专利名称：杂交瘤细胞及其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学生物技术领域，具体地涉及单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明的一株杂交瘤细胞株IB12株于2010年9月16日在位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心进行保藏，其保藏号为CCTCC C201088 ；本发明的另一株杂交瘤细胞株2C6 株于2010年9月16日在位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心进行保藏，其保藏号为 CCTCC C201089。
背景技术：
鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病，传染性极强，病死率高，是危害人类最严重的烈性传染病之一，我国将其列为法定甲类传染病之首。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，世界卫生组织已将鼠疫列为重新流行的传染病之一。由于鼠疫的严重危害，任何误诊或漏诊都将造成重大损失。因此，及时、准确、快速的诊断鼠疫尤为重要。然而，长期以来我国一直沿用“四步诊断”(即显微镜检查、细菌培养、 噬菌体裂解试验和动物试验)作为判定鼠疫疫情的主要手段，该法技术落后、操作繁琐、耗时，往往延误疫情判定，影响了疫情的控制速度，使疫情扩大蔓延。免疫学检测技术被普遍认为是快速敏感的。在鼠疫耶尔森菌的抗原中，Fl抗原具有极为重要的意义，它不仅是鼠疫菌最早发现的抗原，也是最主要的保护性抗原，而且它对于鼠疫菌具有高度的特异性，几乎所有的鼠疫血清学检查都以Fl抗原为基础。然而，目前我国鼠疫诊断中普遍使用的Fl抗原是一种较粗制的成分，用该抗原经免疫获得的Fl抗体为一种多克隆抗体，其特异性较差，因此，目前的免疫学检测技术难以取代经典的“四步诊断，，。细胞杂交瘤技术应用于不同的病种，获得的杂交瘤株分泌的单克隆抗体的效果差别非常大。这主要是由于特异性抗原免疫学特性、免疫动物的技术、实验试剂(如小牛血清、聚乙二醇等)、细胞融合技术以及实验操作技术等的不一致导致的。目前应用细胞杂交瘤技术于鼠疫研究领域而获得的杂交瘤株分泌单克隆抗体的效果均不理想，因此，单克隆抗体也未能在鼠疫诊断中得到广泛应用。综上所述，解决鼠疫快速诊断的关键为诊断试剂的特异性，因此需要具备特异性、 均质性、敏感性、精确性和可重复性的抗鼠疫Fl抗原的单克隆抗体以及能够分泌该抗体的杂交瘤细胞株。
发明内容
针对上述问题，本发明提供分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法，本发明还提供由该杂交瘤细胞株分泌的高效价单克隆抗体。本发明提供的制备分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法包括以下步骤(1)小鼠免疫每只BALB/c小鼠注射100 μ g鼠疫Fl抗原；
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(2)细胞融合与接种将免疫后的小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，在融合的过程中采用Sigma公司生产的PEG，所述PEG溶液的浓度为50%;将融合细胞用HAT及 HT培养液接种，所述HAT及HT培养液采用Sigma公司的HAT冻干粉和HT冻干粉制备；采用Hyclone公司生产的加强型小牛血清为融合细胞提供营养来源；(3)鼠疫Fl抗体检测采用酶联免疫吸附测定检测所述融合细胞培养上清中的鼠疫Fl抗体，其中鼠疫Fl抗原的包被浓度为8 μ g/ml ；(4)杂交瘤细胞克隆化将两次所述鼠疫Fl抗体检测均为阳性的杂交瘤细胞株进行至少一次克隆化，直到单个细胞克隆的鼠疫Fl抗体检测均为阳性。本发明还提供上述方法获得的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株IB12株的CCTCC保藏号为C201088，所述杂交瘤细胞株能够分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体。本发明还提供一种抗体，所述抗体上述的杂交瘤细胞株分泌。优选地，所述抗体为IgGh亚型。本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的抗体。本发明还提供上述方法获得的另一杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株2C6株的CCTCC 保藏号为C201089，所述杂交瘤细胞株能够分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体。本发明还提供一种抗体，所述抗体由上该的杂交瘤细胞株分泌。优选地，所述抗体为IgGa亚型。 本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的抗体。本发明的有益效果如下。应用本发明的技术方案制备的分泌高效价抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其将持续性地产生鼠疫Fl单克隆抗体，为建立鼠疫快速诊断方法(包括免疫荧光技术、ELISA和胶体金标记技术等)提供了抗体源。鼠疫快速诊断技术的建立能够取代传统的鼠疫诊断方法，并且提高诊断的质量和水平，大大缩短诊断时间，为实施控制鼠疫的有效措施赢得时间，从而尽可能避免疫情扩大蔓延和社会恐慌，挽回经济损失。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详尽说明。本发明中所使用的主要试剂如下鼠疫耶尔森菌Fl抗原(自制)、RPMI_1640培养基(Gibco公司)、丙酮酸钠(Sigma 公司)、L-谷氨酰胺(USB公司)、!fepes (USB公司)、聚乙二醇(PEG) (Sigma公司)、HAT冻干粉和HT冻干粉(Sigma公司)、8_氮杂鸟嘌呤(8_AG) (Sigma公司)、二甲基亚砜(DMSO) (Sigma公司)、兔抗鼠IgG(酶标抗体)(Sigma公司)、加强型小牛血清(FBCS) (Hyclone公司)、福氏完全和不完全佐剂(Sigma公司)、四甲基联苯胺(TMB)(上海丽珠东风生物技术公司)。本发明中所使用的主要仪器如下CO2孵箱(德国Heraeus)、倒置显微镜(日本Nikon公司)、除菌滤器(AG. 37075德国)和0. 20 μ m滤膜(德国)、酶标检测仪、自动洗板机(奥地利TECON公司，型号=Columbus plus)、三重蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂，型号SZ-97)、去离子水净化机(英国USF Elga 公司，型号MAXIMALS)、低温冰箱(_70°C )及普通冰箱、电子天平(瑞士，AGM5)、细胞培养板(96孔及24孔，Costar公司)、酶标测定板(8X12孔，Nunc公司)。本发明的培养基及培养液的配制及准备如下
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(1)基础培养基(以IOOOml计算)
RPMI-164010. 4g
NaHCO32. Og
青霉素10万单位
链霉素10万单位
去离子水IOOOml
溶解充分并混勻经0. 20 μ m滤膜过滤除菌、分装于IOOml盐水瓶中置低温冰箱保存备用，使用前自然解冻。主要用于洗涤细胞。
(2)不完全培养液(以IOOOml计算)
RPMI-164010. 4g
NaHCO32. Og
Hepes4. 8g
丙酮酸钠0. 2g
L-谷氨酰胺0.4g
青霉素10万单位
链霉素10万单位
去离子水1000ml
充分溶解混勻经0. 20 μ m滤膜过滤除菌、分装于IOOml盐水瓶中置低温冰箱保存备用。主要用于配制完全培养液。
(3)完全培养液(以IOOOml计算)
不完全培养液800ml
小牛血清200ml
混勻后0. 2 μ m滤膜过滤除菌分装、冰箱保存备用，主要用于培养细胞。
(4) HT培养液
先将HT冻干粉溶于IOml基础培养液中配成50X的HT液。
50 X HT2ml
完全培养液IOOml
混勻后即可使用。
(5) HAT培养液
先将HAT冻干粉老§于IOml基础培养液中配成50X的HAT液。
50 X HAT2ml
完全培养液IOOml
混勻后即可使用，一般现用现配，且宜少量配制。
本发明的酶标试剂配制如下
(1)包被稀释液(PH 9. 6 0. 05M Na2CO3-NaHCO3 缓冲液)
Na2CO30. 3g
NaHCO30. 6g
NaN340mg
去离子水200ml
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溶解充分后，主要用于溶解鼠疫Fl抗原包被酶标板。(2)磷酸盐缓液(PBS, pH 7. 4)和 PBSTNaCl40. OgKH2PO41. OgNaHPO4. 12H2014. 5gKCl1. Og硫柳汞0. 5g蒸馏水5000ml溶解充分后吸出500ml为PBS，用于稀释样品，其余4500ml加入 2. 25mlTween-20 (0. 05% )混勻后成为PBST，用于清洗酶标板。(3)四甲基联苯胺(TMB)底物Qmg/ml)TMB200mg无水乙醇IOOml用0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/L Na2HPO4液(现用现配)稀释，使用时的工作浓度为 0. lmg/ml0制备分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克降抗体的杂交瘤细胞的方法的步骤1、骨髓瘤细胞培养选用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。该细胞株复苏后在含有8-氮鸟嘌呤(8-AG)的完全培养基中传代培养。细胞融合时，选生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞。2、实验动物免疫本实施方式选用BALB/c小鼠为免疫动物，其均为6_8周龄、体重10_20克、健康、 雌性。在本实施方式中，将四只雌性BALB/c小鼠分为3组，即200 μ g组5只、100 μ g组12 只、50 μ g组12只(首次Fl抗原的注射剂量分别为200 μ g/只、100 μ g/只和50 μ g/只)。操作步骤如下首次免疫将鼠疫Fl抗原与等量福氏完全佐剂(Freimd'scomplete adjuvant)乳化充分，背部皮下3_4点注射；3周后第二次免疫，Fl抗原量减半，并与等量福氏不完全佐剂(Freund’ s incomplete adjuvant)乳化充分，背部皮下3-4点注射；间隔3 周进行第三次免疫，免疫方法及途径与第二次相同。第三次免疫后3周取尾血测定免疫效果，用间接ELISA法检测鼠疫Fl抗体。细胞融合前三天，选一只鼠疫Fl抗体效价最高的小鼠，腹腔注射鼠疫Fl抗原IOOyg(约0. 5ml)加强免疫一次。BALB/c小鼠经过三次免疫，第三次免疫后3周取尾血，使用间接ELISA法检测血液中的Fl抗体，抗体效价的具体情况见表1。表 权利要求
1.一种制备分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)小鼠免疫每只BALB/C小鼠注射100μ g鼠疫Fl抗原；(2)细胞融合与接种将免疫后的小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，在融合的过程中采用Sigma公司生产的PEG，所述PEG溶液的浓度为50% ；将融合细胞用HAT及HT 培养液接种，所述HAT及HT培养液采用Sigma公司的HAT冻干粉和HT冻干粉制备；采用 Hyclone公司生产的加强型小牛血清为融合细胞提供营养来源；(3)鼠疫Fl抗体检测采用酶联免疫吸附测定检测所述融合细胞培养上清中的鼠疫Fl 抗体，其中鼠疫Fl抗原的包被浓度为8 μ g/ml ；(4)杂交瘤细胞克隆化将两次所述鼠疫Fl抗体检测均为阳性的杂交瘤细胞株进行至少三次克隆化，直到单个细胞克隆的鼠疫Fl抗体检测均为阳性。
2.根据权利要求1所述的方法获得的杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株IB12 株的CCTCC保藏号为C201088，所述杂交瘤细胞株能够分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体。
3.一种抗体，其特征在于，所述抗体由权利要求2所述的杂交瘤细胞株分泌。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体为IgGh亚型。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的抗体。
6.根据权利要求1所述的方法获得的杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株2C6 株的CCTCC保藏号为C201089，所述杂交瘤细胞株能够分泌抗鼠疫耶尔森菌Fl抗原单克隆抗体。
7.一种抗体，其特征在于，所述抗体由权利要求6所述的杂交瘤细胞株分泌。
8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于，所述抗体为IgG2b亚型。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7所述的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种制备分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，以及根据该方法获得的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。所述方法包括小鼠免疫、细胞融合与接种、鼠疫F1抗体检测、杂交瘤细胞克隆。本发明的分泌高效价抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株能够持续性地产生鼠疫F1单克隆抗体，为建立鼠疫快速诊断方法提供了抗体源。
文档编号C07K16/12GK102206612SQ20101050056
公开日2011年10月5日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者于国林, 唐雪, 尹家祥, 杜春红, 王鹏, 董兴齐, 钟佑宏, 陈平 申请人:云南省地方病防治所