促使我们进一步了解八棱丝瓜蛋白1的一级结构和空间结构及其基因，阐明八棱丝瓜蛋白1的结构与功能，研究基因的表达、调控，开展蛋白质工程和基因工程，并为获得药用蛋白质或制备免疫毒素提供基础知识。
发明内容本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种核糖体失活蛋白—八棱丝瓜蛋白1的成熟蛋白的全长氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。通过一级结构比较分析和晶体结构(三级结构)的分析，为制备抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病病毒的药物和制备免疫毒素提供关键技术。本发明提纯了八棱丝瓜蛋白1(Luffaculin1,简称LA1)，并在生物质谱仪上测定了它的精确分子量为27960Da(ESI-MS测定)，或27893Da(MALDI-TOF-MS测定)。本发明从八棱丝瓜种子发芽后长出来的第一片真叶，按天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒说明书上操作要求，提取八棱丝瓜总的DNA。本发明根据八棱丝瓜蛋白1的N端氨基酸顺序(DVSFSLS)设计寡核苷酸上游引物(5，-GATGTGAGCTTCAGTTTGTC-3，)，并根据八棱丝瓜蛋白1的晶体学判断C端氨基酸顺序(NIQLLLN)设计寡核苷酸的下游引物(5'-[A/G]TTTAGAAGCAA[C/T]TGGATGT-3，)。PCR扩增反应程序为首先模板94。C变性2min，然后进行35个循环包括94。C变性50s，49。C退火45s，72。C延伸lmin30s，最后再延伸10min结束PCR反应。按照《精编分子生物学试验指南》(北京科学出版社，1998)中的操作说明进行琼脂糖凝胶电泳及DAN片段回收.测序公司测定核苷酸顺序.上述方法获得的八棱丝瓜蛋白1DNA基因序列，见序列表SEQIDNo:2。结合八棱丝瓜蛋白1DNA基因顺序所推断出的氨基酸顺序、八棱丝瓜蛋白1的晶体学研究判断出来的C端顺序，获得了八棱丝瓜蛋白1的成熟蛋白的全长氨基酸序列，见序列表SEQIDNo:l。将八棱丝瓜蛋白1全长氨基酸序列与已报道的2种丝瓜蛋白a(Luffina)(一是LUA:SwissPort蛋白数据库登陆号为:Q00465,gil32590;一是LUS:即由CN1763087A提供的luffina的242个氨基酸序列)进行序列同源性比较，LAI与LUA只有5个残基不同，LAI与LUS有5个残基不同(不包括LUS的C端缺少的5个残基)，见图l。比较表明这三者之间同源性很强，但由于来源于不同的种而有所差别。将八棱丝瓜蛋白1全长氨基酸序列与已报道的几种具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒活性的类型1核糖体失活蛋白进行同源性比较，其中与LUA(SwissPort蛋白数据库登陆号为Q00465,gil32590)相比较，相同的占97%，相似的占98X;与LUB(登陆号为P22851,gil32591)相比较，相同的氨基酸残基占80%,相似的氨基酸残基占88%;与MMA(登陆号为P16094,gil32578)相比较，相同的占71%，相似的占81X;与BRY(登陆号为P33185，gil2644214)相比较，相同的占64X，相似的占79X;与TCS(登陆号为P132599，gil32599)相比较，相同的占62%，相似的占76X;与匪B(登陆号为P29339gil32581)相比较，相同的氨基酸残基占53%，相似的氨基酸残基占71%。并且这7种蛋白一起比较，同一位置7种蛋白序列都相同的残基共91个，占36.8%见图2。同一位置6种蛋白序列都相同的残基共54个，同一位置6种以上蛋白都相同的残基共145个，占58.7%。晶体学研究表明，组成蛋白活性中心位点的氨基酸残基为Tyr(Y)70，Tyr(Y)111，Glu(E)160，Arg(R)163(标记氨基酸残基的数字以TCS为标准)，及其周围的氨基酸残基都是相同的，这就从蛋白质一级结构和晶体结构(三级结构)上阐明了八棱丝瓜蛋白1具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒活性，并为蛋白质的改造和构造免疫毒素提供了关键技术。同时，这几种RIP各自所具有不同的氨基酸残基，及其在不同位置所带(或不带)的不同数量的糖基，构成了各自不同的分子表面电荷基团和抗原决定簇，这就为八棱丝瓜蛋白1的结构和功能研究提供了技术平台。尤其是八棱丝瓜蛋白1具有对肿瘤细胞诱导分化作用，本发明提供了重要的结构信息。与现有技术相比，本发明具有以下积极效果本发明提供了八棱丝瓜蛋白1的成熟蛋白的全长氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。本发明提供了八棱丝瓜蛋白1在制备抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒的药物中的应用。本发明所提供的方法与传统的cDNA测序方法相比更快速、方便。图1:八棱丝瓜蛋白1(LA1)247个氨基酸序列与丝瓜蛋白a(LUA,LUS)氨基酸序列比较，同一位置有蛋白序列不一样的残基以阴影标出。图2:八棱丝瓜蛋白1(LA1)247个氨基酸序列与天花粉蛋白(TCS)、白泻根蛋白(BRY)，a，p-苦瓜蛋白(MMA，MMB)和丝瓜蛋白a,b(LUA,LUB)氨基酸顺序比较，其中7个蛋白氨基酸残基都一样的以阴影标出。具体实施方式实施例l:八棱丝瓜蛋白l(Luffaculin1,简称LA1)的氨基酸顺序测定a、引物设计在对已知葫芦科植物核糖体失活蛋白系统比较的基础上，选取上下游高度保守的氨基酸序列和核苷酸顺序及其密码子的偏爱性设计引物，为了提高PCR正确性及其得率尽量避免使用简并引物(同时设计多条引物进行筛选)，其中正确的引物如下-上游引物，5，-GATGTGAGCTTCAGTTTGTC-3，下游引物，5，—[A/G]TTTAGAAGCM[C/T]TGGATGT-3，b、总DNA的提取试剂天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒液氮、e-巯基乙醇、氯仿、无水乙醇取自己培育的八棱丝瓜苗第一片真叶100mg置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状加到离心管中，按照植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取八棱丝瓜蛋白的基因组DNA。c、PCR扩增反应体系为超纯水39.3u1IOXPCR缓冲液(含15mMMg+)5uld,s(2.5mM)4u1上游引物(100uM)0.2ul下游引物(100uM)0.2"1总薩1u1PfuDNA聚合酶(250U)0.3u1总体积50ul反应程序为首先模板94'C变性2min，然后进行35个循环包括94'C变性50s，49。C退火45s，72。C延伸lmin30s，最后再延伸10min结束PCR反应。d、琼脂糖凝胶电泳及DAN片段回收按照《精编分子生物学试验指南》(北京科学出版社，1998)中的操作说明进行。e、测序公司测定核苷酸顺序，由此推断八棱丝瓜蛋白1的氨基酸顺序。实施例2:质谱测定八棱丝瓜蛋白1精确分子量本发明提纯了八棱丝瓜蛋白1(Luffaculin1，简称LA1)，并在生物质谱仪上测定了它的精确分子量为27960Da(ESI-MS)，或27893Da(MALDI-TOF-MS测定)。同时测定了丝瓜蛋白a(Luffina简称LUA)精确分子量为27871Da(ESI-MS)。晶体学石开究表明八棱丝瓜蛋白1在Asn77和Asn84以N-0键各连接一个N—乙酰葡萄糖苷，而Islam等(IslamMR，NishidaH，FunatsuG.CompleteAminoAcidSequenceofUiffin-a，aribosome—inactivatingProteinfromtheSeedsofSpongeGourd(Z〃/!fac/iiW".ca2)[J].Agric.Biol.Chem.1990542967-2978)研究表明，丝瓜蛋白a在Asn28，Asn33，Asn77，Asn84，和Asn227各连结一个N-乙酰葡萄糖苷。这从分子量和所带的糖链方面显示了2种蛋白的差别。序列表〈110〉中国科学院福建物质结构研究所〈120〉八棱丝瓜蛋白l及其编码基因〈160〉2〈170〉PatentlnVersion2.1〈210〉1〈211〉247〈212〉PRT〈213〉葫卢科植物丝瓜属八棱丝瓜种(Luffaacutangula)〈400〉1AspValSerPheSerLeuSerGlySerSerSerThrSerTyrSerL>ys151015PhelieGlyAspLeuArgLysAlaLeuProSerAsnGlyThrValTyr202530AsnlieThrLeuLeuLeuSerSerAlaSerGlyAlaSerArgTyrThr354045<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>235240200710008401.1225230AsnTyrLysGinAsnValAla245〈210〉2〈211〉663〈212〉腿〈213〉葫戸科植物丝瓜属八棱丝瓜种(Luffaacutangula)〈400〉1ctgaggaaggctcttccatctaatgggacagtctacaacataactctcttactctcctctgcctcgggcgtactttttcaacgagtctgatgctaaattagcttctcaatacgtattcaaaggtagcaccatcgtcacgcttccatattctggcaattacgaaaagcttcaaactgctgcaggcaagataagagagaagattccactgggattcccagctttggacagtgcgattaccaccttgtttcattacgattccacggctgctgctgcagcattcctcgtaatcattcagaccactgctgagtcttcgagattcaagtatatcgagggacagattattgagagaatttcgaaaaacggggtgccgagtctggcgactataagtttagaaaacgaatggtctgctctctccaaacaaattcagttggcacagacgaataacggaacgtttaaaactcccgttgtgataatggacgataaaggccaaa^t6012018024030036042048054060066066权利要求1.一种从八棱丝瓜(Luffaacutangula)种子中提取的核糖体失活蛋白-八棱丝瓜蛋白1，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNo1氨基酸残基序列的蛋白质。2.编码权力要求l所述的八棱丝瓜蛋白l的基因，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNo:2核苷酸序列的基因。3.根据权力要求1的一种八棱丝瓜蛋白1，其特征在于，该蛋白作为制备抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒药物的应用。全文摘要八棱丝瓜蛋白1及其编码基因，涉及生物化学中一种核糖体失活蛋白。本发明公开了从八棱丝瓜(Luffaacutangula)种子中提取的一种核糖体失活蛋白--八棱丝瓜蛋白1(Luffaculin1)的成熟蛋白的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。一级结构和晶体结构分析表明它是类型1核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒作用，为获得药用蛋白质或制备免疫毒素提供关键技术。文档编号C07K14/415GK101215326SQ20071000840公开日2008年7月9日申请日期2007年1月4日优先权日2007年1月4日发明者侯晓敏,陈明晃申请人:中国科学院福建物质结构研究所