玉米锌铁调控转运体ZmCTRl基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了玉米锌铁调控转运体ZmFTRl基因及其应用。本发明从玉米中分离得到锌铁调控转运体ZmFTRl基因，其cDNA序列为SEQIDNo.1所示。亚细胞定位表明，该锌铁调控转运体定位在细胞的质膜与内质网，在植物细胞中起到吸收、转运和储存锌铁以及参与锌铁离子的解毒等作用。实时定量RT-PCR表达分析发现，ZmlTRl在缺锌或缺铁的根和地上部表达均上调，在胚发育的后期表达明显上调，对于胚的发育具有重要的调控作用。酵母互补实验表明，ZmCTRl基因具有锌铁互补能力。本发明所分离的ZmlTRl基因对于调控植物吸收、转运和储存锌铁的能力、促进胚的发育以及增加粮食作物籽粒中锌铁含量等有重要的应用前景。
【专利说明】玉米锌铁调控转运体ZmITRI基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从植物中分离的金属离子转运体基因，尤其涉及从玉米中分离的与锌 铁的吸收、转运或储存有关的调控转运体ZmITRl基因，本发明进一步涉及该调控转运体 ZmITRl基因在调控植物吸收、转运或储存锌或铁能力、解除过量的锌铁对植物的毒害以及 增加粮食作物种子锌铁含量中的应用，属于植物金属离子调控转运体基因的分离和应用领 域。
【背景技术】
[0002] 锌和铁是生物体所必需的微量元素，在植物的生长发育过程中有着重要作用 (ffintz H, Fox T,Wu YY, et al.Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis. The Journal of biological chemistry2003, 278(48) :47644-47653.)。锌是生物体300多 种酶和重要蛋白质的结构辅助因子（Haydon MJ，Cobbett CS. A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis. Plant physiology2007, 143 (4) : 1705-1719.)。锋不仅参与机体的各种 代谢，在生物膜稳定和基因表达调控等生理机能中也担负着重要的角色（Mathews WR，Wang FjEide DJjet al. Drosophila fear of intimacy encodes a Zrt/IRT-like protein (ZIP) family zinc transporter functionally related to mammalian ZIP proteins. The Journal of biological chemistry2005, 280 (I) :787-795.)。锋的缺乏会导致叶绿素、月旨 质、蛋白、质膜的氧化破坏，适量增加植物体内锌的含量可提高作物产量，而植物体内锌离 子的过度积累又会对植物产生毒害。
[0003] 铁在细胞呼吸、光合作用和金属蛋白的催化反应过程中发挥重要作用，是重要的 电子传递体，因此，铁元素在原核和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能。另外， 细胞内过高的Fe 3YFe2+氧化还原势会导致超氧化合物的产生，对细胞造成伤害（Briat JFj Lebrun M. Plant responses to metal toxicity. Comptes rendus de 1'Academie des sciences Serie III，Sciences de la viel999, 322(1) :43-54.)。因此，严格控制植物体 内金属离子的平衡是至关重要的。
[0004] 参与锌铁吸收的蛋白主要有三类，都是以蛋白家族形式存在的，包括：ZIP，即 锋调控转运体（Zinc-regulated transporter，ZRT)和铁调控转运体（Iron-regulated transporter，IRT)。酵母功能互补实验显示ZIP家族基因能够转运包括Zn 2+、Fe2+、 Cu2+、Cd2+ 在内的多种金属离子（Colangelo EP，Guerinot ML. Put the metal to the petal:metal uptake and transport throughout plants. Current opinion in plant biology2006, 9 (3) : 322-330.)。ZIP -般由309-476个氨基酸残基组成，有8个潜在的跨 膜结构域和相似的拓扑结构，第3和第4跨膜区之间有一长的可变区，可变区位于胞内，其 C、N末端位于胞外，该区富含组氨酸残基，可能与金属的结合、转运有关（Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochim Biophys Acta2000,1465 (1-2):190-198.)〇
[0005] 目前在拟南芥、水稻、蒺藜苜蓿、大豆、野生型二粒小麦、葡萄等植物中鉴定出 ZIP基因并对其功能进行了研究。在拟南芥中发现16个ZIP家族基因，AtIRTl是通过 酵母互补实验分离得到的第一个ZIP功能基因，其主要在根部表达，且该基因的过表达 可导致儀的过度积累（Eide D，Broderius M，Fett J，et al. A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal996, 93 (11) : 5624-5628 ；Henriques RjJasik JjKlein Mj et al. Knock-out of Arabidopsis metal transporter gene IRTlresults in iron deficiency accompanied by cell differentiation defects. Plant molecular biology2002,50(4-5):587-597 ; Varotto Cj Maiwald D，Pesaresi P，et al.The metal ion transporter IRTl is necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant journal: for cell and molecular biology2002,31 (5):589-599 ; Vert Gj Grotz N，Dedaldechamp F，et al. IRTlj an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth. Plant Cell2002, 14 (6) : 1223-1233 ；Nishida SjTsuzuki CjKato A, et al. AtIRTlj the primary iron uptake transporter in the root, mediates excess nickel accumulation in Arabidopsis thaliana. Plant&cell physiology2011，52(8):1433-1442.)? AtIRT2 主 要在根部表达，定位在囊泡，推测具有细胞内过量金属元素的解毒功能（Vert G，Briat JFjCurie C. Arabidopsis IRT2 gene encodes a root-periphery iron transporter. The Plant journal: for cell and molecular biology2001，26(2) :181-189 ;Vert G，Barberon MjZelazny Ej et al. Arabidopsis IRT2 cooperates with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeostasis in root epidermal cells. Planta2009,229 (6): I 171-1179. 14, 15) JtIirn能互补锌、铁转运双突变体，过表达AtIRT3会使锌在地上部、铁在 地下部积累（Lin YF，Liang HM，Yang SY，et al. Arabidopsis IRT3 is a zinc-regulated and plasmamembrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 18 2(2) :392-404.)。表达分析显示，AtZIPl、AtZIP5、AtZIP9、AtZIP12 和 AtIRT3 受缺锌诱导， 由此推测，这些基因在缺锌条件下可能增强锌的吸收能力（Kramer U，Talke IN，Hanikenne M.Transition metal transport. FEBS Lett2007, 581 (12):2263-2272.)〇
[0006] 玉米（Zea mays)是中国重要的粮食、饲料和经济作物，增加玉米籽粒中锌、铁等 微量元素的含量，对提高饮食或饲料利用效率、促进经济的发展及人体健康尤为重要。目 前，已知许多转运蛋白参与了植物体内锌铁离子平衡网络系统，其中ZH^Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)基因家方矣对锋、铁等二 价金属离子的吸收、运输和储存起着重要作用，在拟南芥、水稻、大麦、大豆上，已报道了一 些有关ZIP家族基因的研究，但对ZIP家族基因在植物体内具体的作用机制尚未完全了解， 而关于玉米的ZIP家族基因的研究报道较少。了解Zn 2+、Fe2+在玉米中的吸收、运输方式， 分布规律和调节机制，将有助于改善玉米在锌、铁缺乏的环境中的生长发育，为进一步揭示 玉米中ZIP家族基因的作用机理奠定基础，为玉米锌、铁高效转基因育种提供候选基因，也 为人类锌铁营养提供良好的基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供从玉米（Zea mays)中分离的锌铁调控转运体基因；
[0008] 本发明的目的之二是提供锌铁调控转运体基因所编码的蛋白质；
[0009] 本发明的目的之三是将所述的锌铁调控转运体基因应用于调控植物对锌铁等金 属离子的吸收、转运或储存，解除过量的锌铁对植物的毒害或者增加粮食作物籽粒中锌铁 含量。
[0010] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 从玉米（Zea mays)中分离的锌铁调控转运体ZmITRl基因，其cDNA序列为（a)、 (b)或（c)所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1 所示的核苷酸；
[0013] (b)、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸；
[0014] (c)、与SEQ ID NO: 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷 酸所编码的蛋白质具有锌铁调控转运体的功能。
[0015] 所述"严谨杂交条件"意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常， 在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高 (例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同， 较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针 100%互补的祀序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)〇 更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（Tm) 约5-10°C。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指 定离子强度、PH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50% 的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在PH7. 0到8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离 子浓度，通常为约〇· 01到I. OM钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但 不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30°C，而对于长探针（包括（但不限于）大于50 个核苷酸）而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对 于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。 例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培养；或5XSSC， 1% SDS，在65°C下培养，在0. 2XSSC中洗涤和在65°C下于0. 1%SDS中洗涤。所述洗涤可 进行5、15、30、60、120min或更长时间。
[0016] 优选的，本发明从玉米中所分离的锌铁调控转运体ZmITRl基因的cDNA序列为SEQ ID No. 1 所示。
[0017] 本发明目的之二是提供由上述锌铁调控转运体ZmITRl基因所编码的能够吸收、 转运或储存锌铁的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为（a)或（b)所示：
[0018] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0019] (b)、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有锌铁调控转运体功能的蛋白变体；
[0020] 特别优选的，本发明所述的锌铁调控转运体的氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。
[0021] 所述的"多个"通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于锌铁调控转运体三维 结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的"替换"是指分别用不同的氨基酸残基取 代一个或多个氨基酸残基；所述的"缺失"是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其 中的一个或多个氨基酸残基；所述的"插入"是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而 言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
[0022] 本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本 领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备锌铁调控转运体的氨基酸序列变体或片段，其 中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残 基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。因此，本发明所述的锌铁调控转运体及其编码基 因包括天然存在的序列和变体两种形式。"变体"意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变 体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对 于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变 体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括 合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多 核苷酸变体，或者是通过重组的方法（例如DNA重排等）。本领域技术人员可通过以下分子 生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性，蛋白 之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。
[0023] 本发明从玉米中分离、克隆了锌铁调控转运体ZmITRl基因，亚细胞定位的实验 结果表明，ZmITRl基因编码蛋白定位在质膜与内质网，因此推测其与锌铁离子的解毒与 储存有关，在植物细胞中起到吸收、转运和储存锋铁以及参与锋铁尚子的解毒等功能。在 亚细胞定位的基础上，本发明进一步对授粉后不同天数的玉米胚和胚乳进行了表达分析， 结果发现，ZmITRl在缺铁的根和地上部表达均上调，缺锌96h的地上部分表达量增加，说 明，ZmITRl基因具有调控植物（包括地下部分和地上部分）吸收、转运锌铁的功能；此外， ZmITRl基因主要在胚中表达，并且，ZmITRl在胚发育的后期表达上调，说明ZmITRl与胚的 成熟有关，并参与调控籽粒中锌或铁含量的积累。
[0024] 酵母互补实验表明，本发明所分离的ZmITRl基因与水稻和拟南芥中的ZIP基因相 似，具有锌铁转运功能。
[0025] 目前，已知许多转运蛋白参与了植物体内锌铁离子平衡网络系统，一些蛋白也被 应用到植物的转基因研究中，比如在大麦中过表达AtZIPl基因能够增加锌和铁在种子中 的含量（Ramesh SA, Choimes S, Schachtman DP. Over-expression of an Arabidopsis zinc transporter in hordeum vulgare increases short-term zinc uptake after zinc deprivation and seed zinc content. Plant molecular biology2004, 54 (3):373-385.), 同样，过表达OsIRTl基因，水稻中锌和铁的含量在地上部、地下部和种子中都有所提 高(Lee S, An G. Over-expression of OsIRTl leads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant, cell&environment2009, 32(4) :408-416.)。然而，在水稻 中过表达0sZIP4、0sZIP5、0sZIP8, 0sZIP9结果导致过量的锌聚集于根部，降低了植株地上 部分的锋含量（Lee S, Kim SA, Lee J，et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice.Molecules and cells2010, 29(6):551-558 ；Lee S, Jeong HJ, Kim SA, et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice.Plant molecular biology2010, 73(4-5) :507-517 ；Ishimaru Y, Masuda H, Suzuki M, et al. Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58 (11) : 2909-2915.)没有达到在籽粒中增加锌含量的目的，因此，这些基因的 过表达对水稻籽粒中锌的富集是不利的。这些结果表明，异位过表达对于锌铁的积累与分 布可能会起到一定的作用。然而，有关锌铁转运蛋白在籽粒中的研究还很少。
[0026] 本发明通过ZmITRl基因在胚和胚乳中的表达模式了解到ZmITRl主要在胚中表 达，所以，将本发明的ZmITRl基因在粮食作物种子中进行过表达能够增加籽粒中锌铁含量 的积累。
[0027] 因此，本发明提供了一种调控植物吸收、转运或储存锌铁的能力，解除过量的锌铁 对植物毒害，调控胚或胚乳的发育或成熟以及增加粮食作物籽粒中锌铁含量的方法，包括： 将本发明ZmITRl基因可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；将重组植 物表达载体转化到植物中，在植物体中过表达ZmITRl基因；特别的，将本发明ZmITRl基因 在粮食作物种子中进行过表达时，能够有效增加粮食作物种子中锌铁的含量。
[0028] 本发明进一步提供了含有所述锌铁调控转运体基因的重组植物表达载体以及含 有该重组植物表达载体的宿主细胞。
[0029] 将所述锌铁调控转运体基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中 表达该锌铁调控转运体基因的重组植物表达载体。"可操作的连接"指两个或更多个元件之 间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。例如，该重组植物表达载体可 以由5'端非编码区，SEQ IDNo. 1所示的核苷酸和3'非编码区组成，其中，所述的5'端 非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组 成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3'非编码区可以包含终止 子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱 合成酶或胭脂碱合成酶终止区。例如，为了使本发明的锌铁调控转运体基因在粮食作物种 子进行特异性表达，可以将锌铁调控转运体基因连接在种子特异性表达启动子的下方构建 得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化受体植物后，锌铁调控转运体基因可 以在受体植物的种子里进行特异性表达，达到增加种子锌铁含量或调控胚发育的效果。
[0030] 另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列进行优化以增强其 在植物中的表达。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强该 基因在目标植物中的表达水平，这些方法均为本领域技术人员所习知。
[0031] 此外，该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择 性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。所述的选择性标记基因包括：编码抗生素抗性 的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如 β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
[0032] 所述的"转化"指将基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传 转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限 于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。"稳定转化"指被引入的多核苷酸构建体整合 至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；"瞬时转化"指多核苷酸被引入到植物中但只 能在植物中暂时性表达或存在。
[0033] 转化方案以及将所述多核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植 物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸转化植物细胞的合适方法包 括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的 实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的ZmITRl基因提供给植物。在其它实施方案 中，本发明的ZmITRl基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这 样的方法涉及将本发明的ZmITRl基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。
[0034] 利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植 物或双子叶植物；优选的，所述的目标植物包括粮食作物、蔬菜或果树等，更优选为粮食作 物，例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱、大豆、马铃薯等粮食作物。
[0035] 本发明所涉及到的术语定义
[0036] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者 类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0037] 术语"重组宿主细胞株"或"宿主细胞"意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管 使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组 中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
[0038] 术语"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核 苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知 类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷 酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简 并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一 个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实 现简并密码子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;011丨8111^等人，工 Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，]?〇1〇611· Probes8:91-98(1994))。
[0039] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮P， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨 基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基 酸残基经由共价肽键连接。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1酵母表达载体pFL61的示意图。
[0041] 图2标准Hoagland培养基条件下ZmITRl的表达模式；S (shoot)，R (root)。
[0042] 图3ZmITRl基因在各种处理条件下的表达模式。
[0043] 图4ZmITRl基因在玉米胚和胚乳发育过程中的表达模式。
[0044] 图5不同物种的ZIP成员的系统发生树分析。
[0045] 图6pRTL2NGFP-ZmITRl重组载体酶切鉴定。
[0046] 图7pRTL2NGFP-ZmITRl载体构建流程图。
[0047] 图8ZmITRl洋葱表皮细胞中的亚细胞定位；GFP为pRTL2NGFP空载体定位情况； ZmITRl为pRTL2NGFP-ZmITRl的亚细胞定位情况。
[0048] 图9ZmITRl拟南芥叶肉原生质体中的亚细胞定位；GFP为pRTL2NGFP空载体定位 情况；ZmITRl为pRTL2NGFP-ZmITRl的亚细胞定位情况。
[0049] 图 10pFL61-ZmITRl 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 正向连 接重组载体酶切鉴定；M为IKb的Marker ;1-4依次为pFL61-ZmITRl、pFL61-〇sZIP5、 pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 双酶切结果。
[0050] 图I lpFL61-ZmITRl载体构建流程图。
[0051] 图12ZmITRl酵母互补实验结果。
[0052] 图13植物表达载体pBim-ZmITRl的示意图。
[0053] 图HZmITRl基因在拟南芥中过表达提高拟南芥中锌或铁含量的实验结果； ZmITRl为转ZmITRl基因拟南芥种子中铁和锌含量测定的结果；WT为野生型哥伦比亚种子 中铁和锌含量测定的结果。
【具体实施方式】
[0054] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0055] 实验材料
[0056] I. 1植物材料
[0057] 玉米自交系X178由河北农业大学农学院/国家玉米改良中心河北分中心实验室 提供，水稻自交系日本晴由北京师范大学生命科学院惠赠。
[0058] L 2菌株与载体
[0059] 大肠杆菌（E. coli)菌株 Machl-Tl 和农杆菌（A. tumefacterium)菌株 EHA105、 GV3101均由本实验室保存。pGEM-Teasy载体购自Promega公司。酵母表达载体 pFL61(不意图见图 1)，酵母菌株 zrtlzrt2 ZHY3(MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3 zrtl::LEU2 zrt2::HIS3), fet3fet4DEY1453(MATa/MATa ade2/+ canl/canl his3/ his3 Ieu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-l::LEU2/ fet4-l: :LEU2)，DY1455(MATa ade6canlhis31eu2trplura3)由南京农业大学张红生教授友 情惠赠。
[0060] 实施例1玉米锌铁调控转运体ZmITRl基因的克隆
[0061] 1、植物材料的处理
[0062] 先把蛭石用Hoagland营养液浸透，将玉米自交系X178种子点播于育苗盘中，上面 覆盖上一层干蛭石，在温室（16h光照/8h黑暗，26°C )中培养，12天幼苗长至2叶一心时移 入标准Hoagland营养液中生长6天至3叶一心（每3天换一次营养液），3叶一心的玉米 幼苗在标准营养液和不加锌、铁、铜、锰及高锌、铁的条件下处理〇、6、12、24、48、96h后，分 别收取幼苗地上部和根，液氮速冻后于-80°C保存用于总RNA提取。
[0063] 2、玉米总RNA的提取
[0064] 采用Trizol法提取玉米总RNA。
[0065] 3、cDNA 的合成
[0066] (1)、去除 DNA，按下述配制反应体系：总 RNA(lyg/yL)1.0yL，DNAse I(K)U/ yL)1.0yL，10XDNAse I bufferl.OyL，DEPC H207.0 yL，总计 10.0yL;37°C30min，加入 I μ L25mM EDTA，65°C 5min 终止反应。
[0067] (2)、加入 I μ L oligo (dT18)，65°C 5min ;
[0068] (3)、以上共12 μ L，再加入以下组分得到反转录体系：5X反应缓冲液4.0 μ L， Ri RT (20U/ μ L) I. 0 μ L，Re RT (200U/ μ L) I. 0 μ L，IOmM dNTP mix2. 0 μ L，总计：20. 0 μ L ; 42°C 60min，70°C 5min，终止反应。
[0069] 4、目的基因的克隆
[0070] (1)、根据目的基因的ORF框设计引物：
[0071] ZmITRlF 5'-GCGGCCGCTCTAGAATGTCTTGGCGGCGAAACC-3' NotI, XbaI
[0072] ZmITRlR 5'-GCGGCCGCTACGTATCA CGCCCACTTGGCCATGATG-3' Notl，SnaBI
[0073] 以上述步骤3的cDNA为模板，选用ExTaq酶，2 X GCI buffer进行PCR扩增，PCR 程序为：95°C预变性4min ;94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33个循环；72°C 延伸IOmin ;
[0074] (2)、将克隆得到的片段克隆到pGEM-T载体中，转化Machl-Tl菌株；
[0075] (3)、经酶切鉴定获得阳性的重组质粒，命名为pGEM-ZmITRl，测序得到正确克隆。 将所克隆的基因命名为ZmITRl，该基因的cDNA序列为SEQ ID No. 1所示，所推导的氨基酸 序列为SEQ ID No. 2所示，其全基因组序列为SEQ ID No. 3所示。
[0076] 实施例2 ZmITRl在幼苗、胚和胚乳中的表达模式
[0077] 将实施例1步骤三中反转录的cDNA稀释10倍作为PCR反应的模板，PCR反应体 系如下：
[0078] cDNA2. 0μ L，ExTaq0. 1 μ L，2XGCI 缓冲液 10. 0μ L，IOmM dNTP mixO. 8μ L，上游弓 I 物 RTZmITRlF(K) μ M/ μ L) I. 0 μ L，下游引物 RTZmITRlR(K) μ M/ μ L) I. 0 μ L，ddH205. 1 μ L， 总计 20. 0 μ L ;
[0079] RTZmITRlF5'-CACCACCTTCGTCGCCAT-3'
[0080] RTZmITRlR5'-TGTTGCCACCCTTCCTCC-3'
[0081] PCR反应条件：94°C预变性4min ;30个循环，每个循环94°C变性45秒，60°C退火 lmin，72°C延伸Imin ;最后再延伸72°C 10min，降温至16°C，取出PCR产物放入4°C保存。
[0082] 目的基因表达量的检测：实施例1步骤3中反转录的cDNA稀释20倍作为 Real-time PCR反应的模板，Actin为内参照，反应体系如下：
[0083] cDNA5. 0 μ L，SYBR Green 110. 0 μ L，RoxO. 4 μ L，上游引物 ZmActinlFdOyM/ 4 1^)0.4 4 1^，下游引物211^(^11111?(1(^]\1/^1^)0.4 4 1^，(1(1!1203.8 4 1^，总计10.(^1^;
[0084] ZmActin1F5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'
[0085] ZmActinlR5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'
[0086] 所用程序：95°C 2min，95°C 15sec，60°C 34sec，40 个循环,通过 Δ Δ Ct 法计算表达 量。
[0087] 通过real-time RT-PCR表达分析发现，正常营养条件下，ZmITRl在地上部和地 下部都有表达，在根中表达量较高（图2)，缺锌条件下，ZmITRl在96h地上部表达上调； ZmITRl在高锌条件下地上部的表达量逐渐升高，96h时达到最高，然而，地下部的表达量降 低（图3)。这些结果表明，ZmITRl在幼苗时期对锌的浓度比较敏感。
[0088] 缺铁条件下，ZmITRl在96h时地上部表达上调，地下部表达量显著增高，高铁条件 下，ZmIRTl不论是地上还是地下的表达量都是降低的（图2)，这些结果表明ZmITRl对铁的 浓度比较敏感。
[0089] 在授粉后不同天数的胚和胚乳中的表达分析发现，ZmITRl主要在胚发育的后期表 达量明显上调（图4)，说明ZmITRl在胚的发育过程中起到一定的作用。
[0090] 实施例3 ZmITRl的生物信息学分析
[0091] 生物信息学分析表明，锌铁调控转运体ZmITRl定位在玉米的第1染色体上，锌铁 调控转运体ZmITRl由381个氨基酸组成，含有8个跨膜结构域，在第3与第4跨膜区之间 有一富含组氨酸的可变区，可能和金属离子的结合转运有关。进化树分析显示，ZmITRl与 AtIRTl、AtIRT2、OsIRTl、0sIRT2进化关系较近（图5)，推测ZmITRl可能是一个铁转运体。
[0092] 实施例4 ZmITRl的亚细胞定位
[0093] 1、融合表达载体的构建
[0094] 根据ZmITRl基因的序列设计引物，引物序列如下：
[0095] ZmITRlGF5'-CTCGAGATGTCTTGGCGGCGAAACC-3'XhoI
[0096] ZmITRlGR5'-TCTAGACGCCCACTTGGCCATGATG-3'XbaI
[0097] 加入合适的酶切位点，并且基因3'端去除终止密码子，以克隆基因时连接到 pGEM-T载体上测序正确的质粒为模板，选用ExTaq酶与2 X GCI buffer进行PCR扩增，PCR 程序为：95°C预变性4min ;94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33个循环；72°C 延伸lOmin。扩增片段经1 %琼脂糖凝胶电泳回收后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌菌 株Machl-Tl，经LB培养基（IPTG、X-gal、Amp)得到阳性克隆，提质粒、酶切和测序验证；以 克隆基因时连接到pGEM-Τ载体上测序正确的质粒为模板，选用ExTaq酶与2 XGCI buffer 进行PCR扩增，扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳回收后克隆到pGEM-T载体中，测序正确的质 粒酶切后，将目的片段构建到PRTL2NGFP载体上，命名为pRTL2NGFP-ZmITRl，图6为酶切鉴 定图，图7为构建流程图。
[0098] 2、用相应的酶切pRTL2NGFP载体与不同的酶切后的基因，经T4DNA连接酶连接，转 化Machl-Tl菌株，提质粒酶切鉴定筛选出正确重组体大提质粒用于基因枪转化洋葱表皮。
[0099] 3、基因枪微弹的制备
[0100] 4、用基因枪进行洋葱表皮转化
[0101] 从定位结果可知锌铁调控转运体ZmITRl定位在细胞内膜上（图8)。为进一步确 定细胞的质膜及内膜系统，选用ER marker进行拟南芥叶肉原生质体的转化，结果证明锌铁 调控转运体ZmITRl定位在细胞质膜及内质网上（图9)。
[0102] 实施例五酵母互补实验
[0103] 1、酵母表达载体的构建
[0104] 根据目的基因序列加入合适的酶切位点设计引物：
[0105] ZmITRlYF 5'-GCGGCCGCTCTAGAATGTCTTGGCGGCGAAACC-3' NotI, XbaI
[0106] ZmITRlYR 5' -GCGGCCGCTACGTATCACGCCCACTTGGCCATGATG3' NotI, SnaBI
[0107] 以克隆基因时连接到pGEM-T载体上测序正确的质粒为模板，选用ExTaq与2XGCI buffer进行PCR扩增，PCR程序为：95°C预变性4min ;94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延 伸lmin，33个循环；72°C延伸lOmin。扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳回收后克隆到pGEM-T 载体中，转化大肠杆菌菌株Machl-Tl，经LB培养基（IPTG、X-gal、Amp)得到阳性克隆，提质 粒、酶切和测序验证，测序正确的质粒经相应酶切后，将目的片段构建到PFL61载体上，命 名为 pFL61-ZmITRl 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8 和 pFL61-〇sIRTl，图 10 为酶切鉴定图， 图11为构建流程图。
[0108] 用Not I酶切pFL61载体与酶切后的ZmITRl片段经T4DNA连接酶连接，转化 Machl-Tl菌株，提质粒酶切鉴定筛选出正确重组体大提质粒用于转化酿酒酵母。
[0109] 2、电击转化法转化酵母
[0110] (1)、从 YPD 平板上挑取 zrtlzrt2ZHY3、fet3fet4DEY1453 和 DY1455 的单菌落于 20mL的YH)液体培养基中，28°C摇床培养约24h ;
[0111] (2)、吸取以上2%体积的菌液转接到IOOmL的Yro培养基中继续扩繁约4-5h，待 菌液OD 6c?为1. 2-1. 5时即可制备感受态；
[0112] (3)、将菌液收集到50mL的离心管中，4°C，5, OOOrpm，离心5min，倒掉上清；
[0113] (4)、加入等体积的去离子水，冰上重悬菌体，4°C，5, OOOrpm，5min离心，倒掉上 清；
[0114] (5)、加入1/2体积的去离子水，冰上重悬菌体，4°C，5, OOOrpm，5min离心，倒掉上 清；
[0115] (6)、加入IOmL的IM山梨醇溶液，冰上重悬菌体，4°C，5, OOOrpm，5min离心，倒掉上 清；
[0116] (7)、加入450-600μ?的山梨醇溶液，用去头的枪头轻吸，重悬菌体；
[0117] (8)、按照每个I. 5mL的离心管里加入约100 μ L的感受态为准，分装；
[0118] (9)、在每管感受态中加入适量的DNA(10y L左右，c彡200ng/yL)，冰上放置 l-2min,之后吸到预冷的电击杯中，不要有气泡；
[0119] (10)、电击转化，立即加入约800 μ L，IM的预冷的山梨醇溶液，重悬菌体；
[0120] (11)、从电击杯中吸出菌体，涂布SD/Ura-平板；
[0121] (12)、SD平板上28 °C培养约6天可长出肉眼可见的菌斑。
[0122] 3、酵母阳性克隆的鉴定
[0123] (1)、取1.5mL酵母培养物，9, OOOrpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集酵母细 胞；
[0124] (2)、加入600 μ L Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞，加入80U的 Lyticase,充分颠倒混勻，37°C温育30min消化细胞壁，中间颠倒数次；
[0125] (3)、13, OOOrpm离心Imin,尽可能吸弃上清，加入250 μ L溶液YPl重悬菌体沉淀， 涡旋震荡至彻底悬浮；
[0126] (4)、加入250 μ L YP2溶液，轻柔地翻转，使菌体充分裂解，室温放置4min ;
[0127] (5)、加入350μ L YP3溶液，轻柔地翻转，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，冰上静 置3_5min，13, OOOrpm离心5min，小心吸取上清液。
[0128] (6)、将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12, OOOrpm 离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；
[0129] (7)、加入500 μ L去蛋白液PD，12, OOOrpm离心30-60秒，弃废液；
[0130] (8)、加入500 μ L漂洗液WB (已加无水乙醇），12, OOOrpm离心30-60秒,弃废液；
[0131] (9)、加入 500 μ L 漂洗液 WB，12, OOOrpm 离心 30-60 秒，弃废液；
[0132] (10)、将吸附柱AC放回空收集管中，13, OOOrpm离心2min，除去漂洗液；
[0133] (11)、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50 μ L洗 脱缓冲液EB (65-70°C水浴），室温放置2min，13, OOOrpm离心lmin。
[0134] (12)、以抽提的IyL DNA为模板，基因的两端引物为PCR扩增引物，进行PCR扩增 验证目的基因，验证正确的菌液，加入25%的甘油于-80°C保存。
[0135] 4、酵母互补实验
[0136] 将 pFL61，pFL61-ZmITRl，pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 分别转 化酵母突变株 zrtlzrt2ZHY3 和 fet3fet4DEY1453, pFL61 为阴性对照，0sZIP5、0sZIP8 为锋转运体的阳性对照（Lee S, Kim SA, Lee J, et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice. Molecules and cells2010, 29 (6) : 551-558 ；Lee S1Jeong HJ1Kim SA, et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice.Plant molecular biology2010, 73(4-5):507-517 ； Ishimaru Y, Masuda H, Suzuki M, et al. Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants.Journal of experimental botany2007, 58 (11) :2909-2915.), OsIRTl 为铁转运体的阳性对照（Lee S, An G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant, cell&environment2009, 32 (4) :408-416.), pFL61 转化野生型菌株 DY1455 作为另一阳性对照，转化后鉴定为阳性的酵母菌，在SD液体培养基中培养，酵母菌液分 别稀释4个浓度（0D_ = 1、0. 1、0. 01、0. 001)，然后取5 μ L点在低锌、低铁和正常SD的 培养基中，低锌培养基（SD培养基加入0.4mM EDTA、0.4mM EDTA和250μΜ ZnS04、0.4mM EDTA 和 300 μ M ZnSO4)，低铁培养基（SD 培养基加入 50mM MES、50mM MES 和 50 μ M FeCl3、 50mM MES 和 100 μ M FeCl3)酵母互补参照 Lin, Y. F 的试验（Lin YF, Liang HM, Yang SY, et al. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 182(2) :392-404.)方法进行，28°C培养，6 天观察 试验结果。
[0137] 酵母互补实验结果显示，在低锌条件下，加有250 μ M ZnSO4的培养基中能明显观 察到 DY-pFL61 (野生型）、Z-ZmIRTU Z-〇sZIP5、Z-〇sZIP8、Z-OsIRTl 比空载体 pFL61 长势 好；并且，ZmITRl比已经报道的水稻OsZIP长势好。在低铁条件下，D-ZmITRl比已经报道 的OsIRTl的转运活性还要强（图12) ,ZmITRl不论在低锌还是在低铁条件下都表现出极强 的锌铁转运活性，说明ZmITRl在玉米生长发育过程中对吸收和转运锌铁起主要作用。
[0138] 实验例I ZmITRl基因在拟南芥中过表达提高拟南芥种子中铁和锌含量的实验
[0139] 将ZmITRl基因与组成型35S启动子控制的植物表达载体pBI 121相连接构建得 到ZmITRl基因重组植物表达载体（图13);将构建的重组植物表达载体转化到拟南芥中， 鉴定获得阳性转ZmITRl基因拟南芥；将阳性转ZmITRl基因拟南芥与野生型哥伦比亚在相 同的载培条件下培养，收获转ZmITRl基因拟南芥种子和野生型种子，分别测定转ZmITRl基 因拟南芥种子和野生型种子中铁和锌的含量；称取一定量的植物材料经微波消解，定容，用 ICP-MS方法进行锌铁含量的测定。每批测定200mg种子，测定三批，取三批数据的平均值。 测定结果见图14。从图14的结果可见，在拟南芥中过表达ZmITRl基因能够有效提高种子 中铁和锌含量，其中铁的含量提高尤为显著。
【权利要求】
1. 从玉米（Zea mays)中分离的锌铁调控转运体ZmITRl基因，其特征在于，其cDNA序 列选自（a)、（b)或（c): (a) 、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列； (b) 、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸序列； (c) 、与SEQ ID NO: 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所 编码的蛋白质具有锌铁调控转运体的功能。
2. 权利要求1所述的锌铁调控转运体ZmITRl基因所编码的蛋白质。
3. 按照权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为（a)或（b) 所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； (b) 、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有锌铁调控转运体功能的蛋白变体。
4. 含有权利要求1或2所述锌铁调控转运体ZmITRl基因的重组表达载体。
5. 按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组植 物表达载体。
6. 权利要求1所述锌铁调控转运体ZmITRl基因在调控或改善植物吸收、转运或储存锌 或铁能力中的应用。
7. 权利要求1所述锌铁调控转运体ZmITRl基因在调控或促进植物种子胚发育中的应 用。
8. 权利要求1所述锌铁调控转运体ZmITRl基因在增加粮食作物种子锌或铁含量中的 应用。
9. 权利要求1所述锌铁调控转运体ZmITRl基因在解除过量的锌或铁对植物毒害中的 应用。
10. 按照权利要求6-9任何一项所述的应用，其特征在于，包括：将权利要求1所述锌 铁调控转运体ZmITRl基因可操作的与表达调控元件相连接，得到重组植物表达载体；将重 组植物表达载体转化受体植物或植物细胞，培育得到转基因植物。
【文档编号】C07K14/415GK104212815SQ201410239279
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2013年5月31日
【发明者】陈景堂, 李素贞, 李宏博, 祝丽英, 黄亚群 申请人:河北农业大学