专利名称：一种单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
背景技术：
李痘病毒(Plum pox virus, PPV)是侵染核果类果树(李、桃、油桃、杏、樱桃)危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，则叶片、花、果实及果核都表现不同的症状，叶片扭曲褪绿、叶脉黄化，特别是果实变形变小，出现花斑，造成果实品质下降，未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，甚至造成绝收，是我国的检疫性有害生物。李痘病毒的长距离扩散主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。目前植物病毒的检测方法主要包括生物学、血清学和分子生物学方法。而单克隆抗体由于其是针对单一抗原决定簇产生的，所以具有特异性好的优势，为植物病毒免疫学方法的应用奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种李痘病毒单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明保护一种分泌李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3F1，已于 2011年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No. M74。本发明还保护所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。所述单克隆抗体在辅助鉴定李痘病毒中的应用也属于本发明的保护范围。所述单克隆抗体在辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒中的应用也属于本发明的保护范围。所述待测病毒具体可为李痘病毒、马铃薯A病毒或莴苣花叶病毒。所述单克隆抗体在辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒中的应用也属于本发明的保护范围。所述植物具体可为本生烟或昆诺藜。本发明还保护所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下
(a)或(b)或(c)(a)辅助鉴定李痘病毒；(b)辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒；(c)辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒。所述待测病毒具体可为李痘病毒、马铃薯A病毒或莴苣花叶病毒。所述植物具体可为本生烟或昆诺藜。本发明还保护含有所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)或
(b)或(C)(a)辅助鉴定李痘病毒；(b)辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒；(c)辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒。
所述待测病毒具体可为李痘病毒、马铃薯A病毒或莴苣花叶病毒。所述植物具体可为本生烟或昆诺藜。本发明提供的单克隆抗体用于检测李痘病毒，具有特异性好、效价高、广谱性等优点。本发明研制的李痘病毒的单克隆抗体可用于研制李痘病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条，抗体芯片，生物传感器等。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。DIECA指的是二乙基二硫代氨基甲酸钠。DSMZ指的是德国微生物菌种保藏中心。 ATCC指的是美国模式培养物集存库。实施例中所用的Mcllvain，s citric acid-phosphate buffer (柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)为pH7.0、0. 18mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。实施例中所用的硼酸盐缓冲液为PH8. 2、0. 05mol/L的硼酸钠缓冲液。将碱性磷酸酶标记的马抗小鼠酶标抗体(购自中杉金桥公司)按照1 1000稀释，即为实施例中的酶标二抗工作液。本生烟(Nicotiana benthamiana)公众可以从中国检验检疫科学研究院获得； 参考文献黄峰，陈青，陈红运，白静，李桂芬等，黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制，植物检疫，2009年第4期，第23卷，24-26页。昆诺藜(Chenopodium quinoa)公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献李桂芬，马洁，魏梅生等，番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测，植物检疫，2009年第6期，第23卷，16-18页。接种李痘病毒并发病的病叶表型为系统花叶、皱缩症状。接种马铃薯A病毒并发病的病叶表型为系统花叶症状。接种莴苣花叶病毒并发病的病叶表型为系统褪绿斑、皱缩症状。每1升包被缓冲液按照如下方法配制将碳酸钠1. 59g、碳酸氢钠2. 93g和叠氮化钠0. 20g溶于蒸馏水，用蒸馏水定容至IL ；包被缓冲液的pH值为9. 6。每1升洗涤缓冲液按照如下方法配制将氯化钠8.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠1. 15g、氯化钾0. 2g、吐温200. 5mL和叠氮化钠0. 2g溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至IL ； 洗涤缓冲液的PH值为7.4。每1升磷酸盐缓冲液按照如下方法配制将氯化钠8.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠1. 15g、氯化钾0. 2g和叠氮化钠0. 2g溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至IL ；缓冲液的pH 值为7.4。每1升样品抽提缓冲液按照如下方法配制将亚硫酸钠1. 3g和聚乙烯基吡咯烷酮 (分子量24000-40000) 20g溶于洗涤缓冲液中，用洗涤缓冲液定容至1L。每1升酶标抗体稀释缓冲液按照如下方法配制将聚乙烯基吡咯烷酮(分子量 24000-40000) 20g和牛血清白蛋白2g溶于洗涤缓冲液中，用洗涤缓冲液定容至1L。每1升底物稀释液按照如下方法配制二乙醇胺(C4H11NO2) 97mL,蒸馏水600mL，用盐酸调PH值至9. 8，然后用蒸馏水定容至1L。
底物溶液按lmg/mL的浓度将对硝基苯磷酸二钠溶于底物稀释液中，制成底物溶液。实施例1、杂交瘤细胞的获得一、病毒繁殖与纯化1、将李痘病毒(购自DSMZ，编号PV-0001)接种在本生烟上，第20天采收病叶，IOg 病叶加25ml缓冲液甲(由Mcllvain’ s citric acid-phosphate buffer和如下浓度的溶质组成体积百分浓度为0. 2%的巯基乙醇、0. 01mol/L DIECA、0. 5mol/L尿素、0. 003mol/ L EDTA)，用组织捣碎机勻浆后，加入IOml氯仿，用玻璃棒搅拌5min后进行离心(3630Xg、 lOmin)，吸取上清(离心后试管内分成三层，最下层为氯仿，中间层为组织碎片，取最上层的上清液)。2、将步骤1的上清进行离心(75600Xg、3h)，取沉淀。3、将步骤2的沉淀悬浮于缓冲液乙(由硼酸盐缓冲液和如下浓度的溶质组成 0. 01mol/L EDTA、0.5mol/L尿素)中，4°C搅拌过夜，然后进行离心(1500X g、5min)，取上清。4、将步骤3的上清进行20%蔗糖垫离心(2178MXg、2h)，取沉淀。5、将步骤4的沉淀悬浮于缓冲液乙中，4°C搅拌3h，离心(11400XgUOmin)并取上清，即为纯化的李痘病毒制剂(含李痘病毒)。6、将步骤5制备的纯化的李痘病毒制剂用紫外分光光度计进行紫外测定，测定病毒溶液的OD26tlnm值，按照公式“病毒浓度=病毒溶液的OD26tlnm值/病毒的吸光常数”计算， 纯化的李痘病毒制剂的OD26tlnm值为9. 859，病毒的吸光常数为2. 5，纯化的李痘病毒制剂中李痘病毒的浓度为3. 94mg/mL·二、杂交瘤细胞的获得1、小鼠免疫将纯化的李痘病毒制剂在与其同体积的弗氏完全佐剂中乳化，乳化后对8周龄的 BALB/c小鼠进行第一次免疫(腹腔注射，每只小鼠200 μ g李痘病毒)。2周后，将纯化的李痘病毒制剂在与其同体积的弗氏不完全佐剂中乳化后对小鼠进行第二次免疫(腹腔注射， 每只小鼠200 μ g李痘病毒)。2周后，将纯化的李痘病毒制剂在与其同体积的弗氏不完全佐剂中乳化后对小鼠进行第三次免疫(腹腔注射，每只小鼠200yg李痘病毒)。融合前3 天将纯化的李痘病毒制剂对小鼠进行第四次免疫(加强免疫)，加强免疫是将纯化的李痘病毒制剂直接注射小鼠腹腔(腹腔注射，每只小鼠200 μ g李痘病毒)。2、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和保藏取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，用纯化的李痘病毒制剂g病毒/ ml)包被酶标板，采用间接ELISA进行测定。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100%，阳性克隆细胞及时冻存。获得了 1株能稳定分泌李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株命名为3F1，于2011年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. M74。实施例2、单克隆抗体的鉴定一、单克隆抗体的制备
将分泌李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F1置于DMEM细胞培养基(购自 ATCC，货号30-2002 ；含体积百分浓度为20 %的胎牛血清)中，在37°C条件下进行培养，3 天天均可)后收集上清液。将上清液用G蛋白柱(GE公司)进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。二、单克隆抗体Ig类型的鉴定采用Sigma公司单抗分型试剂按说明书进行单克隆抗体Ig类型的鉴定。3F1单克隆抗体为IgGl亚类。三、单克隆抗体的效价测定1、包被将实施例1的步骤一制备的纯化的李痘病毒制剂用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中(100 μ L/孔)，李痘病毒的包被浓度为4 μ g/mL ；37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。将Ig健康本氏烟叶片加入IOml包被缓冲液中，在研钵中研磨，得到阴性对照液。 将阴性对照液加入酶标板中(100 μ L/孔)，即为阴性对照孔，37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。2、封闭每孔加入100 μ L含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，37°C孵育30min，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。3、每孔加入100 μ L步骤一得到的单克隆抗体或其稀释液(用酶标抗体稀释缓冲液进行稀释)，37°C孵育池，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。4、每孔加入100 μ L酶标二抗工作液，37°C孵育池，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。5、每孔加入100 μ L底物溶液，室温避光孵育60min后用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸收值。将吸收值为阴性对照孔的两倍以上的孔判断为阳性孔。单克隆抗体的效价为1 104。实施例3、单克隆抗体的特异性和灵敏度测定本实施例中采用6种李痘病毒，均购自DSMZ，DSMZ编号分别为PV-0001、PV-0209、 PV-0212、PV-0213、PV-0305和PV-0430。根据编号，将以上6种李痘病毒分别命名为李痘病毒 PV-0001、李痘病毒PV-0209、李痘病毒PV-0212、李痘病毒PV-0213、李痘病毒PV-0305和李痘病毒PV-0430。以上6种李痘病毒均接种在本生烟(Nicotiana benthamiana)上保存。本实施例中采用的马铃薯A病毒(Potato virus A ；缩写为PVA)，购自DSMZ，DSMZ 编号为PV-0760，接种在本生烟(Nicotiana benthamiana)上保存。本实施例中采用的莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus，缩写为LMV)，购自 ATCC，ATCC编号为PV-63，接种在昆诺藜(Chenopodium quinoa)上保存。一、实验材料的获取分别取接种6种李痘病毒14天并发病的本生烟叶片，作为样本1至样本6 (依次对应李痘病毒PV-OOO1、李痘病毒PV-0209、李痘病毒PV-0212、李痘病毒PV-0213、李痘病毒 PV-0305 和李痘病毒 PV-0430)。取接种马铃薯A病毒并发病的本生烟叶片，作为样本7。
取接种莴苣花叶病毒并发病的昆诺藜叶片，作为样本8。将健康本生烟叶片作为对照样本1。将健康昆诺藜叶片作为对照样本2。二、单克隆抗体的特异性测定分别取样本1至样本8各Ig加入IOml样品抽提缓冲液并研磨，依次作为样本液 1至样本液8。分别取对照样本1和对照样本2各Ig加入IOml样品抽提缓冲液研磨，依次作为对照液1和对照液2。分别将样本液1至样本液8、对照液1和对照液2作为待测样本液进行如下实验1、用李痘病毒包被抗体(购自Agdia公司)按照使用浓度包被酶标板，37°C孵育 I，用洗涤缓冲液洗酶标板。2、加入待测样本液，100 μ L/孔，4°C冰箱孵育16h，用洗涤缓冲液洗酶标板。3、将实施例2制备的单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的马抗小鼠酶标抗体和酶标抗体稀释缓冲液混合，使单克隆抗体的浓度为2 μ g/mL，碱性磷酸酶标记的马抗小鼠酶标抗体的稀释度为1 1000，得到混合液；将混合液加入酶标板中，100 μ L/孔，37°C孵育4h，用洗涤缓冲液洗酶标板。4、每孔加入100 μ L底物溶液，室温避光孵育60min后用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸收值。结果见表1。单克隆抗体与马铃薯A病毒、莴苣花叶病毒没有交叉反应，特异性好。 单克隆抗体与6种李痘病毒均为阳性反应，具有广谱性。表1单克隆抗体的特异性
权利要求
1.分泌李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，它的保藏编号为CGMCCNo. 5474。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述单克隆抗体在辅助鉴定李痘病毒中的应用。
4.权利要求2所述单克隆抗体在辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒中的应用。
5.权利要求2所述单克隆抗体在辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒中的应用。
6.权利要求2所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a) 或(b)或(C)(a)辅助鉴定李痘病毒；(b)辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒；(c)辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒。
7.含有权利要求2所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)(a)辅助鉴定李痘病毒；(b)辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒；(c)辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒。
全文摘要
本发明公开了一种李痘病毒单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明提供了分泌李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，它的保藏编号为CGMCC No.5474。本发明还保护所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。所述单克隆抗体可用于如下(a)或(b)或(c)(a)辅助鉴定李痘病毒；(b)辅助鉴定待测病毒是否为李痘病毒；(c)辅助鉴定待测植物样本是否感染李痘病毒。本发明提供的单克隆抗体用于检测李痘病毒，具有特异性好、效价高、广谱性等优点。
文档编号C07K16/10GK102391994SQ20111036741
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者张永江, 朱水芳, 李桂芬, 粟智平, 马洁, 魏梅生 申请人:中国检验检疫科学研究院