制备前体药的方法

专利名称：制备前体药的方法
本申请是美国申请07/773,042号(1991年10月10日申请，在此引入作为参考)的部分连续申请。本申请也是美国申请740,501号(1991年8月5日申请，在此引入作为参考)的剖分连续申请。本申请还是下列专利申请的部分连续申请美国申请1990,271号(1988年5月4日申请)，PCT/US89/01951(1989年5月4日申请)，美国申请700,210号(1991年6月12日申请)，PCT/US89/01950(1989年5月4日申请)，美国申请07/761,868号(1991年11月4日申请)和美国申请498,225号(1990年3月23日申请)，上述每一申请均被在此引入作为参考。
本发明提供了得到合适的细胞毒性剂前体药的方法和化合物，这种前药可被酶或催化抗体活化。
通常许多药物化合物如抗病毒、免疫抑制和细胞毒性癌的化学治疗剂对正常组织具有不良的毒性作用。这些作用包括对骨髓的损害(由于不断地减损血细胞的产生)和对胃肠粘膜的损害，及脱发和恶心，这些作用限制了可以安全服用的药物化合物的剂量，因此降低了潜在的效能。
抗肿瘤剂的前体药a．核苷类似物许多核苷类似物具有抗肿瘤剂之用途，这些类似物包括5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿嘧啶核苷、氟尿嘧啶核苷、阿糖胞嘧啶、6-巯基嘌呤核糖苷、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶阿拉伯糖苷、氮杂尿嘧啶核苷、氮杂胞嘧啶核苷、氟胞嘧啶核苷、氟阿拉伯糖(fludarabine)。通常这些药物是通过转化为核苷酸类似物而起作用，这些核苷酸类似物或者抑制重要核苷酸的生物合成，或者被结合到核酸中，结果产生缺陷的RNA或DNA。
在治疗各种实心肿瘤如结肠和直肠癌，头和颈、肝、乳腺和胰腺癌中，5-氟尿嘧啶(5-FU)是具有临床活性的主要的抗肿瘤药物。5-FU的治疗指数低。给药剂量的大小受到毒性的限制，因此降低了若在肿瘤细胞附近达到较高浓度能够获得的潜在效能。
5-FU必须被组成代谢到核苷酸水平(例如，氟尿嘧啶核苷或氟脱氧尿嘧啶核苷-5′-磷酸酯)，以便发挥其潜在的细胞毒性。相应于这些核苷酸的核苷(5-氟尿嘧啶核苷和5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷)也是活性肮肿瘤剂，在某些模型体系中它们比5-FU更为有效，这可能是因这它们比5-FU更容易转化为核酸。
AraC还称作阿糖胞嘧啶，1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶，阿糖胞苷，胞嘧啶-β-D-阿糖呋喃糖苷及β-胞嘧啶阿糖苷，尽管它存在一些较大的缺点(见下)，仍是广泛应用的抗癌药物。目前，AraC被用于治疗骨髓性及淋巴细胞性白血病和非何杰金(Hodgkin′s)淋巴瘤。单独使用时它对急性白血病可产生20-40％的缓解，与其他化学治疗剂混合使用时，它已产生大于50％的缓解(Calabresi等人，“In The PharmacologicalBasis of Therapeutics”,Eds.Gilman,A.G.等，New York MacmillianPublishing Company(1985):1272)。
AraC作为治癌药物的缺点之一是其通过脱氨酶的快速分解代谢。人的肝脏含有高含量的脱氧胞苷脱氨酶，它可将AraC转化为一种惰性代谢产物Ara-尿嘧啶。在肠胃外给药后这种快速分解代谢导致在人体中的t1/2为3-9分钟(Baguley等人，Cancer Chemotherapy Reports55(1971):291-298)。为解决这一问题，由于只有进行DNA合成的细胞对药效是敏感的，因此，必须保持毒性浓度直至所有的非同步生长的肿瘤细胞均通过S-期。不幸的是，这意味AraC的最佳给药时间表包括了每5天经许多小时进行缓慢的静脉内输注，因此便需要住院。延长的使用带来的主要问题是在快速分配给正常细胞过程中的总毒性，这导致骨髓抑制、感染和出血。使用该药物遇到的另一问题是由细胞最终产生的对AraC的抵抗力，可能是由于因低激酶活性所致的细胞选择性，或是由于脱氧CTP扩大的淤血所致。
已经合成了AraC的前体药衍生物，其目的在于1)保护AraC免受通过胞苷脱氨酶的快速降解；2)起到AraC的分子储存作用从而简化给药时间表；3)作为在血清蛋白上输送的载体分子，并促进细胞吸收；或4)克服由低激酶活性所导致的细胞的抵抗力。现已发现在阿拉伯糖的5′位或胞嘧啶核苷环的N4上取代的AraC衍生物对胞苷脱氨酶具有抵抗力，AraC的亲脂性5′-酯衍生物(Neil等人，Biochem,Pharm-acol.21(1971):465-475；Gish等人，J.Med.Chem.14(1971):1159-1162)和N4-酰基衍生物(Aoshima等人，Cancer Res.36(1976):2726-2732)在白血病鼠试验中已表明比AraC具有更高的抗癌活性。
如同母体药本身的约药方式那样，所有上述前体药衍生物均被系统地给药。即使不同于母体药Ara-C的系统应用，由非肿瘤特异毒性所引起的前体药的副作用也是非常相似的。这些前体药可能起到Ara-C的分子储存作用，并因此延长了药物有效性的时间。
其他抗肿瘤核苷类似物的某些前体药也是已知的。这些前体药一般为核苷类似物的酰基衍生物；在给药后酰基可以通过内源酯酶活性被除去。阿糖胞苷(Neil等人，Cancer Reserch 30(1970):1047-1054；Neil等人Biochem.pharmacol.20(1971)3295-3308；Gish等人，J.Med.Chem.14(1971):1159-1162；Aoshima等人，Cancer Research 36(1976):2762-2732)或氟胶氧尿嘧啶核苷(Schwendener等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.126(1985)；660-666)的某些前体药提供了比服用母体药之后产生的药效期更长的活性药物。
然而，这些前体药不能向肿瘤组织选择性地释放药物；增强的毒性常常伴随着增强的抗肿瘤效能(Schwendener等人，Biochem.Biophy.Res.Comm.126(1985):660-666)。
象5-FU和Ara-C那样，其他抗肿瘤核苷类似物(包括但并不限于氟尿嘧啶阿拉伯糖苷，6-巯基嘌呤核糖苷，腺嘌呤呤阿拉伯糖苷或氟脱氧尿嘧啶核苷)或其前体药的给药剂量的大小受到毒性的限制，这就降低了若在肿瘤细胞附近达到较高浓度能够获得的潜在效能。
上述关于抗肿瘤核苷类似物的靶化前体药的建议是并不令人满意。Bagchawe等人(专利申请WO88/07378)提出用合适的酶可以将抗肿瘤核苷的相应的核苷酸再转化为核苷；Senter等人(专利申请EP88/112646)提出类似地使用被碱性磷酸酯酶活化的氟尿嘧啶核苷单磷酸酯，该碱性磷酸酯酶被结合到连在肿瘤细胞表面抗原的抗体上。这些建议都未考虑到在血液和组织中将核苷酸转化为核苷的酶(例如5′核苷酸酶)的很高且普遍存在的活性。因此，核苷酸(核苷磷酸酯)不能用靶化释放抗肿瘤核苷类似物。
b．烷基化剂氮芥烷基化剂是一类重要的抗肿瘤药物。具有临床应用价值的抗肿瘤烷基化剂的实例是环磷酰胺、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥或氮芥。这些药剂具有共同的结构特征，即在氮原子上的双-(2-氯乙基)基团，它们可以烷基化并因此破坏了核酸、蛋白质或其他重要的细胞结构。烷基化剂的细胞毒性活性较少依赖其靶细胞循环状态，而更多地取决于影响核酸合成的抗代谢物的状况。由于这个原因，烷基化剂的细胞毒性对快速细胞分裂(例如许多肿瘤)的选择性相对于正常组织来说可能会更小，但是另一方面，这种细胞毒性能够更有效地抵抗在其细胞循环中非同步的细胞群。
设计氮芥化合物的靶化前体药的上述浓度未曾成功。Bagshawe等人(专利申请WO88/078378)公开了苯甲酸氮芥谷氨酰胺用作前体药，它们的毒性比相应的活化药物只低5至10倍；这些研究人员自己指出，对于临床应用来说，前体药的毒性比母体药必须至少小100倍。
Kerr等人，(Cancer Immunol.,Immunother.31(1990)；202-206)公开了左旋苯丙氨酸氮芥-N-对羟基苯氧乙酰胺(左旋苯丙氨酸氮芥的酰胺衍生物)作为被青霉素-V-酰胺酶(PVA)活化的有效的前体药。尽管实际上这种前体药对培养基中特定细胞素毒性比左旋苯丙氨酸氮芥小100多倍但是用抗体-PVA结合物对细胞的预处理并未能增加前体药的毒性，因为PVA对前体药的苯氧乙酰胺键水解太慢以致于不能产生药物毒性含量。
c．其他抗肿瘤剂蒽环类抗生素，道诺霉素和阿霉素是广泛应用的抗肿瘤剂，它们起着许多生化作用，这些作用有助于这些药物的治疗和毒性效果。该类药物的基本机理之一是在分裂细胞过程中插入DNA并被破坏基因复制。阿霉素在治疗急性白血病和恶性淋巴瘤中是有效的。在许多实际肿瘤中它具有很大活性。与环磷酰胺和氯氨铂一起使用，阿霉素具有相当大的抗卵巢癌的活性。它已被有效地用于治疗骨原性肉瘤，转移性乳腺癌，膀胱癌，成神经细胞瘤和转移性甲状腺癌。阿霉素的心肌毒性限制了病人可能接受的这种药物的剂量。
催化蛋白质a．酶现有技术公开了使用结合到靶抗体上的非哺乳动物的酶，以便在肿瘤部位选择性地活化前体药(如羧肽酶，Bagshawe等人描述于专利申请WO88/078378；青霉素-V-酰胺酶，Kerr等人描述于CancerImmunol.Immunother 31(1990):202-6；及β-内酰胺酶，Eaton等人描述于专利申请EP90303681.2)。非哺乳动物酶一般为抗原，因此只有短期应用或也许只有一次性应用，这是由于中和抗体的形成或不良免疫应答的诱导所致。
在已经提出的哺乳动物酶如碱性磷酸酯酶(Senter等人，专利申请EP88/112646)的情况中，尚未做出预防措施以避免活化前体药的人的内源酶的问题。不同种类哺乳动物的酶由于抗原性也存在这些问题。此外，某些已提出的活化前体药的酶如神经氨酸酶(Senter等人，专利申请EP88/112646)可能会严重损害被给药的有机体；神经氨酸酶除去了蛋白(例如，红细胞膜的重要组分)上低聚糖末端上的唾液酸残基，从而露出了半乳糖残基，这标志着这种糖蛋白在肝脏中的快速降解。对于体内情况的考虑是在适用于人的具体方案中实际实施抗肿瘤剂的前体药的靶活化技术所必须的。
b．催化抗体催化抗体在底物(或抗原)上进行化学反应的方式主要由相同的理论原理来决定，这些原理描述了酶如何进行化学反应。参见美国专利4,888,281(在此引入作为参考)，它描述了抗体对化学反应的催化作用。对于发生的大多数化学变化来说，需要基本的活化能来克服反应物与产物之间存在的能垒。通过降低活化能酶催化了化学反应，活化能是在能垒顶端形成短时不稳定的化学物质(称为过渡态)所需的能量Paulung,L.,Am.Sci.36(1948):51；Jencks,W.P.,Adv.Enzymol.43(1975):219)。四个基本机理被用于酶催化作用以稳定过渡态，从而降低活化自由能。首先，通常发现一般的酸碱残基最佳地处在催化活性部位之内来参与催化作用。第二个机理包括共价的酶-底物中间体的形成。第三，模型体系已表明，在合适的反应取向中结合的反应物能够以至少七次幂的大小增加反应物的“有效浓度”(Fersht A.R.等人，Am.Chem.Soc:90(1968):5833)，因而极大地减小了化学反应的熵。最后，酶能够转化在底物结合过程中所获得的能量，以改变该反应至类似于过渡态的结构。
凭借对酶催化作用的这种认识，几种具有化活性的抗体已被免疫诱导并被分离(Powell,M.J.等人，Protein Engineering 3(1989):69-75)。将酸或碱残基诱导进入抗原结合部位的一种方法是在免疫原中使用互补的带电分子。已经证实用包含带正电的铵离子的半抗原这种方法可成功地用于抗体诱出(Shokat等人，Chem.Int.Ed.Engl.27(1988)269-271)，几种这类单克隆抗体催化了β-消除反应。
在另一方法中，抗体被诱出以便稳定类似于所需反应过渡态的大小，形态和电荷的化合物(即过渡态类似物)。参见美国专利4,792,446和美国专利4,963,355，它们描述了使用过渡态类似物使动物免疫及催化抗体的生产。这两篇专利在此引入作为参考。
通过稳定过渡态结构和/或提高反应的“有效浓度”而能够加快反应的催化抗体的实例描述如下。
1．酯酶酯水解的机理涉及带电过渡态，其静电及形状特征与磷酸酯结构极为相似。用硝基苯基磷酸酯半抗原-蛋白结合物使鼠免疫，导致分离出在甲基-对-硝基苯基碳酸酯上具有水解活性的单克隆抗体(Jacobs等人,J.Am.Che,.Soc.109(1987)；2174-2176)。抗类似的过渡态类似物的抗体在有机基质中能水解其酯底物(Durfor等人，J.Am.Chem.Soc.110(1988):8713-8714)。已有报导，通过用双甲基吡啶磷酸酯免疫而产生的抗体极大地提高了催化速度(Tramontano等人，J.Am.Chem.Soc.110(1988):2282)。该抗体水解4-乙酰氨基苯酯的速度常数为20S-1Kcat，它比未催化的酯分解的速度常数快6百万倍。最近报导了通过相对于磷酸酯而产生的单克隆抗体，使含有与L-苯丙氨酸相对的D-苯丙酸的烷基酯的立体特异性裂解，这使人们更加相信可以使用磷酸酯来诱出催化酯酶单克隆抗体(Pollack等人，J.Am.Chem.Soc 111(1989):5961-5962。
2．肽酶/酰胺酶已经描述了设计过渡态类似物几种方法，以模拟肽酶或酰胺酶的过渡态。一篇报告讨论了使用芳基膦酰胺化物过渡态类似物，以产生能够裂解芳基羧酰胺的抗体(Janda等人，Science 241(1988):1188-1191)。另一个产生肽酶的方案是使用连接肽的金属配合物辅助因子(Icerson等人，Science 243(1989):1184-1188)尽管使用这种方法不能预测断裂的位置，但进一步的研究可考虑到位置取向的断裂。已经发现人体中天然存在着蛋白分解酶抗体(Paul等人，Scimce 244(1989):1158-1162)。这种抗体最初是在哮喘病人群体中发现的。一种抗血清制剂在一个特定的断裂位置裂解了28个氨基酸的多肽，即作用于血管的肠肽(VIP)。
3．其他催化抗体单克隆抗体催化的其他反应有克莱森重排作用(Jackson等人J.Am.Chem.Soc.110(1988):4841-4842；Hilvert等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1998)；4953-4955；Hilvert等人，J.Am.Chem.Soc.110(1988):5593-5594)，氧化还原反应(Shokat等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,27(1989):269-271)，胸腺嘧啶二聚物的光化学裂解(Cochran等人，J.Am.Chem.Soc.110(1988):7888-7890)，立体有择的酯基转移重排作用(Napper等人，Science237(1987):1041-1043)和双分子酰胺的合成(Benkoric等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988):5335-5358；Janda等人，Science 241(1988):1188-1191)。
本发明的目的是提供细胞毒性化学治疗剂的新的前体药。
本发明的目的是提供在肿瘤上或在肿瘤附近局部形式或释放细胞毒性化学治疗剂的方法。
本发明的目的是提供具有高的药/前体药细胞毒性比的前体药，所说前体药对内源哺乳动物酶基本是稳定的，并且被本发明的靶化催化蛋白质活化。
本发明的目的是提供在肿瘤上或在肿瘤附近局部形成或释放细胞毒性化学治疗剂以克服下列问题的方法1)对正常组织的毒性和2)由于在非肿瘤部位药物的使用或失活而抗肿瘤功效降低。
本发明的目的是提供活性烷基化物选择性地以肿瘤细胞为靶的方法。
本发明的目的是使用肿瘤特异性结构抗体及前体药活化作用，通过前体药的特定肿瘤部位活化作用来降低系统的药物毒性。
本发明的目的是提供对哺乳动物酶稳定的前体药，该前体药确保在靶肿瘤细胞以外为最小的药物活性或最低程度的降解。
本发明的这些及其他目的是通过前体药化合物和半抗原来实现的，所述半抗原被用来产生能够从前体药裂蟹保护基的抗体。在前体药化合物中，保护基使该化合物具有稳定性，即本发明化合物在服用后能够抵抗转化为活性药，并且相对于该药来说大大降低了前体药的毒性，至少降低100倍。
本发明的半抗原通过体外方法接着通过对半抗原为特异性的抗体的蛋白工程能够产生催化抗体，例如通过随机的或位置取向的诱变，或通过在小鼠或其他宿主中诱发免疫应答。如此产生的抗体能够通过酯酶、酰胺酶、水解酶或糖苷酶的活性作用而从该药裂解保护基。
在本发明的优选方案中，确定的前体药化合物满足所需稳定性和毒性特征，确定的半抗原与相同通式的前体药化合物具有结构相似性，并且能够产生由该化合物残基催化裂解该药的抗体。
本发明的一个具体方案包括治疗特异细胞群的免疫结合物，包括(a)能够结合到特异性细胞群的抗原决定部位上的部分，和(b)能够活化前体药的催化抗体部分。
新的免疫结合物包括活化本发明的前体药或现有技术前体药的催化抗体部分。
对于免疫结合物本文所用的术语部分是指整个抗体、酶或靶蛋白，或它们的活性碎片。
本发明还包括治疗组合物，包括(a)本发明的新前体药，和(b)免疫结合物，包括(ⅰ)能够结合到特异性细胞群的抗原决定部位上的部分，和(ⅱ)能够活化所述本发明的新前体药的催化抗体部分或酶部分。
本发明还包括治疗组合物，包括(a)现有技术的前体药，和(b)免疫结合物，含有(ⅰ)能够结合到特异性细胞群的抗原决定部位上的部分，和(ⅱ)能够活化所述现有技术的前体药的催化抗体部分。
本发明还包括向特异细胞群如肿瘤释放药物来治疗各种疾病的方法。结合了本发明的催化抗体或其片段的靶化合物如抗体被服用并使其集中的细胞群处。然后，服用前体药并在细胞群处裂解(即活化)以便释放药物。因此，本发明包括治疗特异性细胞群(如癌)的疾病的方法，包括下列步骤(a)服用免疫结合物，它含有(ⅰ)能够结合到特异性细胞群的抗原决定部位上的部分，和(ⅱ)能够活化本发明的新前体药的催化抗体部分或酶部分；(b)使所述免疫结合物集中在所述细胞群处；和(c)服用本发明的新前体药，它被所述免疫结合物活化。
本发明还包括治疗特异细胞群(如癌)的疾病的方法，包括下列步骤(a)服用免疫结合物，它含有(ⅰ)能够结合到特异性细胞群的抗原决定部位上的部分，和(ⅱ)能够活化现有技术前体药的催化抗体部分；(b)使所述免疫结合物集中在所述细胞群处；和(c)服用现有技术的前体药，它被所述免疫结合物活化。
本发明的另一个具体方案是鉴定能够活化所研究的前体药的肮体的方法，包括下列步骤(ⅰ)用半抗原使宿主免疫，此半抗原被选择用来诱出能使所研究的前体药活化并且也能使抗生素失活的抗体；(ⅱ)分离为所述抗体编码的重组体基因；(ⅲ)将为所述抗体编码的基因插入细菌中；(ⅳ)在含有抗菌素的培养基中培养所述细菌；(ⅴ)选择存活的那些细菌；(ⅵ)由存活的细菌中分离出抗体基因；(ⅶ)表达产生足够量的抗体基因，以表征该抗体的特性；及(ⅷ)筛选能够活化所研究的前体药的抗体。
本发明的另一个具体方案是鉴定能够活化所研究的前体药的抗体的方法，包括下列步骤(ⅰ)用半抗原使宿主免疫，此半抗原被选择用来诱出能活化所研究的前体药的抗体；(ⅱ)分离为所述抗体编码的重组体基因；(ⅲ)将为所述抗体编码的基因插入细菌中；(ⅳ)在含有胸苷的培养基中培养所述细菌；此胸苷是由与所述研究的前体药相同的前体而衍生的；(ⅴ)选择存活的那些细菌；(ⅵ)由存活的细菌中分离出抗体基因；(ⅶ)表达产生足够量的抗体基因，以表征该抗体的特性；及(ⅷ)筛选能够活化所研究的前体药的抗体。
本发明的另一具体方案是筛选能够催化底物向产物转化的抗体的方法，包括下列步骤(ⅰ)产生抗半原的抗体，(ⅱ)使所述抗体免疫，(ⅲ)将底物加入所述抗体中，及(ⅳ)鉴定能够催化底物向产物转化的抗体，在步骤(ⅰ)之后，是任意选择结合所述半抗原的抗体的步骤。
本发明的另一具体方案是对表达能催化反应的抗体的细胞的筛选方法，包括下列步骤(ⅰ)在含有所述化合物前体的培养基中平板培养对化合物为营养缺陷的并含抗体基因的细胞；及(ⅱ)选择那些存活的细胞，它们表达能活化释放所述化合物前体的抗体。
本发明的另一具体方案是对表达能活化前体药的抗体的细胞的筛选方法，包括下列步骤(ⅰ)在含有前体药的培养基中，平板培养含有抗体基因的胸苷依赖细胞，其中所述药为胸苷；及
(ⅱ)选择那些存活的细胞，它们表达能活化所述前体药以形成胸苷的抗体。
本发明的另一具体方案是对表达能催化反应的抗体的细胞的筛选方法，包括下列步骤(ⅰ)在含有毒素的培养基中平板培养含有抗体基因的细胞；和(ⅱ)选择那些存活的细胞，它们表达了能使所述毒素失活的抗体。
本发明的另一具体方案是对表达能活化前体药的抗体的细胞的筛选方法，包括下列步骤(ⅰ)在含有抗生素的培养基中平板培养含有抗体基因的细菌细胞；和(ⅱ)选择那些存活的细菌细胞，它们表达了能使所述抗生素失活的抗体。
本发明的另一具体方案是合成双特异性抗体的方法，包括下列步骤(ⅰ)表达具有选自下列序列的基因VH抗体1-S-VL抗体1-S-VL抗体2-S-VH抗体2；VH抗体1-S-VL抗体1-S-VH抗体2-S-VL抗体2；VH抗体1-S-VH抗体1-S-VL抗体2-S-VH抗体2；VH抗体1-S-VH抗体1-S-VH抗体2-S-VL抗体2；其中-S-为连接体序列；并(ⅱ)分离所述双特异性抗体。
抗体1是能够结合到特异细胞的抗原决定部位的抗体，抗体2是催化抗体，反之亦然。
本发明的另一具体方案是合成双特异性抗体的方法，包括下列步骤(ⅰ)表达具有下面序列的基因VL抗体1-S-VH抗体2，(ⅱ)表达具有下面序列的基因
VH抗体1-S-VL抗体2，(ⅲ)将步骤(ⅰ)和(ⅱ)的产物结合，(ⅳ)分离所述双特异性抗体，其中-S-为连接体序列。
本发明的另一具体方案是合成双特异性抗体的方法，包括下列步骤(ⅰ)表达具有下面序列的基因VL抗体2-S-VH抗体1，(ⅱ)表达具有下面序列的基因VH抗体2-S-VL抗体1，(ⅲ)将步骤(ⅰ)和(ⅱ)的产物结合，(ⅳ)分离所述双特异性抗体，其中-S-为连接体序列。


图1a表示线性三甲基苯甲酰基和三甲氧基苯甲酰基-5-氟尿苷前体药，即化合物1a和1b的制备。
图1b表示实施例1a中前体药的半抗原，三甲氧基苯甲酸酯-5-氟尿苷线性膦酸酯，即化合物4的制备。
图1c表示前体药5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷，即化合物1c的制备。
图1d表示实施例1a中前体药的半抗原，三甲氧基苯甲酸酯-5-氟尿苷线性膦酸酯，即化合物4a的制备。
图2a表示前体药，分子内的三甲氧基苯甲酸酯-5-氟尿苷，即化合物10的制备。
图2b表示实施例2a和前体药的半抗原，三甲氧基苯甲酸酯-5-氟尿苷环膦酸酯，即化合物15的制备。
图3表示试验的前体药半乳糖胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，即化合物19的制备。
图4表示试验的前体药，半乳糖5-氟尿苷，即化合物24的制备。
图5a表示实施例3和4中前体药的半抗原的前体，即化合物25的制备。
图5b表示实施例3和4中前体药的半抗原化合物30a和30b的制备。
图5c表示实施例3和4中前体药的半抗原化合物30a和30b的另一制备方法。
图6表示试验的前体药，脂族二乙基缩醛保护的醛磷酰胺即化合物38的制备。
图7表示试验的前体药的脒基半抗原，脂族二乙基缩醛保护的醛磷酰胺，即化合物43的制备。
图8a表示为合成分子内烯醇三甲氧基苯甲酸酯磷酰胺前体药，酸酐中间体化合物45的制备。
图8b表示前体药，分子内烯醇三甲氧基苯甲酸磷酰胺，即化合物50的制备。
图8c表示分子内烯醇三甲氧基苯甲酸酯磷酰胺半抗原即化合物57的制备。
图9表示AraC和半乳糖-AraC前体药对于Colo细胞的比较。
图10表示AraC和半乳糖-AraC前体药对于Lovo细胞的比较。
图11表示半乳糖-AraC前体药对于CEA抗原阳性细胞的位置特异性活化。
图12表示半乳糖-AraC前体药对CEA抗原阳性细胞的活性。
图13表示白细胞对药和前体药的反应。
图14表示分节中性白细胞对药和前体药的反应。
图15表示血小板对药和前体药的反应。
图16表示淋巴细胞对药和前体药的反应。
图17表示红细胞对药和前体药的反应。
图18表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对于CEA抗原阴性Colo细胞的比较。
图19表示5′-氟尿苷前体药对于CEA抗原阳性Lovo细胞的位置特异性活化。
图20表示5′-氟尿苷前体药对于CEA抗原阴性Colo细胞的活性。
图21表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对鼠中总的白细胞的比较。
图22表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对鼠中总的红细胞的比较。
图23表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对鼠中总的中性白细胞的比较。
图24表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对鼠中总的淋巴细胞的比较。
图25表示5′-氟尿苷和半乳糖基-5′-氟尿苷前体药对鼠中总的骨髓细胞构成的比较。
图26表示实施例16和20中前体药的中间体以及实施例18和22中前体药的半抗原，噻唑基亚胺基乙酸酯，即化合物60的制备。
图27表示前体药5-氟尿苷取代的β-内酰胺即化合物68的制备。
图28表示实施例16中前体药的半抗原的中间体，5-炔基化尿苷即化合物74的制备。
图29表示β-内酰胺前体药的半抗原的中间体化合物79的制备。
图30表示实施例16中的前体药的半抗原，环丁醇取代的5-氟尿苷即化合物81的制备。
图31表示实施例20中前体药的中间体，5-氟尿苷5′-O-芳基酯即化合物85的制备。
图32表示前体药，被5′-O-芳酰基-5-氟尿苷取代β-内酰胺即化合物90的制备。
图33表示实施例22中半抗原的中间体，5-炔基化尿苷5′-O-芳基酯即化合物92的制备。
图34表示实施例20中前体药的半抗原，被5′-O-芳酰基尿苷取代的环丁醇即化合物100的制备。
图35表示阿霉素前体药芳酰基酰胺即化合物103的制备。
图36表示在实施例23中阿霉素前体药的半抗原，阿霉素的芳酰基酰胺的磷酸酯即化合物104的制备。
图37表示在实施例23中前体药的半抗原，阿霉素的芳酰基磺酰胺即化合物106的制备。
图38表示左旋苯丙氨酸氮芥芳酰基酰胺前体药即化合物109的制备。
图39在实施例25中前体药的半抗原，左旋苯丙氨酸氮芥芳酰基酰胺的磺酰胺即化合物110的制备。
图40表示前体药四(2-氯乙基)醛磷酰胺二乙基缩醛即化合物112的制备。
图41表示在实施例31中前体药的半抗原，四(2-氯乙基)醛磷酰胺二乙基缩醛的三乙基铵盐类似物即化合物119的制备。
图42表示在实施例31中前体药的半抗原，四(2-氯乙基)醛磷酰胺二乙基缩醛的二丙基甲基铵盐类似物即化合物121的制备。
图43表示前体药分子内双(2-羟基乙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷即化合物128的制备。
图44表示在实施例34中前体药的半抗原，双(2-羟基乙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷的环膦酸酯类似物即化合物137的制备。
图45表示前体药分子内双(3-羟基丙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷即化合物138的制备。
图46表示在实施例36中前体药的半抗原，双(3-羟基丙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷的环膦酸酯类似物即化合物139的制备。
图47表示前体药5′-O-(2,4,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷即化合物141的制备。
图48a表示在实施例38中前体药的半抗原，尿苷的吡啶鎓醇取代的类似物即化合物147的制备。
图48b表示在实施例38中前体药的半抗原，尿苷的吡啶鎓醇取代的类似物即化合物149的制备。
图49表示在实施例38中前体药的半抗原，5′-O-(2,4,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷的线性膦酸酯即化合物152的制备。
图50表示在实施例1a中前体药的半抗原，5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷的线性膦酸酯即化合物155的制备。
通过阅读下面详细的描述将会更清楚和充分地理解本发明及其目的、特征和优点，这些描述是关于说明以下实施例中所讨论的实验结果的伴随特征的。
本发明提供了转化各种癌症化疗药物为基本无毒的前体药的具体方法，这些前体药对内源酶是稳定的，但是在肿瘤中或其附近能被下列物质活化，所述物质是先服用的肿瘤选择剂如结合受体配体，结合到连有酶的肿瘤上的类似物，及结合到或按另一种方式物理上连接到蛋白催化剂上的抗体，此蛋白催化剂可将前体药转化为活性细胞毒性剂。催化蛋白质是1)催化抗体，2)外源(或非哺乳动物的)酶，或3)内源(或哺乳动物的)酶，此内源酶在给药后前体药已通过的部分具有很低的内生活性。这种系统使相对高浓度的活性剂集中在肿瘤部位形成，而减小了系统暴露给药物的程度。
本发明提供了具有高的药/前体药细胞毒性比的前体药，它们对内源哺乳动物酶基本上是稳定的，并且被本发明的靶化蛋白质活化。
本发明提供了抗肿瘤核苷类似物的合适的前体药化合物和其制备方法，这些前体药在被本发明的催化蛋白活化之前在体内基本上是无毒性的。
在设计用于靶活化的细胞毒性剂的前体药过程中，重要的是前体药取代基应赋予药物两个性质(1)在给药后前体药是相对稳定的，因此，它们是相对无毒性的；(2)它们是特异性活化的。此外，在被催化蛋白裂解后，前体药取代基对有机体不应是有毒性的。
在本发明中，抗肿瘤剂的前体药是通过将下面描述的合适的取代基连到抗肿瘤药上来制备的。所选择的取代基应使母体药相对地无毒性，而且这些取代基相对地可以抵抗被内源酶活性作用而除去，但却能被本发明的催化蛋白质除去(产生活性药)。
在前体药和前体药半抗原上的优选的取代基是H、具体1-10个碳原子的烷基、具1-10个原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10碳原子的烯烃、羟基、羟基烷基、羟基烷氧基、氨基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵、环烷基、取代的环烷基、或在环中被至少一个杂原子取代的环烷基。
在前体药和前体药半抗原上的取代基包括烷基、链烯基、炔基、取代的烷基、链烯基和炔基、羟基烷基、羟基烷氧基、氨基烷基、硫代烷基、烷基氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵、环烷基、取代的环烷基、及在环中被至少一个杂原子取代的环烷基，在上述取代基中优选在碳链或环中具有1-10个碳原子的取代基。
其中在前体药和前体药半抗原上的取代基可被取代，优选的取代基为OH、烷基、氯、氟、溴、碘、-SO3、芳基、-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、链烯基、炔基、-CO-、-N2+、氰基、环氧化物和杂环基。
在前体药和前体药半抗原中优选的杂原子是磷、硫、氮和氧。在前体药和前体药半抗原上含有杂原子的取代基优选含有一个或多个杂原子。
在前体药和前体药半抗原中带正电的季铵类的优选的抗衡离子(阴离子)为卤素、乙酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐和三氟甲磺酸盐。
催化蛋白质特别是催化抗体能最容易地催化有较低的活化能的反应。已知受抗体催化或加速的反应包括酯裂解、克莱森重排作用、氧化还原反应、立体有择酯基转移重排反应、和酰胺或肽裂解。
催化抗体以及酶是通过降低形成短期不稳定过渡态所需的活化能来催化化学反应。能稳定或促进过渡态形成的催化抗体是通过形成可稳定前体药类似物的抗体而产生的，这种前体药类似物与取代基裂解反应的过渡态具有相似的大小、形状和电荷。例如，酯裂解反应的过渡态类似物(半抗原)是通过以稳定的膦酸酯或磺酸酯基取代通常的羰基来制备的。
过渡态类似物一般用作半抗原，以诱出对本发明前体药具有催化活性的抗体。因此，它们的结构通常包括连接载体蛋白质的连接臂。这样，在前体药中对应于药的半抗原部分一般为原药的类似物，不同的在于存在共价连接的连接臂，它终止在可被连到蛋白质上的基团中。在本发明的一些具体方案中，连接臂被连接到对应于前体药的前体药取代物的半抗原部分(核苷类似物酯前体药的取代苯甲酸酯部分)。
在一些过渡类似物中，半抗原中的类药部分也可以被任意地改变，以便达到与前体药活性反应过渡态的结构相似性。例如，在具有羟基并通过羟基将该药连接到其前体药部分的药物中，连接的氧(通常为药物分子的部分)在相应的半抗原中被-NH-、-CH2-或-S-取代。
此外，在半抗原中的类药部分也可以被任意地改变，以便得到其刚性结构的构象，从而有利于诱出对相应的前体药具有化活性的抗体，然而，在大多数情况中，对应于前体药的药部分的过渡态类似物部分与原药具有极大的结构相似性。下面给出了由其相应的前体药的药部分的类似物制备半抗原的实例。
在半抗原中优选的类药部分是在5-位被含有-C-C(CH2)nNHCBz或(CH2)nNH2的部分取代的5-氟尿苷类似物，基保n为1至10的整数，CBz是苄氧羰基。
在半抗原中另一种优选的类药部分是磷胺芥子类似物([R′OP(O)(R″)N(CH2CH2CL)2])，其中R′和R″相同或不同，并且彼此独立地代表H、具有1-10个碳原子的烷基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟基烷基、羟基烷氧基、氨基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵、环烷基、取代的环烷基、或在环中被至少一个杂原子取代的环烷基。优选的实施方案是在半抗原的类药部分中，R′烷基铵盐，R″为取代的环烷基，其中环烷基在环中被两个杂原子取代。
相当多的酯酶活性普遍存在于哺乳动物组织中。这种活性相对地是非特异性的，它可裂解各种化合物中的酯键。然而，某些类本发明的前体药如核苷类似物的取代芳族酯具有的酯取代基相对地能抵抗内源哺乳动物的酯酶活性。
本发明的类似的取代芳族酯基和其他前体药取基可用于制备具有合适官能基的各种抗肿瘤剂的前体药，包括但不限于核苷类似物和其他抗代谢物，烷基化剂如环磷酰胺衍生物，插入剂如阿霉素或表鬼臼毒吡喃葡糖苷，梭毒如长春花生物碱，或其他种类的细胞毒性药。
本发明的前体药相对地能抵抗被内源哺乳动物酶的活化，该前体药被本发明的催化蛋白质如催化抗体(或其活性碎片)活化，这种催化抗体是通过产生对前体药活化反应的过渡态类似物的抗体而制备的。
本发明的催化蛋白被结合到或按另一种方式物理地连接到肿瘤选择性抗体、抗体碎片、或结合蛋白质或连接蛋白质的类似物、或肿瘤选择性受体配体上。该复合物通常在前体药之前给药，以便使其集中在癌细胞中或附近。然后前体药被使用并被催化蛋白质裂解。在肿瘤中或附近产生活性抗肿瘤药。
下面描述了本发明的各种前体药以及对应于这些前体药的过渡态类似物。此外还描述了能用于产生抗体的半抗原、所产生的抗体能从前体药中裂解保护基。
下面描述了本发明的各种前体药以及对应于这些前体药的过渡态类似物。此外还描述了能用于产生抗体的半抗原。所产生的抗体能从前体药中裂解保护基。
本发明的新的前体药和半抗原各类前体药取代基和前体药活化反应在多类催化抗体参与的水解反应中，有几类特定的催化抗体参与的催化反应，它们最适合用于合适的前体药以便进行前体药的活化。
A．酯酶-裂解酯化药物的酰基取代基；
B．酰胺酶-裂解连在氨基上的酰基取代基；C．缩醛水解酶-水解缩醛(或原酸酯)成为醛(或酸)；D．糖苷酶-裂解通过糖苷键连在药物上的糖取代基。
具有这些类型活性的催化抗体通常是通过用模拟前体药活化反应过渡态的半抗原使动物免疫来诱出的。对哺乳动物的酶活性相对稳定的前体药取代基被设计并用于形成过渡态类似物，这种过渡态类似物本身又被用于产生能活化前体药的催化抗体。在能活化本发明前体药的酶存在的情况下，作为得到催化抗体的另一种方式，这些酶被任意地用于此目的。
前体药本身也被任意地用于诱出具有催化活性的抗体。相反地，前体药的过渡态类似物也可任意地用作前体药或药。然而，通常称作前体药的化合物即被用作前体药，下面称作过渡类似物的化合物被用作诱出催化抗体的半抗原。
对哺乳动物的酶活性相对稳定并被上述抗体催化反应活化的前体药取代基包括下列物质A．通过酯酶反应进行前体药活化。
苯甲酸酯或乙酸酯部分上取代基的空间位阻抑制了它们被内源酯酶的活性作用所裂解(见实施例27)。其实例如下1．取代的芳族酯，如取代的苯甲酸酯；2．通过对酯羰基的分子内的亲核进攻而活化的取代的芳族酯；3．二或三取代乙酸酯；及4．通过对酯羰基的分子内的亲核进攻而活化的二或三取代乙酸酯。
对哺乳动物的酶活性相对稳定并被催化抗体裂解的其他酯取代基均在本发明范围之内。
酯水解反应的过渡态类似物一般具有膦酸酯或磺酸酯基以取代原来的羰基，详细叙述如下。
B．通过酰胺酶反应进行前体药活化通常，酰胺特别是下面所列出的酰胺对哺乳动物的酶活性是相对稳定的。
1．芳族或取代的芳族酰胺，如苯甲酸酯或取代的苯甲酸酯酰胺；2．通过对酰胺羰基的分子内亲核进攻而活化的芳族或取代的芳族酰胺；3．甲酰胺类；4．乙酰胺类；5．通过对酰胺羰基的分子内亲核进攻而活化的乙酰胺类；及6．单内酰胺水解物。
酰胺水解反应的过渡态类似物一般具有膦酸酯或磺酸酯基以取代原来的羰基，详细叙述如下。
C．通过缩醛水解反应进行前体药活化抗肿瘤剂的缩醛前体药是稳定的并且是相对无毒性的(参见实施例29)。其实例如下1．二烷基缩醛；2．原酸酯；3．二醇缩醛，如糖取代的缩醛；及4．二醇原酸酯。
缩醛水解反应的过渡态类似物一般具有脒或胍基以取代原前体药中的缩醛基。
D．通过糖苷酶反应进行前体药活化本发明的糖基衍生物是稳定的并且是相对无毒性的(参见实施例28)。其实例如下1．通过糖的异头位置结合到药物羟基上的六吡喃糖；2．通过糖的异头位结合到药物羟基上的呋喃糖；糖苷酶反应的过渡类似物一般具有氨基以取代糖的异头氧和环氧原子。
在本发明中利用及得到的抗肿瘤剂含有羟基或伯氨基；因此，在下面化合物说明中以XQH表示抗肿瘤药物，其中Q为-O-或-NH-，在化合物说明中所用的X为原药的脱羟基或脱氨基基团。在过渡态类似物中对应于该药基团X的部分以X1表示。如上所述，X1通常是药X的类似物，不过X1也可以与药基团X相同。X1的优选特征是它必须具有与药基团X足够的结构相似性，以使过渡态类似物能够诱出对前体药XQH具有催化活性的抗体。由于催化作用的优选位置实际上在前体药取代基内或在取代基与药之间的连接处，因此X1的结构上有一定的范围。然而，通常X1非常相似于X，不同的在于X1包含连接过渡态类似物到载体蛋白质如牛血清蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)上的连接臂，这些载体蛋白质用来使动物免疫从而诱出具有催化活性的过渡态类似物的抗体。
酯酶催化作用被酯酶催化作用活化的本发明的新化合物包括下面给出的通式化合物。
A．通过酯酶反应进行前体药活化1．取代的芳族酯，例如取代苯甲酸酯取代芳族酯前体药本发明包括具有下面通式的取代芳族酯化合物A1a
其中X是药XOH的基团，优选XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤的核苷类似物(连到醛糖环的3′和/或5′位羧基部分)，阿霉素，或烯醇式醛膦酰胺；R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，它们为H，具有1-10个原子的烷基，具有1-10个碳原子的烷氧基，单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，或烷基铵，其条件是至少R1至R5之一不是H，优选R1或R5不是H；该化合物不是Ara-C-2,4,6-三甲基苯甲酸酯，Ara-C3,4,5-三甲氧基苯甲酸酯或Ara-C-2,6-二甲基苯甲酸酯。然而，Ara-C-2,4,6-三甲基苯甲酸酯，Ara-C-3,4,5-三甲氧基苯甲酸酯或Ara-C-2,6-二甲基苯甲酸酯可用于使用本发明的催化抗体的治疗方法中。
半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物A1b
其中X′是化合物A1a的X的类似物，X′被任意地连接到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D是P(O)OH、SO2、CHOH或SO(具有任意立体化学)，若D为CHOH，那么B为CH2，R1′、R2′、R3′、R4′和R5′相同或不同，它们被任意地连接到载体蛋白质上，并且为H、具有1-10个碳原子的烷基。具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、烷膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、或烷基铵、条件是至少R1′至R5′之一不是H。优选R1′或R5′不是H。
半抗原2本发明包括具有下面通式的取代芳基化合物Ala′其中X是药XOH的基团。XOH优选为细胞毒性药，如抗肿瘤的核苷类似物(连到醛糖环的3′和/或5′位)阿霉素，或烯醇式醛膦酰胺Z为C或N；B为O,S,NH或CH2；D为HOP(O),SO2,CHOH或SO(具有任意立体化学)；R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，它们为H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子的烷氧基，单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，羟基烷氧基，卤代烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，或烷基铵，其条件是至少R1至R5之一不是H，优选R1或R5不是H。
2．通过对酯羰基的分子内亲核进攻而活化的取代的芳族酯取代的芳族酯前体药本发明包括具有下面通式取代的芳族酯化合物A2a
其中X是XOH的基团，优选XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤的核苷类似物(连到醛糖环的3′和/或5′位的羧基部分)，阿霉素，或烯醇式醛膦酰胺。
R6、R7、R8和R9可以相同或不同，它们为H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子有烷氧基，单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，或烷基铵，优选至少R6-9之一不是H。
J是具有1-9个原子线性构型的烷基，具有一个或多个杂原子的1-9个原子线构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基、或者杂原子的烷基取代基。
Y是OH、NH2、NHR或SH，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基、-SH、-(CO)H、(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧化物基和杂原子。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物A2b
其中X′是化合物A2a的X的类似物，X′被任意地连接到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D′是P(O)、COH(具有任意立体化学)，若D为COH，那么B和Y′为CH2，Y′是O、NH、NR、S或CH2，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、-SO3、芳基、-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧化物基及杂原子，R6′、R7′、R8′和R9′相同或不同，它们被任意地连接到载体蛋白质上，并且为H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子有烷氧基，单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，或烷基铵，优选至少R6′至R9′之一不是H；J是具有1-9个原子线性构型的烷基，具有一个或多个杂原子的1-9个原子线构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基、或者杂原子的烷基取代基。
3．二或三取代乙酸酯二或三取代乙酸酯前体药本发明包括具有下面通式的二或三取代乙酸酯化合物A3a
其中X是XOH的基团，优选XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤的核苷类似物(连到醛糖环的3′和/或5′位的羧基部分)，阿霉素，或烯醇式醛膦酰胺；R10、R11和R12可以相同或不同，但它们之中至少两个不是H，并且它们是H或具有2至22个碳原子的烷基，具有一个或多个杂原子的烷基，环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵或烯烃；该化合物不是Ara-C-二乙基乙酸酯。然而，Ara-C-二乙基乙酸酯可用于使用本发明的催化抗体的治疗方法。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物A3b
其中X′是A3a的X的类似物，X′可被任意连接到载体蛋白质上，B是O,S,NH或CH2，D是P(O)OH、SO2、CHOH或SO(具有任意的立体化学)，若D为CHOH，那么B为CH2，R10′-12′可被任意连接到载体蛋白质上，它们可以相同或不同，但其中至少两个不是H，它们是H或具有2至22个碳原子的烷基，具有一个或多个杂原子的烷基，环烷基二醇，单环芳基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃。
4．通过对酯羰基的分子内亲核进攻而活化的二或三取代乙酸酯二或三取代乙酸酯前体药本发明包括具有下面通式的取代乙酸酯化合物A4a
其中X是XOH的基团，优选XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤的核苷类似物，阿霉素，或烯醇式醛膦酰胺。
J是具有1-9原子线性构型的烷基，具有一个或多个杂原子的1-9个原子线性构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基或有一个或多个杂原子的烷基取代基，Y是OH、NH2、NHR或SH，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基、-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧化物基及一个或多个杂原子。
R13-14可以相同或不同，但不能均为H，它们是H或具有2至22个碳原子的烷基，具有一个或多个杂原子的烷基，环烷基二醇，单环芳基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物A4b
其中X′是化合物A4a的类似物，X′被任意地连到载体蛋白质上，B是O,S,NH或CH2，D′是P(O)、COH(具有任意的立体化学)，若D′为COH，那么B和Y′为CH2，Y′是OH、NH、NR、S或CH2，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基、炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基，-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧化物基及一个或多个杂原子。
J是具有1-9原子线性构型的烷基，具有一个或多个杂原子的1-9个原子线性构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基或有一个或多个杂原子的烷基取代基，R13′-14′被任意地连到载体蛋白质上，它们可以相同或不同，但其中至少一个不是H，它们是H或具有2至22个碳原子的烷基、具有杂原子的烷基、环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵或烯烃。
酰胺酶催化作用被类酰胺酶催化作用活化的本发明的新化合物包括下列通式化合物B．通过酰胺酶反应进行前体药活化1．芳族或取代的芳族酰胺，如苯甲酸酯或取代的苯甲酸酯酰胺芳族或取代的芳族酰胺前体药本发明包括具有下面通式的芳族酰胺B1a
其中X是药XNH2的基团，优选的XNH2为细胞毒性药，如阿霉素或左旋苯丙氨酸氮芥；R15、R16、R17、R18和R19相同或不同，它们为H，具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟基烷基、氨基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯或烷基铵。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物B1b
其中X′是化合物B1a的X的类似物，X′被任意地连到载体蛋白质上，B是O、S、NH、或CH2，D是P(O)OH,SO2,CHOH或SO(具有任意的立体化学)，若D为CHOH，那么B为CH2，R15′、R16′、R17′、R18′和R19′相同或不同，它们被任意地连到载体蛋白质上，且它们为H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯或烷基铵。
2．通过对酰胺羰基的分子内亲核进攻而活化的芳族或取代的芳族胺芳族或取代的芳族酰胺前体药本发明包括具有下面通式的芳族酰胺化合物B2a
其中X是药XNH2的基团，优选的XNH2为细胞毒性药，如阿霉素或左旋苯丙氨酸氮芥。
J是具有1-9原子线性构型的烷基，具有杂原子的1-9个原子线性构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基或杂原子的烷基取代基，Y是OH、NH2、NHR或SH，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基，-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧基及杂原子，R20、R21、R22和R23可以相同或不同，它们是H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子的烷氧基，单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯或烷基铵。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物B2b
其中X′是化合物B2a药XNH2的类似物，X′被任意地连到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D′是P(O)、COH(具有任意的立体化学)，若D′为CHOH，那么B和Y′为CH2，Y′是O、NH、NR、S或CH2，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基，-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧化物基及一个或多个杂原子。
J是具有1-9原子线性构型的烷基，具有杂原子的1-9个原子线性构型的烷基，这些烷基具有苯基、烷基或有杂原子的烷基取代基，R20′、R21′、R22′和R23′可以相同或不同，它们被任意地连到载体蛋白上，并且它们是H，具有1-10个碳原子的烷基，具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基，具有1-10个碳原子的烯烃，羟基，羟基烷基，氨基烷基，硫代烷基，氨基，烷基氨基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯或烷基铵。
3．甲酰胺类甲酰胺前体药本发明包括具有下面通式的甲酰胺化合物
其中X是药XNH2的基团。优选的XNH2为细胞毒性药，如阿霉素或美法仑。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物B3b
其中X′是化合物B3a的X的类似物，X′被任意地连到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D″是HP(O)OH、CH2OH、P(O)(OH)2或SO3H，若D″为CH2OH，那么B为CH2，4．乙酰胺类乙酰胺前体药本发明包括具有下面通式的乙酰胺化合物B4a
其中X是药XNH2的基团。优选的XNH2为细胞毒性药，如阿霉素或左旋苯丙氨酸氮芥。
R24、R25和R26相同或不同，为H，具有2至22个碳原子的烷基，具有杂原子的烷基、环烷基二醇，单环芳基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物B4b
其中X′是化合物B4a药的X的类似物，X′被任意地连到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D是P(O)OH、SO2、CHOH或SO(具有任意的立体化学)，若D为CHOH，那么B为CH2，R24′-26′被任意地连到载体蛋白质上，它们相同或不同，并为H，具有2至22个碳原子的烷基，具有杂原子的烷基，环烷基二醇，单环芳基，烷基膦酸酯，烷基磺酸酯，烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃。
5．在酰胺羰基上通过分子内亲核化学作用活化的乙酰胺乙酰胺前体药本发明包括具有下式的酰胺化合物B5a
其中X是药XNH2的基团。优选的XNH2为细胞毒性药，如阿霉素或左旋苯丙氨酸氮芥；J是线性构型的具有1-9原子的烷基，线性构型的具有1-9原子且带有杂原子的烷基，上述的烷基具有的取代基为苯基、烷基或带有杂原子的烷基。
Y是OH、NH2、NHR或SH，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自-OH、氯、氟、溴、碘、SO3、芳基，-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧基及杂原子，和R27-28为相同或不同，它们是H、具有2至22个碳原子的烷基、带有杂原子的烷基、环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵或烯烃。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下面通式的化合物B5b
其中X′是化合物B5a中X的类似物，且X′任意地连到载体蛋白质上，B是O、S、NH或CH2，D′是具有任意的立体化学构型的P(O)、COH，如果D′为COH，那么，B和Y′为CH2，Y′是O、NH、NR、S或CH2，其中R是被一个或多个取代基任意取代的烷基、链烯基或链炔基，其取代基选自-OH、氯、氟、溴、碘、-SO3、芳基，-SH、-(CO)H、-(CO)OH、酯基、醚基、-CO-、氰基、环氧基和杂原子，J是具有1-9原子的烷基，线性构型的具有1-9原子的且带有杂原子的烷基，上述的烷基具有的取代基是苯基、烷基或带有杂原子的烷基，和R27′-28′是任意连到载体蛋白质上的相同或不同的基团，它们是H、具有2至22个碳原子的烷基、带有杂原子的烷基、环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯、烷基铵或烯烃。
6．Monobactam的水解物用于产生β-内酰胺抗休的半抗原方案的概述对于诱发能够使单环β-内酰胺(“monbactam”)水解的抗体的免疫过程而言，提出方案和制备半抗原是必要的。某些提出的可能性表示在下面
不同于β-内酰胺底物的化合物1的方案在于β-内酰胺环己用环丁醇代替(致使仲醇代替β-内酰胺羰基)。醇的过渡态的类似物已被成功地提出，并且其在酶学中作为过渡态抑制剂是熟知的(Bolis,G.等人J.Med.Chem.30(1987)1729-37)，并且已被用来产生水解催化抗体(Shokat,K.M.等人，Chem.Int.Ed.Engl.29(1990):1296-1303)。
化合物2的方案包括将亚甲基加成到β-内酰胺环上，以便形成γ-内酰胺环。因为环的大小(四员环转换为五员环)不同，则对于它们各自的环而言，羰基的键角将是不同的。γ-内酰胺的羰基比β-内酰胺的羰基更伸出于该环(多于四面体)的平面(Baldwin,J.E.等人Tetrahedron42(1986):4879)。这种不同将引起β-内酰胺的底物去稳定作用，使γ-内酰胺诱发抗体，因而有助于催化作用。
非环半抗原3利用了底物的去稳定作用与过渡态补充相结合，以便诱发具有β-内酰胺酶活性的抗体，这类化合物或相似的化合物将是β-内酰胺的线性类似物，其中裂开的键用类似于过渡态的二烷基亚膦酸酯(在此表示的)，或用相似的磷基基团来代替。因此，在这种方案中，存在过渡相似物与基础态去稳定作用的相结合。
在所有的方案中，取代基的结构将取决于结合到免疫的载体蛋白质上的药(位于R″)，该载体蛋白质包括，但不限于，KLH或BSA(通过R、R′或R″)，和用于筛选突变体的抗体的结构(R和R″)。
单内酰胺前体药本发明包括具有下式的单内酰胺化合物B6a
其中R30和R31中的至少一个是OX,X为药XOH的基团，优选的是，XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤核苷类似物(β-内酰胺部分连到醛糖环的3′和/或5′位氧上)、阿霉素或醛磷酰胺的烯醇式。
不是OX的R29-30可相同或不同并且，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氨基，和R29任意是SO3或SO4H。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物B6b
其中R30′和R31′中的至少一个是化合物B6a中X的类似物，且所说的类似物任意地连到载体蛋白质上，D是具有任何立体化学构型的SO2、SO或CHOH，如果D是CHOH，那么，Z′是CH，Z′是具有任何立体化学构型的O、N或CH，当Z′是O时，那么R29′就被去掉；R29′-33′(不是所说的类似物)可相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氨基，R29′任意是SO3H或SO4H，和R29′-33′任意连到载体蛋白质上。
单内酰胺前体药本发明包括具有下式的单内酰胺化合物B6c
其中X为药XOH的基团，优选的是，XOH为细胞毒性药如抗肿瘤核苷类似物(羧基部分连到醛糖环的3′和/或5′位上)、阿霉素或醛磷酰胺的烯醇式。
R34、R35、R36和R37为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟烷基、氨烷基、硫代烷基、氨基、烷氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯，或烷基铵，n是0至3的整数，E可存在或不存在，且为氧、羰氧基或氧羰基，A是下述基团
并且R38、R39、R40或R42是连接E的位置，或者如果E不存在，它们就连到[CH2]n上，或者如果E不存在且n=0，它们就连到苯环上。
R38、R39、R40、R41和R42为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上被任意取代)的酰氨基，和R38任意是SO3H或SO4H。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物B6d
其中X′是化合物B6c中X的类似物，且任意连到载体蛋白质上。
B是O、S、NH或CH2，R34′、R35′、R36′和R37′为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟烷基、氨烷基、硫代烷基、氨基、烷氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯，或烷基铵，其条件是，R34′-37′中至少一个不是H,R34′、R35′、R36′或R37′任意连到载体蛋白质的位置，n是0至3的整数，E′可存在或不存在，且为CH2、O、羰氧基、羰亚甲基、氧羰氧基或亚甲羰基，A′是下述基团
其中D是具有任何立体化学构型的SO2、SO或CHOH，如果D是CHOH，则Z′是CH，Z′是具有任何立体化学构型的O、N或CH，当Z′是O时，那么R38′被去掉，并且R38′、R39′、R40′、R41′或R42′是连到E的位置，或者如果E不存在，它们连到(CH2)n上，或者如果E不存在且n=0，它们就连到苯环上，并且R38′、R39′、R40′、R41′或R42′为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上被任意取代)的酰氨基，和R38′任意是SO3H或SO4H。
单内酰胺的二或三取代的乙酸酯前体药包括具有下式的单内酰胺化合物B6e
X是药XOH的基团，优选的是，XOH为细胞毒性药，如抗肿瘤核苷类似物(羧基部分连到醛糖环的3′和/或5′位置上)、阿霉素或醛磷酰胺的烯醇式；n是0至4的整数；R43和R44为相同或不同，但两者不能都是H、且它们是具有2至22个碳原子的烷基、带有杂原子的烷基、环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃；E存在或不存在，且为氧、羰氧基或氧羰基；A是下述基团
其中R38、R39、R40、R41或R42是连到E的位置，或者如果E不存在，它们连到(CH2)n上，或者如果E不存在且n=0，它们就连到与R43和R44相连的碳原子上；其中R38、R39、R40、R41或R42为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氨基，和R38任意是SO3H或SO4H。
半抗原用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物B6f
其中X′是化合物B6a中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上。
B是O、S、NH或CH2，n是0至4的整数，R43′和R44′为相同或不同，但两者不能都是H、且它们是具有2至22个碳原子的烷基、带有杂原子的烷基、环烷基二醇、单环芳基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯，烷基铵或烯烃，E′存在或不存在，且为CH2、O、羰氧基、羰亚甲基，氧羰基或亚甲基羰基，A′是下述基团
其中D是具有任何立体化学构型的SO2、SO或CHOH，如果D是CHOH，则Z′是CH；Z′是具有任何立体化学构型的O、N或CH，当Z′是O时，那么R38′被去掉；R38′、R39′、R40′、R41′或R42′是连到E′的位置，或者，如果E不存在，它们连到(CH2)n上，或者，如果E′不存在且n=0，它们连到与R43′和R44′相连的碳原子上；R38′、R39′、R40′、R41′或R42′为相同或不同，它们是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的链烯基、单环芳基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的羧烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、具有1-10个碳原子的烷氨基、具有1-10个碳原子的氨烷基、具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氧基，或具有1-10个碳原子且带有或没有杂环基或苯基取代基(在杂环基或苯基上可被任意取代)的酰氨基，和R38′任意是SO3H或SO4H。
缩醛水解酶的催化作用由缩醛水解酶或原酸酯水解酶催化作用而活化的本发明的新化合物包括下述通式的化合物C．由缩醛水解酶反应进行的前体药的活化1．二烷基缩醛二烷基缩醛前体药本发明包括具有下式的烷基缩醛化合物C1a
其中X是药XQH的基团，优选的是，XQH是细胞毒性药如核苷类似物或磷酰胺芥子[HOP(O)(NH2)N(CH2CH2CL)2]、左旋苯丙氨酸氮芥或阿霉素。
其中Q是O或NH，和R45和R46为相同或不同，它们是未取代的烷基，或用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基。
该化合物不是醛磷酰胺二乙基缩醛，但醛磷酰胺二乙基缩醛可用于利用该主题发明的化抗体进行的方法中。
半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C1b
其中Q′是O、S、NH或CH2，X′是化合物C1a中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上，B′是NH或CH2，如果B′是NH，那么，Q′是CH2，和R45′和R46′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C1c
其中R45′和R46′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，或用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C1d
其中Q′是O、S、NH或CH2，其中X′是化合物C1a中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上，R45′和R46′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，或用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原4用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C1e
其中R45′和R46′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，或用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原5用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C1f
其中X′是化合物C1a中X的类似物，其中E和E′相同或不同，它们是N、C、O或S，其中R45″是H，氨羧基，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上，当连到R45″上的E是N时，优选的是E-R45″键合形成胺的部分被取代的酰胺。
2．原酸酯原酸酯前体药本发明包括具有下式的原酸酯化合物C2a
其中X是药XOH的基团，优选的是，XOH为细胞毒性药，如核苷类似物或阿霉素或醛磷酰胺的烯醇式，R47、R48和R49为相同或不同，它们是未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，和R49任选地是H。
半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C2b
其中X′是化合物C2a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是O、CH2、S或NH，和R47′和R48′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C2c
R47′、R48′和R49′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C2d
其中X′是化合物C2a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，
Q′是CH2和R47′和R48′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
半抗原4用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C2e
其中R47′和R48′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基取代的烷基，并且其任意地连到载体蛋白质上。
3．二醇缩醛，例如糖取代的缩醛二醇缩醛前体药本发明包括具有下式的二醇缩醛化合物C3a
其中X是药XQH的基团，优选XQH是细胞毒性药如核苷类似物或磷酰胺芥子[HOP(O)(NH2)N(CH2CH2CL)2]、左旋苯丙氨酸氮芥或阿霉素，Q是O或NH，和R50和R51为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。优选的是，R50和R51为顺式且相同，致使在该分子的缩醛部分中具有对称的镜平面，从而使异构体的数量达到最少。
半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3b
其中R50′和R51′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。且其任意连到载体蛋白质上。
半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3c
其中Q′是O、S、NH或CH2，X′是化合物C3a中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上，B′是NH或CH2，如果B′是NH，那么，Q是CH2，和R50′和R51′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基烯烃或单环芳基取代的烷基。且其任意连到载体蛋白质上。
半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3d
其中Q′是O、S、NH或CH2，X′是化合物C3a中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上，B′是NH或CH2，如果B′是NH，那么，Q是CH2，和R50′和R51′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。且其任意连到载体蛋白质上。
半抗原4用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3e
R50′和R51′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基，且其任意连到载体蛋白质上。
糖缩醛前体药本发明包括具有下式的二醇缩醛化合物C3f
其中X是药XQH的基团，优选的是XQH为细胞毒性药，如核苷类似物或磷酰胺芥子[HOP(O)(NH2)N(CH2CH2CL)2]、左旋苯丙氨酸氮芥或阿霉素，Q是O或NH，和G是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯、烯烃或单环芳基所取代。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤R=H,PO3H2糖缩醛半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3g
其中Q′是O、S、NH或CH2，X′是化合物C3f中X的类似物，且X′任意连到载体蛋白质上，B′是NH或CH2，如果B′是NH，那么，Q′是CH2，和G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，和其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤R=H,PO3H2糖缩醛半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3h
G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，和其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤R=H,PO3H2糖缩醛半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3i
其中Q′是O、S、NH或CH2，X′是化合物C3f中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖缩醛半抗原4用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C3j
G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H24．二醇原酸酯二醇原酸酯前体药本发明包括具有下式的二醇原酸酯化合物C4a
其中X是药XQH的基团，优选的是XQH是细胞毒性药，如核苷类似物或阿霉素或醛磷酰胺的烯醇式，R52、R53和R54为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。优选的是，R52和R53为顺式且相同，致使在该分子的缩醛部分中具有对称的镜平面，并且使异构体的数量达到最少。
二醇原酸酯半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4b
其中R52′、R53′和R54′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基，且其任意连到载体蛋白质上。
二醇原酸酯半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4c
其中X′是化合物C4a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是CH2或NH，和R52′和R53′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。且其任意连到载体蛋白质上。
二醇原酸酯半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4d
其中R52′、R53′和R54′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基，且其任意连到载体蛋白质上。
二醇原酸酯半抗原4
用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4e
其中X′是化合物C4a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是CH2，和其中R52′和R53′为相同或不同，它们是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基，且其任意连到载体蛋白质上。
糖原酸酯前体药本发明包括具有下式的二醇原酸酯化合物C4f
其中X是药XQH的基团，优选的是XQH为细胞毒性药，如核苷类似物、醛磷酰胺的烯醇式或阿霉素，G是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，和R59是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯或烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖原酸酯半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4g
其中X′是化合物C4f中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是CH2或NH，和G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖原酸酯半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4h
G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上，和R59′是H，未取代的烷基，用卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯或烷基酯或烷基酰胺、羟基、烷基铵、氨基、烯烃或单环芳基取代的烷基，且其任意连到载体蛋白质上，上述实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖原酸酯半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4i
其中X′是化合物C4f中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，
Q′是CH2，和G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖原酸酯半抗原4用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物C4
G′是二醇G(OH)2基，G(OH)2是糖、环烷二醇或邻苯基二醇，并且G′可任意地被卤素、杂原子、膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、烷基铵、烯烃或单环芳基所取代，且其任意连到载体蛋白质上。
上述的实例如下
碱=尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物R=H,PO3H2糖苷酶化作用本发明的新化合物是抗肿瘤核苷类似物(或其他抗肿瘤剂)的前体药，其包括将单糖六吡喃糖或六呋喃糖通过异头位置共价连到核苷类似物的3′或5′氧上。特别是其中所说的六吡喃糖或六呋喃糖选自葡萄糖、葡糖胺、D-奎诺吡喃糖、半乳糖、半乳糖胺、L-岩藻吡喃糖、L-鼠李吡喃糖、D-葡糖吡喃糖醛酸、D-半乳糖吡喃糖醛酸、D-甘露吡喃糖醛酸或D-碘吡喃糖醛酸的这类前体药。
用于抗肿瘤核苷类似物的糖基前体药的半抗原包括单糖六吡喃或六呋喃糖的脒类似物，其中所说的连接的核苷氧被NR1代替，而呋喃糖或吡喃糖环上的氧被NR2代替，这类半抗原包括单糖六吡喃糖或六呋喃糖的脒类似物。单糖六吡喃糖或六呋喃糖是选自葡萄糖、葡糖胺、D-奎诺吡喃糖、半乳糖、半乳糖胺、L-半乳糖吡喃醛酸、D-甘露吡喃糖醛酸或D-碘吡喃糖醛酸的结构类似物。
该类化合物包括下式的化合物
R2和R3是H或OH，但仅一个可为OH；X、X1、Y、Y1、Z、Z1、R和R1在下表中定义。
从六吡喃糖和核苷制备本发明的β-糖基化核苷的新偶合反应是在路易斯酸如TMS三氟甲基磺酸盐、BF2Et2O等的存在下，在溶剂乙腈中，过乙酰化己糖和核苷5′羟基的直接反应。这种方法可推广到下表所列出的糖，以便制备相应的β-糖基化核苷。
偶合反应也可以通过异头位置的活化使之转化成SPh、F或亚氨酸酯(imidate)基，然后与5′羟基核苷反应，以制备相应的糖基化核苷来完成。
X、X1、Y、Y1、Z、Z1、R、R1和A在下表中定义。
A=OAc,Sph,F，亚氨酸酯糖的名称 X1X Y1Y Z1ZRR1葡萄糖H OH H OH H OH CH2OH H葡糖胺H OH H OH H NH2CH2OH HD-奎诺吡喃糖 H OH H OH H OH CH3H半乳糖OH H H OH H OH CH2OH H半乳糖胺 OH H H OH H NH2CH2OH HL-岩藻吡喃糖 OH H H OH H OH CH3HL-鼠李吡喃糖 H OH H OH H OH CH3H己糖醛酸D-葡糖吡喃糖醛酸 H OH H OH H OH COOH HD-半乳糖吡喃糖醛酸OH H H OH H OH COOH HD-甘露吡喃糖醛酸 H OH H OH OH HCOOH HD-碘吡喃糖醛酸H OH H OH H OH HCOOH为制备呋喃基化核苷，六呋喃糖在其异头位置上与核苷5′位置进行的偶合反应可通过上述的方法来完成。
其中R2=H，且R3=OH，或R2=OH，且R3=H。
由于环的大小问题，六呋喃糖与核苷的偶合反应将制备异头物的混合物。
D．由糖苷酶反应进行的前体药的活化1．通过糖的异头位置将六吡喃糖结合到药羟基上。
2．通过糖的异头位置将六呋喃糖结合到药羟基上。
糖苷酶前体药本发明包括具有下式的化合物D1aV-Q-X其中X是药XQH的基团，优选的是XQH为细胞毒性药，如核苷类似物或磷酰胺芥子[HOP(O)(NH2)N(CH2CH2CL)2]、左旋苯丙氨酸氮芥或阿霉素。
Q是O或NH，和V是通过具有任意的α或β-构型的糖的异头位置结合到QX上的六吡喃糖或六呋喃糖。
优选的是，V是葡萄糖、葡糖胺、D-奎诺吡喃糖、半乳糖、半乳糖胺、L-岩藻吡喃糖、L-鼠李吡喃糖、D-葡糖吡喃糖醛酸、D-半乳糖吡喃糖醛酸、D-甘露吡喃糖醛酸或D-碘吡喃糖醛酸。
以过渡态类似物那样来制备脒半抗原，以诱发免疫反应形成催化抗体。脒半抗原模拟用于配糖键的水解的过渡态。由于半抗原的椅型结构，产生这些半抗原的抗体可以断裂各种单糖六吡喃糖。
其中R2=H，且R3=OH，或R2=OH，且R3=H。
半抗原的合成是在二氯甲烷作溶剂的三乙基氧鎓四氟硼酸盐存在下通过合适的内酰胺和相应的5氨基核苷所进行的偶合反应来完成的。
用于配糖键的断裂而释放出药的半乳糖或等效糖的半抗原(脒TS类似物)具有下述结构式
R=核苷、糖或任何等效糖。
糖苷酶半抗原1用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物D1b
其中X′是化合物D1a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是NH，和M′是正戊烷的1,4-基，其中C1、C2、C3和C5任意地被OH取代，且M′任意连到载体蛋白质上。
糖苷酶半抗原2用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物D1c
M′是正戊烷的1,4-基，其中C1、C2、C3和C5任意地被OH取代，且M′任意连到载体蛋白质上。
糖苷酶半抗原3用作半抗原及前体药的是具有下式的化合物D1d
其中X′是化合物D1a中X的类似物，且其任意连到载体蛋白质上，Q′是CH2，和M′是正戊烷的1,4-基，其中C1、C2、C3和C5任意地被OH取代，且M′任意连到载体蛋白质上。
核苷类似物前体药许多细胞毒性核苷类似物具有作为抗肿瘤剂的用途，虽然通常存在低的安全保证。这些药的有效抗肿瘤剂量可有严重的副作用，这些副作用通常与它们对正常组织，如骨髓或胃肠粘膜的毒性有关。
5-氟尿嘧啶(5-FU)是对于各种恶性肿瘤例如结肠和直肠癌、头和颈癌、肝癌、乳腺癌及胰腺癌具有临床活性的主要抗肿瘤药。5-FU具有低的治疗指数。服用的剂量的大小受毒性的限制，从而降低了在肿瘤细胞附近能够达到较高浓度条件下将会得到的潜在效力。
5-FU必须被合成代谢达到核苷(如氟尿苷或氟脱氧尿苷-5′-磷酸酯)的程度，以便发挥它的潜在的细胞毒性。相应于这些核苷(5-氟尿苷和5-氟-2′-脱氧尿苷)的核苷也是有效的抗肿瘤剂，并在某些模型系统中它们实际上比5-FU更有效，这可能是因为它们比5-FU更容易转化成核苷。
本发明的将氟尿苷局部给药于肿瘤细胞的方法具有的最低限度的系统暴露而在肿瘤位置上提供高浓度的优点，对肿瘤的另一选择程度是通过不能立刻被肿瘤细胞吸收的氟尿苷的快速分解代谢(以最低生成较低毒性的5-FU)来达到。
同样，阿拉伯糖胞嘧啶(Ara-C)广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。通过胞苷脱氨酶使Ara-C很快分解，结果产生了非活性的代谢产物阿拉伯糖尿嘧啶。使用Ara-C进行治疗经常引起与骨髓抑制或胃肠粘膜的损害有关的副作用。Ara-C进行的靶给药，例如，对淋巴瘤，产生了具有最低副作用的治疗效果。
类似的论点和理论适用于其他抗肿瘤核苷类似物，它们包括(但不限于此)氟尿嘧啶阿拉伯糖苷、巯基嘌呤核苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、阿拉伯糖基5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿苷、氮杂核苷、6-氮杂胞苷、三氟甲基-2′-脱氧尿苷、胸苷、巯鸟嘌呤核苷、3-脱氮尿苷。
在本发明中，抗肿瘤核苷类似物的前体药是通过将合适的取代基连到醛糖环的5′-位置上来制备的。在这一位置上的取代基降低了该药的毒性，因为通常细胞毒性核苷类似物必须被磷酸化(生成核苷类似物)，以便显示它们的毒性。在5′位置上的取代基也使核苷类似物对于核苷分解酶尿苷磷酸化酶(其分解尿苷和其类似物)和胞苷脱氨酶(其分解胞苷和其类似物)是稳定的。在抗肿瘤核苷类似物的醛糖环的3′位置上具有取代基的前体药也用于抗肿瘤核苷类似物的靶给药。
核苷类似物前体药和半抗原的实例如下5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲基苯甲酸酯
5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲基苯甲酸酯的膦酸酯半抗原
5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲基苯甲酸酯的磺酸酯半抗原
5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲氧基苯甲酸酯
5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲氧基苯甲酸酯的膦酸酯半抗原
5-氟尿苷-5′-O-2,4,6-三甲氧基苯甲酸酯的磺酸酯半抗原
5-氟尿苷-5′-O-2,6-二甲氧基苯甲酸酯
5-氟尿苷-5′-O-2,6-二甲氧基苯甲酸酯的膦酸酯半抗原
5-氟尿苷-5′-O-2,6-二甲氧基苯甲酸酯的磺酸酯半抗原
烷基化剂前体药本发明也为完成局部给药和形成活性烷基化剂提供了新的方法和化合物。
连接到某些环磷酸胺代谢物(如4-羟基环磷酰胺或醛磷酰胺)上的本发明的前体药取代基防止了它们酶分和化学分解成细胞毒性产物。结合到肿瘤选择试剂上的合适的蛋白催化剂在前体药之前给药；接着在前体药给药之后，在其上的催化剂在肿瘤细胞附近产生了活性烷基化物。
本发明利用有关环磷酰胺的前体药，在临床实践中，环磷酰胺是使用最广泛的烷基化剂，其在治疗乳腺、子宫内膜和肺癌中，以及在治疗白血病的淋巴瘤中也是有效的。象这样的环磷酰胺是非活性的，它在肝中首先转化成4-羟基环磷酰胺，然后其进一步分解成细胞毒性代谢物，于是，在环磷酰胺给药后，环磷酰胺的活性代谢物将通过循环过程系统地扩散，并从肝中释放出来，其不能通过，例如局部注射而浓缩于肿瘤细胞区域。环磷酰胺的活性细胞毒性代谢物是不稳定的，或者说毒性是很强的，因此其不能直接给药。环磷酰胺治疗的副作用包括白细胞减少，膀胱损害和脱发。本发明为给出细胞毒性的环磷酰胺代谢物的合适的前体药提供了方法和化合物，而上述的代谢物在本发明的实施方案中是通过催化抗体来活化的。
涉及其他烷基化剂的类似的前体药和半抗原属于本发明的范围，其他抗肿瘤烷基化剂包括(但不限制于)烷基硫酸酯类，如白血福恩；氮丙啶类、如苄替哌或双二甲磷酰胺乙酯；亚硝酸尿素类，如卡氮介；和氮芥类，如苯丁酸氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺或甲基二氮乙基胺。
醛磷酰胺前体药和半抗原的实例如下醛磷酰胺二乙基缩醛
醛磷酰胺二乙基缩醛半抗原
醛磷酰胺二乙基缩醛半抗原
醛磷酰胺二乙基缩醛半抗原
醛磷酰胺的烯醇式的2,4,6-三甲氧基苯甲酸酯
醛磷酰胺的烯醇式的2,4,6-三甲氧基苯甲酸酯的膦酸酯半抗原
左旋苯丙氨酸氮芥前体药和半抗原的实例如下
左旋苯丙氨酸氮芥-2-羟乙基苯甲酸酰胺的膦酸酯半抗原
其他抗肿瘤剂的前体药各种各样的抗肿瘤剂的前体药是通过将它们结合到本发明的前体药的取代基上来制备的。本发明的酯或糖基取代对于具有羟基的药是合适的；酰胺取代基对于含有氨基(特别是伯氨基)的药是合适的；缩醛取代基对于含有醛基的药是合适的。
阿霉素和有关的氨茴环霉素抗肿瘤剂，象道诺红霉素和epirubicin对于用本发明的方法进行靶给药是合适的药物。在这类药的六碳氨糖环上的伯胺基对于本发明的酰胺取代基之一的连接是一个好的位置，并且在六碳氨糖环或糖苷配体部分上的羟基适合于连接本发明的酯取代基。这类取代基降低了抗肿瘤药的细胞毒性；在肿瘤位置上，通过合适的靶催化蛋白质使细胞毒性恢复。
同样，适于用本发明的方法进行靶给药的其他抗肿瘤药包括(但不限于此)叶酸盐拮抗剂类，如氨甲蝶呤或trimetrexate；鬼臼脂化合物类，如etoposide或鬼臼毒素；长春花属生物碱类，如长春新碱、长春花碱或长春碱酰胺；微管蛋白修饰剂类，如紫杉醇(taxol)；抗菌素类，如更生素和争光霉素。
此外，由于对正常组织具有非常大的毒性，本身在体内不能用作抗肿瘤剂的细胞毒性药通过使用本发明的方法和前体药取代基可用作靶抗肿瘤剂。这类细胞毒性基质包括trichothecene毒素。
阿霉素前体药和半抗原的实例如下阿霉素苯甲酸酰胺
阿霉素苯甲酸酰胺的膦酸酯半抗原
用于活化前体药和使前体药达到靶部位的催化蛋白质用于活化前体药的催化蛋白质除了开发适合的前体药之外，在这种治疗方案中必须选择用于这些前体药的活化(即提高来自前体药残基的药的断裂速率)的合适的催化蛋白质。
a．用于活化前体药的酶在酶具有合适的催化活性的情况下，这些酶或它们的活性片段可以和本发明的新的前体药一起使用，在本发明的构思中使用的酶和催化活性选自糖苷酶、肽酶、脂酶(其他水解酶)、氧化还原酶、转移酶、异构酶、裂解酶或连接酶。
用于本发明新的前体药的酶的实例叙述如下A．酯酶断裂被酯化到药上的酰基取代基羧基酯化酶(E.C.3.1.1.1)芳基酯化酶(E.C.3.1.1.2)三酰甘油脂酶(E.C.3.1.1.3)乙酰酯酶(E.C.3.1.1.6)半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)头孢菌素-C-脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41)6-O-乙酰葡萄糖脱乙酰酶(E.C.3.1.1.33)
脂酶B．酰胺酶-断裂连到氨基上的酰基取代基肽酶(肽链内切酶和肽链端解酶)β-内酰酶(分类A、B和C)和青霉素酰胺酶乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(E.C.3.5.1.16)乙酰赖氨酸脱酰酶(E.C.3.5.1.17)C．缩醛水解酶-水解缩醛(或原酸酯)成醛链烯基甘油磷酸胆碱水解酶(E.C.3.3.2.2)纤维素酶(E.C.3.2.1.4)寡-1.6-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.10)溶菌酶(E.C.3.2.1.17)β-D-葡萄糖醛酸酶(E.C.3.2.1.31)D．糖苷酶-断裂醚键连到药上的糖取代基实例包括β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、菊粉酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、琼脂酶(agarase)和异构酶。具体的实施例包括β-D-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)α-D-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20)β-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)α-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)β-D-果糖呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.26)α-α-茧密糖酶(E.C.3.2.1.28)α-L-岩藻糖苷酶(E.C.3.2.1.51)糖基酰基鞘氨醇酶(E.C.3.2.1.62)裂解酶可与作为半抗原的前体药一起使用。
主要目的是选择一种被暴露于药的血清或其他身体各部分中通常不存在的酶活性，所说的酶活性能够活化该前体药，并对生理化合物或大分子不引起明显的损害。使用筛选技术可以选择用于前体药的酶，比如下文中描述的用于催化抗体的那些。
b．用于活化前体药的抗体用于本发明的催化抗体或其活性片段是在现有技术(见上述本发明背景技术中的关于催化抗体部分)中叙述过的，并且是使用本文所述的新的半抗原(见上述的本发明命名的新的前体药和半抗原的部分)采用本领域的技术人员已知的制备催化抗体的技术制备的那些。见美国专利4,963,355、4,888,281和4,792,446，其被引入本文作参考。
靶试剂本发明的靶化合物和活性化合物的靶组分包括选择性地结合或浓缩的特异性细胞种群的附近之上或之中的任何试剂，例如特异地结合到与肿瘤有关的抗原上的任何抗体或其他化合物(其他实例包括激素、生长因子、底物或酶的类似物，等等)。这类抗体的实例包括(但不限于此)特异地结合到抗原上的那些抗体，所述的抗原被发现在癌、黑素瘤、淋巴瘤、骨和软组织肉瘤以及其他肿瘤上。蔓延期仍然结合到细胞表面上的或内在化很慢的抗体是尤其有利的。这些抗体是多细胞系的，或有利的是，这些抗体是单细胞系的，并且是含有抗体的活性结合部位的未受损的抗体分子或片段。
按照本发明，系统用作在需治疗的任何宿主靶部位上给药，并提供具有一个或多个可靶给药的组分的靶部位，例如，对那种部位实际上是唯一的表位，它们是被公认的，并是通过免疫结合物结合的。特殊的靶部位包括在由致病态产生的宿主中的那些部位，而所说的致病态是由例如肿瘤、杆菌属、真菌或病毒诱发引起的；或者由于正常宿主系统的失灵而引起的，例如在血栓形成的心血管疾病、炎症疾病和中枢神经系统的疾病中。
使用遗传无性繁殖的遗传工程的方法能够使潜力发生变革，从而产生使酶或催化抗体进行靶给药的药剂，在免疫区产生的进步已举列说明了这一点。
a．结合肿瘤细胞的抗体结合在肿瘤细胞上以高密度表达的并且不从该肿瘤中排出的抗原的抗体优选的用于本发明中。这些先决条件与用于使用放射标记的单细胞系统抗体的肿瘤图象和治疗的相关领域中的那些先决条件相同。
已经使用用各种放射性核素(包括125I、131I、111In、99mTc、186Re、90Y)标记的许多单细胞系抗体，以便使肿瘤显象。这种工作已表明，通过放射闪烁技术可成功地显象出各种各样的肿瘤。已成功地被靶给药的肿瘤类型列于下表中。对所列出抗原的抗体用于使前体药活化。肿瘤类型组织 Mab抗原 参考文献癌 带有肝转移 MR-LU-10 40KDGoldrosen.M.等人瘤的胃肠道 糖蛋白 Cancer Research 50(1990):7973-7978腺癌 胃肠道和 FO23C5 癌胚胎 Siccardi,A.,Cancer其他组织 抗 原 Research 50(CEA) (1990):899s-903s癌 头/颈和外阴 E48在22KD表 Gerretsen.M.等人面抗原中 British Jounal of的肽表位 Cancer 63(1991):37-44癌 喉、咽和 CEA Kairemo.K.等人，耳旁腺 Acta Oncoloica 29(1990):539-543癌 肝 NP-4 CEA Wang.Z.等人，Cancer Research50(1990):869s-872s癌乳腺 CEA Kairemo.K.等人，Acta Oncologica29(1990):533-538肿瘤类型组织Mab 抗原 参考文献癌 膀胱BW CEA Boekmann.W.等人431/26 British Journal of Cancer62(1990):81-84癌 卵巢 HMFGI 乳脂bobule Hird.V.等人，British糖蛋白 Joumal of Cancer(＞200KD) 50(1990):48-51癌 胰腺 DU-PANI 在＞50％胰 Worlock.A.等人，腺瘤中表达 Cancer Research50的糖蛋白 (1990):7246-7251黑素瘤 在裸体小鼠中 G7A5 与抗原有关 Le Doussal.J.M等人，的异种移殖物的高分子量 Cancer Research50黑素瘤 (1990):3445-3452(HMW-MAA)癌 乳腺 GP220软骨素硫酸盐蛋白多糖的核蛋白(250-280KD)黑素瘤 淋巴节 225.28sHMW- Wahl.R.等人，Cancer.
和 MAA(不 Research50763.24T同的表位) (1990):941s-948s神经胶 脑 Williams，等人，肿瘤类型组织Mab 抗原 参考文献质瘤 Cancer Research50(1990):974s-979s神经胶 脑EGFRI 人和鼠的传染 Kalofanos,H，等人，质瘤 生长因子受体J,Nuc Med 30的外部范围(1989):1636-1645)H17E2 胎盘的碱性磷酸酶(67KD)病毒细胞(精 睾丸 胎盘的碱性 Pectasides,D，等人，原细胞瘤和非 磷酸酶 British Joumal of精原细胞瘤)(67KD) Cancer 62(1990):74-77当在肿瘤部位上的实际抗体的浓度已经被证明是较低时，在某些情况下，使用小片段的抗体，如F(ab′)2导致增强肿瘤图象的特异性(Worlock,A，等人，Cancer Research 05(1990):7246-7251；Gerretsen,M，等人，British Joumal of Cancer 63(1990):37-44)。即使在具有从肿瘤排出的抗原的较大血清浓度的患者中，成功的图象也是可能的(CEABoeckmann,W，等人，British Journal of Cancer 62(1990):81-84)。
b．其他靶蛋白质除了使用抗体外，任何结合的物质都可用于将催化蛋白质(它是酶或催化抗体)结合到作用的部位上。已使用生长因子，以便除去毒素分子(Singall等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1987):9738-9742；Chaudnary等人，Prov.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987):45384542；Kondo.J.等人，Biol.Chem.263(1988):9470-9475)。通过使用上述参考文献所述的方法连接酶或abzymes，可产生使用生长因子白细胞间素6、白细胞间素2，转化生长因子2和其他物质的类似物的融合。把催化抗体结合到这些物质中是通过将这些生长因子融合到抗体单链基因结构的未端(专利申请WO88/01649)完成的，或另一种方法是将生长因子融合到这类基因结构的前端(在该基因的5′末端或该蛋白的氨基末端)。正如在专利申请EPA0,194,276(Neuberger)中所述的这些结构物的用途也可用来使催化抗体的活性与生长因子的结合性能结合起来。
人CD4假单胞菌属外毒素融合的使用证明了在使HIV传染细胞致死方面是有效的。来自由CD4连接到酶或催化抗体得到的这类结合活性的使用使前体药能直接用于治疗AIDS。该CD4结合到在HIVI传染细胞上表达的gp120上。这种结构的转换利用gp120酶(或催化抗体)融合，以便形成免疫抑制剂(moore等人，Science,250(1990):1139)。在本主题发明中可使用的其他连接物是integrm族，如LAF-1，其可用来调节免疫系统(Inghirami等人，Science,250(1990):682)，和选择族，如ELAM，其可用来作为肿瘤和免疫细胞的靶给药(Walz等人，Science250(1990):1132)。
抗体也可用来使对某些血细胞类型的本发明的前体药进行靶给药，以治疗自身免疫疾病，此外，过多产生激素的细胞也可靶给药。
制备双特异性蛋白a．通过将酶或催化抗体化学连接到靶蛋白上制备双特异性蛋白用本领域公知的方法，例如用异双官能交联剂SPDP(N-琥珀酰亚氨基-3(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(Proprionate))或SMCC(琥珀酰亚氨基4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯[参见，例如，Thorpe,P.E.,et al，“抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性”Immunological Rev.62(1982):119-58；Lambert,J.M.,et al，上文12038页；Rowland,G.,F等人，上文183-84页和Gallego,J.,et al.,737-38],可将本发明的酶共价结合到本发明的靶蛋白。
b．用重组体DNA制备双特异性蛋白。
融合蛋白至少含有连接到本发明的酶或催化抗体的至少一个官能活性部分上的本发明的靶蛋白的抗原结合区，该融合蛋白可用本领域公知的重组体DNA技术构成[参见，例如，Neuberger,M.S.et al.,Nature312,(1984):604-608]这些融合蛋白基本以与本文所述的抗体-酶轭合物相同的方式作用。
重组体DNA方法已用来表达哺乳类动物系统中的抗体基因(Oi,V.T.et al,Proc Natl.Acad.Sci.USA 80(1983):825-829；Neuberger.M.S.EMB O2(1983):1373-1378)。大肠杆菌的生物活性免疫球蛋白(人的IREFc片段)的进一步表达和恢复已经得到了证明(Kenten,J,H.,etal.,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 81(1984):2955-2960)，并且整个活性抗体的表达和恢复也已得到证明(Boss,M.A.,et al,Nucleic AcidsRes.12(1984):3791-3799)。这后面有说明大肠杆菌中产生免疫球蛋白结合和效应基因机能活性的潜力的一般性的其他组(Cabilly,S.,etal,Proc Natl.Acad Sci USA 81(1984):3273-3277；Skerra,A.,et al,Science240(1988):1038-1040；Better,M.,et al,Science 240(1988):1041-1043)。这些技巧和技能也已被用于许多其他基因的操纵。
下面是前体药靶试剂的例子，这些试剂的大多数取决于上述的克隆，操纵和表达基因的技能。
使用上述遗传设计抗体，提供了一个意义明确的路线和能繁殖的试剂，该试剂可迅速分析各种前体药的效力。抗体设计的这些方法被例举在欧洲专利申请EPA 0,194,276(Neuberger)中，其中重链基因通过除去CH2和CH3区域结构而被切断，接着加入不同基因。按照这些基本的方法引入所需的酶活性。为了达到酶活性的最佳水平，需要抗体和酶之间的顺序的操作。加入连接体顺序和/或改变融合位置对这种最佳化来说是需要的，另外，如果在IgE和IgM重链的情况下，可通过除去CH2CH3和CH4来减小其大小，对所定义的抗体-酶试剂的优点是有价值的。
双特异性抗体的产生对本领域来说是公知的(Shawler,et al,Immunol.135(1985):1530-1535；Kurokawa,T.,et al,Bio/Technology 7(1989):1163-1167)。这样的双特异性功能的抗体的例子有肿瘤特异性抗体，这种抗体也连接到金属螯合物上用于肿瘤治疗，还有连接到肿瘤细胞和T细胞上的双特异性抗体(Johnson,M,J.,et al，专利申请EP369566A,1990；和Gilliland L.K.,et al，专利申请GB2197323,1986)。双特异性抗体的产生方法包括抗体链的分离和重组的化学方法，或者两个杂交瘤的融合，产生所谓的四位瘤(quadromas)。这些方法是有效的，但是易于产生混合的物种，并且需要纯化来分离所需的产物。
较小的结合物种的产生已经成为抗体设计学中许多研究的目标。这已导致了单链抗体的开发，其中用连接体顺序将两种抗体链的易变(V)区合并成一个单一的分子(专利申请WO88/01649,Ladner和Bird)。V区的这种结合导致了一种蛋白的表达，该蛋白具有在氨基端的一个V区和经连接体将其COOH端连接到其氨基端的另一个V区。这样使得头与尾相连接，V区的头尾连接已由V轻链-V重链和V重链-V轻链的方位所描述。这些系统的使用已通过加入其他蛋白的单链抗体而得到了发展(Vijay，等人，Nature 339(1989):394-397)。为了将其他蛋白加到单链抗体的端部，使用这种形式来制备类似分子，并使用所需的酶基因来改变这些结构。这样使得制备的分子在一个小分子中具有理想地适合于治疗的抗体结合和酶催化活性的所需特性。
为了设计将两种抗体活性制入单链的双特异性分子或相当的小分子中，按照下面叙述的本专业熟练的技术人员公知的方法进行。
该结构将包括连接到V轻链区(VL)上的V重链区(VH)；借助对单链抗体所述的连接对肿瘤细胞抗原的特异性(Vijay等人，Nature 339(1989):394-397；专利申请WO88/01649,Ladner和Bird)；这些顺序直接连接到催化抗体VL上，该催化抗体VL将通过连接体顺序依次地连接到其VH配偶体上。V区的结合也可按照VL-VH-VH-VL或VL-VH-VL-VH或VH-VL-VH-VL顺序。用于这些结构中的连接体顺序是上述对单链抗体结构所述的顺序。这种结合允许用以前未知的单链双特异性抗体的表达。这种分子能够产生大量的这种双特异性活性，而没有用其他方法所遇到的提纯的特性问题。这种分子也具有这种试剂所要求的低分子量。基于类似结构的其他物种描述了一种以前未知的如下分子。对肿瘤或抗原特异性的VH区直接连接到催化抗体的CL区；这种分子可分别地或与对肿瘤或抗原特异性的直接连接到催化抗体的VH上的VL的其他结构一起而便利地表达。这两种分子一起表达产物，或通过在后的混合物表达，结合形成了双特异性抗体。V区的其他结合生成了类似的分子，这类分子有利于遍及上述分子中，因为它具有低的分子量，使用结合蛋白的单区对研究直接融合到酶或催化抗体上的形式也是有价值的(专利申请WO90/05144,Winter)。
抗体的人格化抗体和其他试剂的人格化减少了免疫应答。试剂抗原性已经是早期鼠抗体治疗中的一个问题，该治疗通过患者测定对鼠抗体有明显抗体应答而已变得无效(专利申请EPA0194276,Neuberger，专利申请EPA0239400；LoBuglio,A.F.,et al,Proc Natl Acad Sci USA 86(1989):4220-4224)。免疫应答不仅与抗体的不变区有关，而且也与产生强抗基因应答的可变区范围有关(Bruggemann,M.et al,J.Exp Med.170(1989):2153-2157；Shawler D.L.,et al,Immunol.135(1989):1530-1535)。
产生有治疗价值的蛋白的人格化方法的价值已通过用V区构架组织代替鼠抗体的人格化而得到了证明。该人格化方法使得利用被相当好测定的其抗原结合环与结合点的基本结构(Kabat,E.A等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services U.S.Government Printing Office,1987)。用人类顺序代替构架组织，同时保持初始抗体的环。可有效地将抗原结合从鼠转移到人的结构组织(Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)；323-327；Jones,P.T等人Nature 321(1986)；522-524；Verhoeyen,M.等人，Science 239(1988):1534-1536；Queen,C.等人，Proc Natl Acad Sci USA86(1989):10029-10033)。对于这种人格化技术，已有某些假设A)高变化的环提供给结合；B)保存构架组织结构；和C)所有环以类似方式与构架组织相互配合。由于使用基本分子模型，人格化可提高成功度而最优化(Riechmann,L.等人，Nature 332(1988):323-327)。
这些方法的目的在于人格化能适用于酶活性。使用结构分析能使均匀外环区接枝以便伪装抗原性，如果具有类似人体蛋白结构的酶能够找到的话。通过使用共价变体，即蛋白表面的聚乙二醇变体，也可排除抗原性问题。
抗体表达载体近来，在应用免疫球蛋白基因的PCR细胞系方面的进展已导致能够利用噬菌体入(Huse,W.D.等人，Science 246(1989):1275-1281)和丝状噬菌体fd(Clarkson,T.等人，Nature 352(1991):624-628)来制备大肠杆菌中的抗体表达库，然后Fab可用带有用放射性同位素示踪的半抗体通过结合分析的过滤器筛分(Caton,A.J.等人，PNAS,UAS 87(1990):6450-6454)虽然分离具有所需的结合活性的斑具有潜在的价值，但是如果人们试图分离作为催化活性媒介抗体的话，则必须分别筛分每个细胞系。表达专利申请WO92/01047(在此引入作为参考)所述的单链FV抗体的噬菌体fd系统叙述了噬菌体颗粒的制备，该噬菌体颗粒载有融合到噬菌体基因Ⅲ蛋白的抗体FVs′。该系统可以供直接选择噬菌体之用，并且这些基因可给特异性抗体密码，这些特异性抗体是通过利用抗体结合到抗原或半抗原上而表达在噬菌体颗粒上。使用这种方法稀有抗体已从组合库分离出来(Marks,J.D.等人，J.Mol,Biol.222(1991):581-597)。
以前没有叙述过的另一种方法是用质粒基而不是噬菌体入基系统制备抗体表达库。在这种系统中，与其说具有VH和VL基因作为分别的转录单元，倒不如说它们通过一个短肽共价连接而生成一个单链抗体，(如Bird,E.等人，Science 242(1988):423-426)所述。利用适合的PCR引子，主要由VH和VL任意组合而组成的组合单链抗体库是通过一个前面所述的单步骤PCR方法(Davis,G.T.等人，Bio/Technology(1991)印刷中)而产生。将单链PCR产物无性繁殖于一个适合的含有可归纳的助催化剂如Ptac的大肠杆菌表达载体中。将一个单顺序，例如pelB，加到无性繁殖的单链的5′位，使能够神秘表达抗体蛋白(Better,M.等人，Science 240(1988):1041-1043)。不同于其中大肠杆菌被溶解的噬菌体表达系统，所述的质粒基表达系统能够利用直接选择对催化抗体直接筛分的大肠杆菌库。一种可能的选择方法，β-内酰胺或β-内酰胺衍生物的失活，叙述于“催化抗体的筛分”中的一段。另一种可能的选择方法包括主要对大肠杆菌生长的营养素、维生素或辅助因子的抗体催化释放。一种使用需要营养缺陷体的胸苷的这种选择方法叙述于本文的片段；核苷类似物前体药的催化激活的筛分。
表达抗体具有所需的结合或催化活性的大肠杆菌细胞系的VH和VL范围，可被诱变，以改变或提高抗体功能。将被作为诱变靶的特异性CDR氨基酸残余物可通过抗体活性中心的分子模型鉴定。通过使用诱变低聚核苷酸的各种上述中心-直接诱变方法之一来完成诱变(Maniatis,T，等人，Molecular Cloning:Alaboratory Manual(1989):15.51-15.65,New York:Cold Spring Harbor Laboratory)。
如果选择性诱变不能产生所需的后果，则要进行更广泛的活性中心更替。一种有效的方法是用任意氨基酸的结构或部分结构替代一个或几个CDRs。这种任意诱变方法被成功用于改变β-内酰胺酶(Dube,D,K等人，Biochemistry 28(1989):5703-5707；Oliphant,A.R.等人，PNAS,UAS 86(1989):9094-9098)。所述的方法包括通过用一个任意的低聚核苷酸替代活性中心部分的DNA顺序编码而将任意的氨基酸引入酶活性中心。
抗体CDR区的任意诱变可用许多不同方法的任何方法来完成。用于任意地诱变抗荧光素单细胞系抗体的CDRⅠVH的方法的一个记录的例子(Mab 4-4-20,Bedzyk,W.D.等人，JBC 264(1989):1565-1569)详细介绍如下。
1．按照下面所示的顺序的低聚核苷酸在一个自动DNA合成器中合成，某些核苷酸三联体上的数字相应于Bedzyk等人(1989)所定义的4-4-20VH中的氨基酸位置。
21 25 30 (CDR1) 355TCC TGT GTT GCC TCT GGA TTC ACT TTT AGT (NNKNNKNNKNNK) AAC TGG40GCT CGC CAG TCT CCA GAG AAA GGA-3′在上述顺序(SEQ ID NO:1)中，VHCDRJ(氨基酸31-34)被一个任意的核苷酸顺序(其中N是A、C、G或T)(等摩尔)和K是G或T(等摩尔)替代。除去每个三联体中第三位置上的A或C将使潜在的末端密码子的数减少三分之二，正如Cwirla,S.E.等人，PNAS,USA 87(1990):6378-6382所报导的。
2．合成第二个低聚核苷酸，该低聚核苷酸附加到步骤1的低聚核苷酸的3′端处的最后20个碱基对上，接着用T4激酶磷酸化，将低聚核苷酸退火，然后加入到含有脱氧核苷酸和Klenow片段的底料延伸反应中。得到的全长双绞合任意的低聚核苷酸用聚丙烯酰胺胶电泳或反相HPLC提纯。
3．步骤2的双绞合任意低聚核苷酸可用作Clackson,T.等人，NAR17(1989):10163-10170所述的“粘性脚”(Sticky foot)诱变过程中的“粘性脚”底料。该过程将使步骤1中所述的任意低聚核苷酸所指定的任意CDRⅠ顺序取代存在于模板绞合中的野生型VH CDRⅠ。
4．粘性脚诱变后，步骤3的DNA用于转变大肠杆菌，得到抗体库，其中VH CDRⅠ用任意顺序取代。
5．得到的库可通过用适合的半抗原的结合试验或本专利的前机部分的所述的选择试验而筛分。
VH或VL的其他CDR区可用类似的方法任意地诱变，另外，VH或VL链中的一个、二个或所有的三个CDR区可同时诱变。由于可在自动机器中合成的低聚核苷酸的长度的限制，相应于每个3CDR区的3个单独的任意的低聚核苷酸可用上述步骤1所述的方法制备。在低聚核苷酸合成期间，在侧面与每个CDRs相接的构架组织区中适合的位置引入限制中心。转化成上述步骤2中的双绞合DNA后用适合的限制性酶消化每个低聚核苷酸，并将这些低聚核苷酸结合在一起生成完全的VH或VL，然后将最终结合的产物用作上述步骤3中的“粘性脚”底料。
上述方法的另一个途径是将限制性酶部位设计入将要诱变的CDR VH或VL的每个端上的构架组织区。在上述步骤1中的任意低聚核苷酸的合成中，然后将可配伍的限制性部位加到构架组织两侧的区中。选择限制性部位，以便最好的保护构架组织区中的野生型密码顺序。然后通过用适合的限制性酶消化来除去该野生型CDR区，并用可配伍的限制性酶消化的双绞合的任意的低聚核苷酸取代。
利用诱变选择新的结合活性和选择丝状噬菌体通过在选择条件下选择生长来选择变异的抗体的方法已有说明(参见题为“大肠杆菌中变异催化抗体的筛分”一段)。与选择和诱变的这些方法一样，使用Cwirla S.等人，PNAS,87(1990):6378-6382；和McCafferty J.等人，Nature,348(1991):552-554所述的方法有助于产生/改善对前体药活化的催化抗体。
这些方法已能够产生大量的肽库，并通过采用在上述方法中产生的变异单链抗体将其插入丝状的杆菌噬菌体fd的吸附蛋白(基因Ⅲ)中经产生的变异体的结合而筛分。无性繁殖和诱变单链抗体的PCR的引入部位是吸附蛋白(基因Ⅲ)的N端的5-6氨基酸。这样便于存在的抗体结合到抗原上，然后，将插入单链抗体基因后的载体(fd-CATI)用于电转变大肠杆菌TGI(K12(Lac-Pro)supE,thi,hsd D5/F tra D 36,proA+B+laclq,LacZM 15)或类似的宿主。
然后用载体的四环素抵抗力来选择转变的大肠杆菌。将该噬菌体库在平皿上培养，使其放大并评估库的大小(在1012范围内的库的大小能够在抗体的9部位筛分任意的变异体)。
然后将该库在培养液中放大，用聚乙二醇沉淀作用将上清液中生成的噬菌体浓缩，并溶于含有2％撇清乳剂粉末的PBS中。然后，将这些噬菌体与例如100μl固体相抗原。例如与一种适合的抗原反应的环氧活化的Sepharose CL-6B(Sigma Ltd)混合来选择所需的结合活性。用于这种选择的选择化合物将包括本文所述的那些半抗原，用于培养抗体的这些抗原也可通过结合到蛋白载体上而间接合到一种固相上，例如环氧活化的Sepharose CL-6B。载体蛋白的选择是这样进行的，即不使用用于免疫作用的蛋白，来防止非特异性抗体与载体蛋白分离的潜在问题。
然后通过离心分离分离得到的结合的吸附的噬菌体，接着进行一系列的洗涤步骤除去非特异性或弱结合的活性。洗涤步骤的种类是这样的，以致是对与选择的抗原的相互作用的类型和性质的选择，即由于离子相互作用，选择高盐洗涤将降低结合，或者使用乙二醇将能够降低有利于例如其他结合亲合力的疏水相互作用，基于这些洗涤条件的优选的选择不限于这些宽的基本洗涤条件，但也将包括使用基于将有关的抗原或作用物用于所需反应的特殊洗涤方法。噬菌体的库的洗涤也是基于相同的用于洗涤的标准设计。这些方法结合的结果就能够选择有关的结合活性物的大量基质。
然后将结合活性物的所需库放大，并详细分析它们的结合和催化性质。选择性洗涤和洗提的这些类型的应用能够选择所需的性质。这不需要在诱变和选择过程中的最终步骤，但是具有催化活性的所需结构的路线上的一个阶段。因此，该方法将是选择变异结合部位的成功路线。
然后，将分离的具有或不具有催化活性的潜在的侯选抗体引入基于利用抗菌的或营养缺陷的选择而进一步直接选择催化活性(见B段2部分)的活性选择的上述表达系统。另外，对于诱变和选择的其他路线，利用该噬菌体系统选择这些候选分子。这种噬菌体库方法的详细技术叙述于Cwirla,S，等人，PNAS,87(1990):6378-6387；和Mc Cafferty,J.等人，Nature,348(1991):552-554和专利申请WO92/01047中所公开的方法中。
筛分催化抗体A．对青霉素酶活性的抗体的选择单内酰胺基前体药的催化激活的选择可利用杂交瘤或变异大肠杆菌中的抗体而产生的抗体来进行，以便改善存在抗体的催化效率。
1．筛分青霉素酶活性的杂交瘤基抗体单内酰胺前体药的催化水解的体外探测可用固定在塑料96孔平皿(用下述方法)中的杂交瘤上清液抗体或在含有由腹水液体提纯的抗体的溶液中进行。
固定方法选择那些产生结合到ELISA测定法中的半抗原上的产生抗体的杂交瘤用于筛分。从废的5ml培养液中收集上清液，用2N NaOH(20μl)调节pH至7-7.5，通过在2700rpm下离心分离30分钟除去细胞碎片，将上清液(4μl)滗析入干净的聚丙烯管中。加入抗鼠免疫球蛋白亲合凝胶(Calbiochem,结合容量为ml凝胶0.5-2mg以免疫球蛋白)形成在PBS中的50％浆液(140μl，含有70μl凝胶)，将得到的悬浮液在25℃下轻轻混合16小时。将一个96孔Millfiter GV过滤平皿(Millipore)预湿。并用含0.05％Tween-20的PBS洗涤。亲合凝胶悬浮液在离心机中在2500rpm下旋转15分钟，除去大部分上清液，将每个聚丙烯管中的残留浆液(250μl)分别移入96孔过滤平皿中分开的孔中。通过过滤平皿吸引除去残余的上清液，固定的抗体在4℃下用PBS/Tween(5×200μl)PBS(3×200μl)，和25mM HEPES,pH7.2(3×200μl)洗涤。
抗体与前体药适当的培养之后，用标准的HPLC方法从未水解的前体药中分离出药。前体药的水解将导致芳香族药的释放，该芳香族药可用吸收光谱容易地测定出。产生的药的测定和量可用在线光谱测定仪测定。
2．筛分对青霉素酶活性的大肠杆菌中的抗体催化抗体的效力通常基本上低于那些天然酶。如果使用目前的技术来培养催化抗体并且不用化学或遗传改变来改善，则许多催化抗体将不适用于有效的工业应用。具有青霉素酶活性的催化抗体特别适用于用遗传变异来改善，因为它们的催化活性提供了一种快速和方便的方法，用这些方法，大肠杆菌的宿主菌落表达的抗体可活性筛分。因为大肠杆菌(尤其是某些过敏的菌株(Imada,A，等人，Nature 289(1981):590-591；Dalbadie-Mcfarland,G，等人，Proc,Natl,Acad.Sci.USA79(1982):6409-6413))被β-内酰胺抗体杀死，而具有青霉素酶活性的分泌抗体将得到对β-内酰胺毒性的抵抗力。变异抗体的催化效力越高，对宿主大肠杆菌的抗菌的最小抵制浓度(MIC)越高。例如对温和的催化抗体的基因的任意诱变这样的方法将产生大量的大肠杆菌菌落，产生大量的独特抗体。提高对适合的β-内酰胺抗菌抵抗力将提供一种比野生型抗体更有效的筛分大量变异体和那些信号抗体的迅速的和有效的基础。
前体药方法由β-内酰胺环分离活性药活性药可由非活性前体药作为一个取代的单环β-内酰胺环水解
取代基(R和R′)将特别取决于制备β-内酰胺有效试剂对破裂引起死亡或减弱生长的青霉素酶缺乏的大肠杆菌的细胞壁的要求。另外，这些取代基在免疫过程中可任意用于连接载蛋白(KLH或BSA)。
抗体的无性繁殖和变异以提高催化活性将产生催化抗体的抗体基因无性繁殖和表达于大肠杆菌中。使用对β内酰胺抗菌素过敏的大肠杆菌菌株是要求严格的(即，人们对β内酰胺抗生素缺乏自然防御)。这种菌株存在于缺乏青霉素酶和/或青霉素结合蛋白情况下(Imada,A.等人,Nature 289(1981):590-591；Dalbadie-Mcfaland,G.等人，Proc.Natl.A cad.Sci.USA 79(1982):6409-6413)。大肠杆菌菌株将含有被部位指引或任意诱变变导的质粒DNA密码的抗体基因。该生物体将表达和分泌改变的抗体。因为将产生许多克隆，每克隆分泌不同氨基酸顺序的抗体，所以将采用一种测定已增加催化性的变异体的迅速的和未增加劳动强度的方法。
筛分大肠杆菌中变异催化抗体筛分大肠杆菌变异体产生的具有青霉素酶活性的抗体的敏感和方便的方法是测定变异体抗类似前体药的β-内酰胺抗菌素毒性的改变能力。该方法的一个较好的特性是用于筛分的半抗原、前体药和有效的抗菌素的结构都是类似的，足以被抗体识别。半抗原必须激发抗体，该抗体不但结合和水解前体药，而且也用于激发宿主生物体，大肠杆菌的抗菌素(前体药减去药)。前体药的设计中要考虑的另一个特征是由于水解，前体药必须排除活性药。基于这些标准，许多不同结构都可用于本文其他地方所述的前体药。一个引人注意的倒子是单杆菌抗菌素，aztreonam和前体药衍生物(Koster,W.H.等人，Frontiers ofAntibiotic Research,ed.H.Umezawa.,(1987)211-226 Or lando,AcademicPress)。
Aztreonam是一种抗大肠杆菌(MIC=0.1mg/ml)的有效抗体，但其不被血流中的人体酶降解。半抗原可被设计和制备，其水解改性的aztreonam的β-内酰胺环以排除活性药。
对于产生有效催化抗体的变异体筛选(在大肠杆菌的超敏感菌株中)是通过用aztreonam本身而不用天然前体药激发宿主抗体一分泌菌落来完成，这样做是因为aztreonam(或类似的抗菌素)本身是一种抗大肠杆菌的有效抗菌素，虽然我们还不太清楚加入该药(改良的aztreona-m)可具有aztreonam的抗菌性。该药的存在可取消或减小aztreonam对大肠杆菌的抗菌作用。用aztreonam而不用较大的aztreonam-药结合物来筛选是可接受的，因为这些抗体产生了一种抗原，该抗原包括该药或其类似物，并且变异抗体将保持结合该药的能力。用标准方法倒如琼脂稀释(Sigal,I.S.等人，Natl.Acad.Sci.USA 79(1982):7157-7160；Sowek,J.A.等人，Biochemistry 30(1991):3179-88)或用aztreonam的浓度梯度(Schultz,S.C.等人，J.Proteins)2(1987)290-297)，来进行筛分。
变异体的特征化发现抗aztreonam的大肠杆菌菌落大量的生长，所以为了进一步体外特征化，抗体的毫克数可被表达和纯化。在这个阶段，抗体将在缓冲溶液中被纯化和特征化。临界运动性是有效水解β-内酰胺前体药而排除活性药物的能力。除了在人的血清中有效水解外，还需要没有前体药(基质)、水解aztreonam或活化药的强的产物抑制作用。
B．分离活化核苷似物前体药的催化抗体活化核苷类似物前体药的催化抗体可用两种一般方法中的任何一个方法分离；即体内选择方法或用物理化学方法筛分抗体或噬菌体表达抗体(筛选方法)。下面叙述的外内分离方法，其可用于对所有的核苷类似物胶体药筛分抗体。筛分方法根据两种要求的钝化基因被分为两种类型，一种类型的筛选方法测定酯酶活性，另一种类型的筛选方法测定糖苷酶活性。筛选可用于由鼠腹水液体提纯的抗体，或在早期阶段，用于存在于杂交瘤上清液中的抗体。这里给出的方法特别叙述了杂交瘤上清液的催化活性的早期筛选，但这些方法可容易地用于筛选和测定由腹水提纯的单克隆抗体。
1．核苷类似物前体药的催化活化的筛选筛分可以在早期阶段在杂交瘤上清液中用A部分中所述的固定方法进行。或在较后阶段用由鼠腹水提纯的抗体进行。
筛选半乳糖苷酶的催化活性的抗体在适合的试验缓冲器中，将前药溶液加入到无抗体的溶液中，或洗涤和固定的抗体中，然后在25℃下培养一段时间，其时间取决于前体药活化的未催化率，测定形成的活化药从器壁取出基质溶液(在固定方法中)，测定产物形成的量，或就地测定产物的量(在无抗体溶液的情况)。
通过比色测定或荧火测定半乳糖的产生(同时伴随着前体药的活化)。进行前体药活化的测定。
使用许多可能的半乳糖测定方法的一种方法。某些敏感的特殊的测定方法如下1．用32P-磷酸酯放射性标记游离的半乳糖a)半乳糖激酶(E.C.2、7、1、6)是市售的(Sigma Chemical Co.,st.Louis,USA)并催化下列反应半乳糖+ATP半乳糖-1-磷酸酯+ADP如果使用ATP(三磷酸腺苷)在r磷酸酯位置上具有32p，由催化抗体产生的游离半乳糖成为放射性标记。用薄层色谱法(TLC)或高效液体色谱法(HPLC)将标记的半乳糖-1-磷酸酯，与反应混合物中的其他组分分离并用闪烁计数定量。
2．用荧光或发色醛反应试剂测定催化作用在这种测定方法中，半乳糖与市售的(由例如，Molecular Probes,Inc.,Engene,OR得到)醛反应试剂非催化反应，生成带色的或荧光衍生物，与半乳糖反应的产物用HPLC或TLC分离，并用吸附或荧光标准方法测定。
一种可能的试剂是丹酰肼(Molecular Probes,Inc.)，丹酰肼在缓冲条件下与醛反应得到荧光产物(Eggert,F,M.等人，J.Chromatogr.333(1985):123；Avigad G.,J.Chromatogr.139(1977):343)，该产物可在低浓度下用该反应混合物的TLC或HPLC测定。因为可能有较低的测定限制、较大的反应专一性或更温和的反应条件，比丹酰肼更有效的其他可能的试剂是市售的其他的荧光酰肼，例如香豆素酰肼、荧光素氨基硫脲(Molecular Probes,Inc.)。比较这些试剂，可看出哪个最适合这些特殊要求。
3．用发色的特殊酶测定半乳糖a)可用于测定半乳糖的一种酶是半乳糖脱氢酶(E.C.1.1.1.48)(Sigmal Chemical Company,st.Louis,Mo,USA)，该酶催化下列氧化-还原反应半乳糖+NAD+(无色)半乳糖酸酯+NADH(有色)+H+半乳糖的氧化是通过还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)来进行。NAD+的还原形式，NADH，是有色的，它的显示是在340nm处分光光度监测的。
b)用于测定半乳糖的另一种酶的半乳糖氧化酶，(E.C.1.1.3.9)，该酶与过氧化酶和邻-联甲苯胺结合使用，该酶将随着由催化抗体产生的游离半乳糖的存在而引起颜色变化。该偶合反应如下，第一反应由半乳糖氧化酶催化，第二个反应由过氧化酶催化，这两种氧化酶都可由Sigma Chem.Company得到1．半乳糖+O2半乳糖酸酯+H2O22．H2O2+邻-联甲苯胺H2O+“带色产物”产生的带色产物可用分光光度法测定。
筛选酯酶催化活性的抗体在合适的测定缓冲器中，将前体药(除非另有说明)的溶液加入到固定的洗涤的抗体溶液或游离抗体的溶液中，然后在适合的温度例如25℃下培养一段时间，该时间取决于前体药活化的未催化率，如上所述，测定形成的活化药。
前体药形成的测定可通过伴随着在弱缓冲溶液中酯水解的pH变化来测定，pH的变化可通过在溶液中加入酸碱指示剂，例如酚红来测定(Benkovic,P,A.等人，Biochemistry 18(1979):830)，酚红随着pH变化而颜色变化。另外，更敏感的方法是用pH计(Stat)或有精装电极的pH计，该pH计可插入到孔中(Laxar Reserch Laboratories,Los Angeles,CA)以测定pH变化。由于筛选包括测定pH变化，可以在培养期间有必要将孔保持在氮气或氩气中，以防止pH变化受到大气二氧化碳的影响。
芳香酯保护的前体药的水解导致了酸性芳基的释放，该酸性芳基可用常规色谱法HPLC(阴离子交换或反相柱)容易地分离。此外，从HPLC洗提的芳环的测定可用UV吸附测定仪容易地进行。
体外测定芳香酯核苷类似物的水解的第三种方法是使用酶连接的测定法。可用于这个目的的一种便宜市售酶(Sigma Chmical CompanySt.Louis Mo)是胸苷磷酸化酶(E.C.2.4.2.4)，该酶将酶作用物胸苷和正磷酸酯转化成产物胸腺嘧啶和2-脱氧-D-核糖-1-磷酸酯。将使用纯化酯与胸苷的结合物，而不用这里筛选的前体药(相同类型的化合物将用于用营养缺陷细菌变异体筛选的生物制剂)。该酶将不催化芳香酯的磷酸化保护的胸苷，而仅催化催化抗体产生的游离胸苷。将胸苷磷酸化酶、前体药的胸苷变形体和32P-标记的正磷酸酯加入到孔中，用固定的抗体培养缓冲组分之后，等分试样用TLC处理，分离放射性标记的正磷酸酯和2-脱氧-D-核糖-1-磷酸酯，然后可用放射自显影法在TLC板上测定32P。
2．胸苷营养缺陷型的选择，以分离对核苷类似物前体药具有酯酶活性的催化抗体抗体的细菌表达有可能提供大量的不同抗体来筛选催化活性。可是，该技术的应用取决于选择那些产生活性抗体的菌落的有效的方法可用性。一种有效的方法是利用生物制剂选择，其中仅有那些产生催化抗体的菌落能够适用。其中可进行这种选择的一种方法是为催化抗体提供一种其中细菌缺乏的特殊营养素；并且其生存取决于分裂一种释放所需营养素的基质的抗体。得到分裂前体药的催化抗体的这种选择叙述如下。
为了制得可分裂前体药的催化抗体，从而释放核苷类似物(例如，氟尿苷、氟脱氧尿苷、氟尿苷阿糖苷、胞嘧啶阿糖苷、腺嘌呤阿糖苷、鸟嘌呤阿糖苷、次黄嘌呤阿糖苷、6-巯基嘌呤核苷、theoguanosine核苷、水粉蕈素、5-碘尿苷、5-碘脱氧尿苷、5-溴脱氧尿苷、5-乙烯基脱氧尿苷、9-[(2-羟基)乙氧基]甲基鸟嘌呤(acyclovir),9-[(2-羟基-1-羟甲基)-乙氧基]甲基鸟嘌(DHPG)，呤氮杂尿苷、氮杂胞苷、叠氮胸苷、二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、二脱氧次黄苷、二脱氧鸟苷、二脱氧胸苷、3′-脱氧腺苷、3′-脱氧胸苷、3′-脱氧次黄苷、3′-脱氧鸟苷、3′-脱氧胸苷)，所以用杆菌表达法制备前体药活化的抗体，并选择那些可将胸苷提供给其他缺乏胸苷的细菌的抗体。胸苷包括一个类似于氟尿苷的相似结构和上面所述的其他核苷类似物；因此，可由前体药释放氟尿苷(或任何上述所列的其他核苷类似物)的催化抗体能够从其中氟尿苷(或任何感兴趣的其他核苷类似物)已被胸苷取代的等同基质释放胸苷。对于氟尿苷基前体药，在下面说明。缺乏胸苷的杆菌与由相同的前部分(promoietg)衍生物的基质胸苷一起使用作为氟尿苷前体药；产生可分裂前营养素的催化抗体的菌落可利用释放的胸苷，并因此而存活，然后将由这些存活的菌落得到的抗体筛选分裂前体药而得氟尿苷。
抑制胸苷产生是一种阻止杆菌细胞生长的有效方法。胸苷对DNA合成来说是必不可少的，它仅可通过脱氧尿苷酸甲基化而得到。因为碱性胸腺嘧啶不存在于RNA中，所以没有必要通过降解RNA来补充胸苷库，以防止脱氧尿苷转化成胸苷而迅速停止DNA合成，因此，抑制胸苷合成的一种方法是抑制酶胸苷酸合成酶或二氢叶酸还原酶(DHFR)。氟脱氧尿苷酸是一种胸苷酸合成酶的不可逆抑制剂，但是它也促进缺陷RNA的合成，以致胸苷的抗体传递释放可不足以避免细胞死亡。氨甲蝶呤是一种DHFR的高效抑制剂，然而，四氢叶酸，酶催化还原的产物，也要求嘌呤和某些氨基酸的生物合成。然而，通过用次黄嘌呤补充生长介质来保持嘌呤库，以便氨甲蝶呤处理的杆菌以后对胸苷有特别的需要。(另一种叶酸类似物，三甲氧苄二氨嘧啶，是一个比氨甲蝶呤更有效的杆菌DHFR的抑制剂，如有必要可以使用Gilman,A.G.，等人，The Pharmacological Basis of Therapeutics(1985):1263-1268)。
选择分裂胸苷基前体药的另一种方法是使用缺乏胸苷酸合成酶的大肠杆菌的菌株(Ncihardt,F.C.,Escherichia Coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular biology(1987)。使用其中酶的表达是温度敏感的一种菌株使得所有开始生长的菌落与酶完全表达。升高温度将停止酶的表达，只有那些产生分裂胸苷基前体药的抗体的菌落才能存活。
C．环磷酰胺前体药的催化活化的筛选催化单细胞系抗体的制动术和筛选制动术制动术是按部分A所述进行。另外筛选是用无抗体的溶液进行。
筛选催化活性抗体在适合的测定缓冲器中，将前体药溶液加到抗体溶液或固定的洗涤的抗体溶液中，然后在25℃下培养一段时间，这要取决于前体药活化的未催化率，测定形成的活化药。从该溶液中取出基质溶液，测定形成产物的量，或就地测定产物。
前体药活化的测定是通过比色或荧光测定伴随前体药活化的副产物-丙烯醛来进行。
使用许多可能的丙烯醛测定方法中的一种方法，一些可能敏感的和特殊的测定方法如下1．用催化丙烯醛反应的酶测定丙烯醛。
a)可用于测定丙烯醛形成的一种酶是醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)，醇脱氢酶是市售的(Sigma Chemical Company)，并催化下列反应(其中，例如，醛是乙醛，醇是乙醇)醛+NADH(带色)+H+醇+NAD+(无色)NADH氧化成NAD+是通过集中于340nm处的颜色变化来进行。该颜色变化是用这种酶来测定其活性的一般方法。化合物，丙烯醛，将被当作醇脱氢酶的醛基质，因为它极类似乙醛，并且酶对它的基质的准确结构并不特别严格。有不同类型的醇脱氢酶可由不同物种(例如酵母和equine)而工业上得到，由不同物种得到的酶在其基质特性方面稍有不同，以致如果由一种物种得到的酶不氧化丙烯醛，而另一种却可以。
b)也可由Sigma Chemical Company大批供应的醛脱氢酶(E.C.1.12.1.5)催化的反应是类似的，其中采用醛基质，并且随着反应而发生颜色变化。在该反应中，醛被氧化成羧酸(例如，乙醛氧化成乙酸)；醛+NAD+(无色)酸+NADH(带色)+H+在这种情况下，颜色在340nm处消失，将伴随着基质的转变，因为NAD+被转化成NADH，而不是如醇脱氢酶的情况用相反的方法。
c)第三种可能的酶连结的测定方法使用醇化酶(E.C.1.1.3.13)和过氧化酶(E.C.1.11.1.7)，用分子氧醇氧化酶可将醛转化成羧酸，并产生过氧化氢；醛+O2酸+H2O2醇氧化酶是市售的(Sigma Chemical Company)，并且根据公开的文献将接受丙烯醛作为基质(Guibault,G.G.,Handbook of EnzymaticMethods of Analysis(1976):244-248，New York:Marcel Dekker)。由醇氧化酶形成过氧化氢是通过将过氧化酶(Sigma Chemical Company)与发色过氧化酶基质邻联茴香胺一起加入反应混合物来监测，过氧化酶将催化下列反应；H2O2+邻联茴香胺H2O+“带色产物”带色产物用分光光度计在456nm处可见到。
2．用荧光或发色醛反应试剂测定催化作用在这种测定方法中，丙烯醛与市政售的醛反应试剂(由例如Moleculer Probes,Inc.,Eugene,OR,USA得到)非催化反应生成一种带色的或荧光衍生物。用高效液体色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC)分离与丙烯醛的反应产物，用标准的吸附或荧光方法测定。
一种可能的试剂是丹酰肼(Molecular Probes,Inc.)
丹酰肼在温和条件下与醛反应得到荧光产物(Eggert,F.M.等人，J.Chromatogr.333(1985):123；Avigad,G.,J.Chromatogr.139(1977):343)，该产物可低浓度下用反应混合物的TLC或HPLC测定。
由于较低的测定限制、较大的反应专一性或更温和的反应条件，从而比丹酰肼更有效的其他试剂是市售的其他荧光酰肼例如香豆素酰肼，荧光素氨基硫脲(Molecular Probes,Inc)。比较这些试剂可看出哪个最适合这些特殊要求。
D．由前体药释放阿霉素的催化抗体的筛分1．本底阿霉素前体药的活化可用两种基本的方法测定；通过观察伴随前体药化学转化成活性药的内在物理变化而体外测定，或通过生物筛选活化药的毒性效应而体内测定。
2．筛选用部分A所述的制动方法筛选单克隆细胞系上清液中的抗体，或者用薄层色谱法(TLC)或高效液体色谱法(HPLC)的标准方法筛选由腹水提纯的抗体。通常，该反应混合物含有200微摩尔前体药、约1微摩尔抗体、140mM氯化钠，并在pH7.4下在10mM HEPES缓冲剂中缓冲，也测定组分浓度和pH的变化。一般另一个pH值是pH5.0(其中MES缓冲剂替代HEPES)和pH9.0(其中Tris缓冲剂替代HEPES)。温度一般在25℃，但是如果在较高的温度下前体药的本底(未催化的)水解不显著增加，则升高温度。
阿霉素，其前体药形式和分裂的钝化的前部分都可用吸附或荧光测定。阿霉素，和可能的阿霉素前体药都强吸收紫外光和可见光(最大吸收(甲醇)233、252、288、479、496、529nm)，芳烃钝化的前部分在260-280nm和220nm处强吸收紫外光。
用TLC观察抗体催化的前体药活化是用提纯的抗体，或用本文所述的96孔板早期筛选测定方法用细胞培养上清液中不纯的抗体进行。阿霉素前体药活化的TLC是用造成药和前体药在TLC板上分离的标准方法进行。当阿霉素前体药水解形成游离阿霉素时，伯氨基暴露在药上。通过适当地选择TLC基质和溶剂系统，很容易从活性药分离其前体形式。TLC分离的药和前体药的测定是可目测的桔红色或利用紫外线发射光通过阿霉素的自然荧光检测。另外，当前体药活化发生时，一个游离的羧基在剩下的芳烃前部分中形成，该芳烃前部分提供了这个新形成化合物的特性，该特性使得能够通过TLC来分离前体药和阿霉素。
活性药形成的筛选也可通过HPLC在标准条件进行。用在线吸附或荧光测定器进行前体药的消耗或药或前部分的形成的可见的和紫外线测定。在反相柱上用最适合于最佳分离的普通溶剂系统分离前体药、药和释放的前部分。最佳化的条件是反相柱的类型、溶剂流速、溶剂混合物组成和洗脱形式(等效洗脱或梯度洗脱)。
3．选择阿霉素是一种一般的细胞毒素，该细胞素对细菌的和哺乳类动物的细胞有毒性。筛选抗体释放的阿霉素的生物效应允许产生大量催化活性前体药活化的抗体的细胞系(细菌的或杂交瘤)的识别。前体药没有细胞毒性，则只有那些产生前体药活化的抗体的细胞系被该前体药杀死。这个概念类似于本文所述的通过筛选对β-内酰胺抗生素提高的抵抗力及通过缺乏胸苷合成酶的催化抗体细胞系通过前体药分裂而产生胸苷的能力来生物选择细胞系。在阿霉素前体药的情况下，筛选不同于对前体药活化引起自杀而细胞死亡的选择(而不是对催化抗体给与的增强的生存能力)，因此，在生物筛选阿霉素制备的情况下，将每个细胞系的等分试样保存在一边，而不用于筛选，所以在选择期间，产生细胞系的催化抗体不损失。实际上，一系列产生抗体的单克隆细胞(杂交瘤或细菌)的菌落易受到前体药的连续稀释的影响。在取决于剂量的方式中显示出对死亡提高了敏感度的那些细胞系被进一步研究；那些抗体在纯的状态被进一步分离和特征化，另外，代替给于相同细胞系的一系列菌落的前体药的的连续稀释单剂量前体药以一定的浓度给药，该浓度是在实验期间根据抗体作用的任意决定的最低满足的动力速率带来大致残废来计算的。
E．筛选左旋苯丙氨酸氮芥前体药的催化剂活化的抗体在早期阶段在杂交瘤上清液中用96孔板制动技术(叙述于部分A中)筛选抗体，或在后期阶段由鼠腹水筛选，在任何一种情况下，催化作用可用基质和产物的HPLC分离的一般方法测定。基质(前体药)和产物(药和前部分)都是芳族的，并可用连有HPLC装置的UV测定仪在低量下测定。在早期筛选的情况下，取出孔中的等分试样，接着用抗体适当培养一段时间并回收及注入HPLC中。同样，对于腹水的抗体，将反应的等分试样注入HPLC中，并进行基质和产物分离以及测定和定量。
制剂和给药本发明也包括药物组合物，混合物和治疗癌和其他肿瘤的方法。更确切地说，本发明包括含有免疫结合物(靶蛋白和催化蛋白)，或靶抗体和催化抗体(双特异性抗体)的混合物，和相应的用于治疗肿瘤的方法中的前体药，其中哺乳类动物宿主以药物可接受的方式用药物有效量的靶蛋白催化蛋白结合物或双特异性抗体和药物有效量的前体药来治疗。本发明的混合物和方法可用于治疗人和动物。
在一个好的实施方案中，在加入前体药给宿主给药之前，将免疫结合物给药。然后在免疫结合物和前体药给药之间给出足够的时间，使免疫结合物的靶蛋白能够瞄准和集中于肿瘤部位。该足够时间可在4小时至1星期范围，这将取决于所用的结合物。在结束免疫结合物给药和开始前体药给药之间的时间是变化的，这要取决于将要作为靶的部位和免疫结合物和前体药的性质，以及其他因素，例如病人的年龄和身体状况。为了达到所需的治疗效果，有必要多于一次的前体药给药，因此，在前体药给药之前，为了达到在靶部位免疫结合物的浓度最大，在病人的其他地方浓度最小，通常需要准确的方法来实验测定，在这种方法中，可达到最佳的选择治疗效果。
免疫结合物可用任何方式给药，优选肠胃外给药，例如，通过注射或输注。这些化合物可用给药的常规方式给药，这些方式包括，但不限于此，静脉内、腹膜内、口腔、淋巴管内给药，或直接给药于肿瘤。静脉内给药是特别有利的。
含有免疫结合物或前体药的本发明的组合物可以是各种剂形，其包括，但不限于此，液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、栓剂、聚合微囊剂或微囊剂、微脂粒剂和可注射或可输注溶液。优选的剂形取决于给药的形式和治疗的应用，例如。抗体-酶结合物或双特异性抗体的口腔给药是不利的，因为如果采取口腔给药。例如片剂、则结合蛋白将在胃中降解。
用于肠胃外给药的免疫结合物或前体药的适合制剂包括每个组分在含油或含水赋形剂中的悬浮液、溶液或乳液，这些制剂任意地含有配制剂，例如悬浮、固定和/或分散剂，另外，免疫结合物或前体药是粉剂形式。则在使用前用适合的赋形剂，例如，无菌无热源水重新构成。如果需要，免疫结合物抗体和/或前体药以单元剂量形式存在，一般在注射用的等渗盐水中制备制剂。
本发明的组合物的最有效的给药方式和剂量制度取决于疾病的严重程度和过程、病人的健康状况和对治疗的反应和治疗医师的判断。因此，免疫结合物和前体药的剂量要确定给个体病人。
然而，本发明的免疫结合物的有效剂量在约1.0至100mg/m2范围内。本发明的前体药的有效剂量将取决于所用的特定前体药和衍生出前体药的母药。要被给药的免疫结合物和前体药的准确剂量将取决于给药的方式、病人的体重和病状、前体药的性质和免疫结合物的催化性质。因为前体药比母药的细胞毒性更小，所以可使用超过本专业对母药所认为的那些剂量。
前体药是以通常用于药本身给药的剂量给药，但优选以较低的剂量给药，例如约0.001至0.5倍的单独药的通常给药剂量。
本发明的另一个实施方案提供了一种利用几种前体药和仅一种单独的抗体-酶结合物的结合化学治疗的方法。根据这个实施方案，使用一些前体药，这些前体药都是免疫结合物中相同酶或催化抗体的基质，因此，一种特殊的抗体-酶结合物或双特异性抗体将一些前体药转化成细胞毒性形式，在肿瘤部位得到了提高的抗肿瘤活性。
本发明的另一个实施方案包括使用一些其中抗体的特性不同的免疫结合物。即，使用一些免疫结合物，每一种免疫结合物含有一种特殊地结合到所关心的肿瘤上的不同抗原上的抗体。这些免疫结合物的酶组分是相同的或可以不同。该实施方案特别适用于这种情况。即肿瘤表面上各种抗原的量是未知的，并且人们想肯定足够的酶集中于肿瘤部位。使用一些对肿瘤具有不同抗原特性的结合物，增加了在肿瘤部位得到足够酶来转化前体药或前体药系列的可能性。另外，本实施方案对达到高程度的对肿瘤的特殊性是重要的，因为通常细胞组织将具有所有相同的肿瘤结合的抗原的可能性是小的[cf.,I.Hellstrom等人，“Monoclonal Antibodies To Two Determinants of Melanoma-AntigenP97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity”,J.Immunol.127(No,1),(1981):157-160]。
在某些具有许多转移损害的病人中，验证肿瘤影像是困难的，由于肿瘤细胞的异种性，其中只有一些细胞表达靶抗原。在这样的肿瘤中，已知其中存在肿瘤内或肿瘤中的异种性，使用识别不同肿瘤抗原的单克隆抗体的闪烁液活化前体药。在其中存在抗原异种性的情况下，这种方法提供了在肿瘤部位达到药的较高总浓度的可能性(Wahl,R,Cancer Research,Suppl.,(1990):941s-948s)。
下列实施例说明(但不限于此)本发明的方法和组合物。在临床治疗中通常所遇到的对本专业熟练技术人员来说是显而易见的各种条件和参数的其他适当改进和修改都在本发明的精神和范围内。
实施例实施例1a制备前体药，线性三甲基苯甲酰基-，三甲氧基苯甲酰基-，和5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷，化合物1a,lb,和1c。
5′-O-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-5-氟尿苷1a,5′-O-(2,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1b，和5′-O-(2,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1c。(为了个别查阅，下面正文中黑体的化合物编号代表图中所示的合成路线中的化合物)，对于本实施例中黑体编号的化合物参考图1a和1c。
5′-O-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-5-氟尿苷1a和5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1b是通过2,4,6-三甲基苯甲酰氯和3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯与2′,3′,-O-异亚丙基-5-氟尿苷65(实施例16中制备的)在吡啶中反应，接着在65℃下用50％甲酸酸解来实现。
5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1c的制备是通过2,6-二甲氧基苯甲酰氯与化合物65在吡啶中反应，然后在65℃下用50％甲酸酸解来实现。
具体的合成如下5′-O-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-5-氟尿苷1a将328mg 2,4,6-三甲基苯甲酸和3ml亚硫酰氯的混合物在室温下搅拌2小时，真空蒸出挥发组分，将残留物溶于5ml CH2Cl2再真空蒸出挥发组分，得到2,4,6-三甲基苯甲酰氯。
从151gm 2′,3′-O-异亚丙基-5-氟尿苷，实施例16的化合物65中分三次蒸发无水吡啶(10ml)，将吡啶(1ml)，加入到残留物中，混合物在冰浴中冷却，逐滴加入456mg 2,4,6-三甲基苯甲酰氯在4ml CH2Cl2中的溶液，加完后1小时加入1ml MeOH，放置16小时后，真空下蒸出挥发组分，残余物于乙酸乙酯(75ml)中，用饱和NaHCO3(2×50ml)和水(25ml)洗涤，在无水MgSO4上干燥，真空浓缩，用闪蒸色谱法(50％乙酸乙酯/己烷，Rf0.63)提纯，得到142mg无色固体产物。1H NMR(DMSO-d6)δ1.27(s,3),1.48(s,3),2.18(s,6),2.22(s,3),4.30(m,1),4.45(m,2),4.81(m,1),5.10(dd,1),5.78(d,1),6.87(s,2),8.05(d,1),11.97(d,1),将440mg上述丙酮化合物在6ml 50％甲酸中的混合物在65℃下加热2小时，真空下蒸出挥发组分，残留物(408mg)具有1H NMR(DMSO-d6)δ2.13(s,6),2.19(s,3),3.92(m,1),4.05(m,2),4.44(m,2),5.72(d,1),6.83(s,2),7.81(d,1),11.82(bs,1)残留物用C18柱反相HPL提纯(用40％CH2CN/H2O洗脱)得到260mg无色固体产物，化合物1a。
5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1b。
将0.604g 2′,3′-异亚丙基-5-氟尿苷，实施例16的化合物65从吡啶中共沸除去水分后溶于4ml无水吡啶中，冷却至0℃。在0℃下在在1小时内逐滴加入0.92g 3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯在4ml二氯甲烷中的溶液，在0℃下再搅拌1小时后，得到的混合物通过加入0.92g 3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯在4ml二氯甲烷中的溶液，在0℃下搅拌1小时后，得到的混合物通过加入7.5ml甲醇而急冷，将混合物蒸发至浆状，然后溶于乙酸乙酯(75ml)中，用饱和碳酸氢钠(2×75ml)和水(50ml)洗涤，然后用闪蒸色谱法，用乙酸乙酯/己烷洗脱，提纯粗制混合物，得到0.30g 5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-2′,3′-异亚丙基-5-氟尿苷1H NMR(DMSO-d6)δ1.32(s,3),1.52,(s,3),3.73(s,3),3.85(s,6),4.40(m,1),4.53(m,2),4.94,(m,1),5.09(m,1),5.77(d,1),7.22(s,2),8.01(d,1),11.90(d,1).
将0.30g 5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-2′,3′-异亚丙基-5-氟尿苷溶于4.2ml 50％含水甲酸中，在65℃下搅拌加热2小时。真空下浓缩混合物，然后用闪蒸色谱法(用乙酸乙酯洗脱)提纯，得到0.15g 5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1b1H NMR(CH3CN)δ3.81(s,3),3.86(s,6),4.15-4.28(m,3),4.53(dd,1),4.63(dd,1),5.75(d,1),7.30(s,2),7.59(d,1)5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1c在氩气氛下和0℃下将2,6-二甲氧基苯甲酰氯(0.4g,4mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液通过一个注射管滴加到化合物65(0.45g,1.5mol)的吡啶(3ml)溶液中，得到的混合物在该温度下搅拌4小时，反应完成后，将甲醇(3ml)加入到反应混合物中，真空除去溶剂。将得到的特质溶于乙酸乙酯(75ml)中，用碳酸氢钠(2×20ml)在水(20ml)中的饱和溶液洗涤，分出有机层，干燥，浓缩，闪蒸色谱提纯得到油状物质的偶合化合物(0.66g,95％,RF,0.64,二氧化硅，二氯甲烷，甲醇己烷，80,1,19)。
1H NMR(DMSO-d6):8.98(bs,1H),7.56(d,1H),7.32(m,1H),6.56(d,2H),5.92(m,1H),4.82(m,2H),4.72(m,1H),4.62(m,2H),4.40(m,1H),3.80(s,6H),1.61(s,3H),1.40(s,3H).
在65℃和氩气氛下将上述化合物(0.47g 1mmol)的甲酸(50％,6ml)溶液搅拌加热2小时，反应完成后，真空除去溶剂，得到的物质用反相HPLC提纯得到化合物1c(0.27g,65％)1H NMR:7.82(d,1H),7.38(1,1H),6.62(d,2H),5.80(d,1H),4.52(dd,2H),4.16,(m,3H),3.86(s,6H).
实施例1b制备实施例1a中前体药1b的半抗原，三甲氧基苯甲酰-5-氟尿苷的线性膦酸酯，化合物4。对于本实施例中黑体编号的化合物参考图1b。
将尿苷在5位上碘化得到碘化物3a(Robins,J.M.，等人，Can.J.Chem.60(1982):554-557)，保护羟基得到碘化物3C。3-丁炔-1-醇在4个步骤中转化成炔3d，炔3d和碘化物3c用Pd(Ⅱ)催化剂偶合得到核苷类似物3e(Robins,J.J.，等人，J.Org.Chem.48(1983):1854-1862)。选择地脱去保护得到醇3f。
按照J.Med.Chem.32(1989):1580-1590所述方法，二苄基3,4,5-三甲氧基苯基膦酸酸酯2可在四(三苯基膦)钯(O)，三乙胺和甲苯存在下在高温下通过3,4,5-三甲氧基溴代苯与亚磷酸二苄酯反应来制备。二酯2与1当量PCl5反应得到一氯化物2a，一氯化物2a与醇3f反应得到二酯3g，还原和碱水得到半抗原4，半抗原4可通过伯氨基健合到载体蛋白上。
具体的合成如下5-碘代尿苷3a按照Robin,M,J.，等人，Can J.Chem.60(1980):554-557的方法(在此引入作为参考)制备5-碘代尿苷。
5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-碘代尿苷3b将咪唑(216mg)加入到冰浴冷却的三醇3a(490mg)和叔丁基二甲基氯硅烷(239mg)在1ml DMF中的混合物中，将该混合物加热至室温，16小时后，将混合物倒入0.1M HCl(25ml)中，用乙酸乙酯萃取(3×50ml)，用水洗涤含水相，在无水MgSO4上干燥，真空浓缩，用闪蒸色谱法(7％MCOH/CH2Cl2)提纯得到460mg无色固体的产物1H NMR(DMSO-d6)δ0.08-0.12(m.6),0.90(s,9),3.72(dd,1),3.80(dd,1),3.90(bs,2),4.02-3.98(m,1),5.76(d,1),7.93(s,1),11.74(bs,1).
5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′,3′-O-3-N-三(4-甲基苯甲酰基)-5-碘代尿苷3c从450mg三醇36中真空蒸出无水吡啶(3×15ml)，将残留溶于15ml吡啶中加入650μl三乙胺，接着加入612μl 4-甲苯酰氯，混合物在50℃下加热5小时，将混合物冷却至室温，另外加入410μl三乙胺和390ml 4-甲苯酰氯，继续加热16小时，然后真空蒸出挥发组分，将残留溶于氯仿(50ml)中，用1M HCl(3×50ml)和水(2×50ml)洗涤，真空浓缩，用闪蒸色谱法(30％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到534mg无色固体产物。
1H NMR(CDCl3)δ0.33(s.6),1.07(s,9),2.35(s,3),2.38(s,3),2.41(s,3),4.06(bs,2),44.7(bs,1),5.58(dd,1),5.73(d,1),6.57(d,1),7.13(d,2),7.15-7.25(m,4),7.79(d,4),7.90(d,2),8.34(s,1).
4-(4-甲苯磺酰氧)-1-丁炔将三乙胺(12.2ml)逐滴加入到冰浴冷却的3-丁炔-1-醇(5.09g)和4-甲苯磺酰氯(16.95g)在50ml CH2Cl2中混合物中，将混合物升温至室温，21小时后，将混合物倒入乙酸乙酯(150ml)中，用0.1M HCl(75ml)饱和NaHCO3(75ml)和盐不(75ml)洗涤，有机相在无水MgSO4上干燥，真空浓缩，用闪色谱法(10％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到16.57g无色固体的产物。
IR(净)3293,3067,2963,2925,2125,1734,1599,1496,1465,1360,1308,1293,1246,1190,1176,1098,1021,982,906,817,769,665cm-1,1H NMR(CDCl3)δ1.93(t,1),2.41(s,3),2.52(dt,2),4.06(t,2),7.32-7.28(m,2)7.79-7.75(m,2).
N-(3-丁炔基)邻苯二甲酰亚胺将邻苯二甲酰亚胺钾(2.56g)加入到上述甲苯磺酸盐(1.34g)在20mlDMF中的混合物中，混合物在50℃下加热6小时，将混合物冷却，并在乙酸乙酯(2×100ml)和1M HCl(25ml)之间分配，在无水MgSO4上干燥有机相，真空浓缩，用闪蒸色谱法(15％乙酸乙酯/己烷)提纯。得到1.1g无色固体产物。
IR(KBr)3459,3253,1767,1703,1469,1429,1402,1371,1337,1249,1210,1191,1116.1088,996,868,795,726cm-1,1H NMR(CDCl3)δ1.96(t,I,J=2.7)2.62(dt,2),J=2.7,7.1),3.88(t,2,J=7.0),7.74-7.71(m,2),7.87-7.84(m,2)；13CNMR(CDCl3)18.31,36.49,70.23,80.23,123.33,131.94,134.01,167.98.
4-苄氧基羰基氨基-1-丁炔3d将水合肼(268μl)加入到上述邻苯二甲酰亚胺(1.1g)在20ml乙醇中的混合物中，将混合物回流加热1.5小时，混合物冷却至室温，通过加入1M HCl使粘性的沉淀物分散，然后形成一种无色固体沉淀物，真空蒸出乙醇，过滤出固体，用水洗涤，冻干水相得到0.93g无色固体。
1H NMR(CD3OD)δ2.52(t,I,J=2.7),2.59(dt,2,J=2.7,6.8),3.08(t,2,J=6.7)；13C NMR(CD3OD)δ17.99,39.57,73.11,79.44.
将该固体溶于40ml 50％MeOH/水中，加入766μl三乙胺，然后加入苄氧基羰基琥珀酰亚胺(1.82g)在10ml MeOH中的溶液，1.5小时后另外加入1g苄氧基羰基琥珀酰亚胺，加入三乙胺使pH保持在9以上，再过1.5小时后，加入1M HCl使pH调至5，真空除去挥发组分，残留物用闪蒸色谱法(2.5％MeOH/CH2Cl2)提纯，得到0.82g产物。
IR(净)3416,3299,3066,30342949,2199,1703,1526,1455,1367,1333,1251,1216,1141,1073,1021,1001,913,824,777,753,739,698,645cm-1；1HNMR(CDCl3)δ2.00(t,I,J=2.5),2.41(dt,2,J=2.3,6.2),3.37(q,2,J=6.3),5.12(s,2),7.32-7.38(m,5)；13C NMR(CDCl3)δ19.77,39.61,66.71,70.00,128.05,128.38,128.44,136.33,156.16.
5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′,3′-O-3-N-三(4-甲基苯甲酰基)-5-(4-N-苯甲氧酰氨基丁炔基)尿苷3e在50℃下将碘代化合物3c(10g,12mmol)、炔3d(4.8g,2eq)、(Ph3P)2PdCl2(200mg)和CuI(200mg)在三乙胺(60ml，脱氧的)中的溶液加过夜，反应完成后，真空下除去溶剂，将残留物溶于氯仿中，用乙二胺四乙酸二钠(5％,2×30ml)洗涤，干燥，浓缩。用闪蒸色谱法提纯产物得到油状化合物3e(8g,73％,Rf0.26，乙醚和二氯甲烷4∶96)。
1HNMR:8.20(s,1H),7.90(d,2H),7.80(t,4H),7.38(m,5H),7.22(t,4H),7.12(d,2H),6.60(d,1H),5.72(d,1H),5.69(t,1H),5.40(t,1H,NH),5.16(bs,2H),4.42(s,1H),4.06(s,3H),3.41(m,2H),2.62(t,2H),2.42(s,3H),2.40(s,3H),2.36(s,3H),1.02(s,9H),0.62(s,6H).
制备羟基化合物3f在0℃和氩气氛下，将氟化四丁铵(1M,1.2ml)溶液加入到甲硅烷基化合物3e(0.91g,1mmol)的THF(5ml)溶液中，并搅拌2小时，反应完成后，真空除去溶剂，产物用闪蒸色谱法提纯，得到羟基化合物3f。(0.64g,86％,Rf,0.41，乙酸乙酯，己烷1∶1)。
1H NMR:8.46(s,1H),7.92(m,6H),7.32(m,6H),6.40(d,1H),5.82(m,2H),5.32(bs,1H),5.16(bs,2H),4.42(s,1H),3.98(ABq,2H),3.42(m,2H),3.20(m,2H)2.60(m,2H),2.42(s,3H),2.40(s,3H),2.36(s,3H).
3,4,5-三甲氧基苯基膦酸二苄酯2按照Tetrahdron Lett.26(1985):5939-5942的方法由3,4,5-三甲氧基苯甲酸制备3,4,5-三甲氧基溴苯，按照J.Med.Chem.32(1989):1580-1590的方法在四(三苯基膦)钯(O)、三乙胺和甲苯存在下，亚磷酸二苄酯与3,4,5-三甲氧基溴苯一起加热，得到3,4,5-三甲氧基苯基膦二苄酯2。
3,4,5-三甲氧基苯基膦酸二苄酯2a将五氯化磷(1.15mmol)加入到二酯2(1mmol)在5ml CHCl3中的混合物中，在60℃下加热混合物，直到等分试样的1H NMR显示出没有剩余初始物质(约4小时)。将混合物冷却至室温，真空除去挥发组分过夜。
膦酸酯3g在室温下将氯化物2a(1mmol)在4ml CH2Cl2的溶液加入到醇3f(1mmol)和DMAP(1.5mmol)在4ml CH2Cl2的溶液中，当通过TLC观察到原料反应完时，真空蒸发除去溶剂，用闪蒸色谱法提纯产物。
5-(4-氨基丁基)-5′-O-(3,4,5-三甲氧基苯基磷酰基)尿苷4在室温和氢气氛下，搅拌核苷衍生物3g(1mmol)和5％Pd-C(10重量％)在10ml甲醇中的混合物直到氢气完全吸收，通过硅藻土层过滤除去催化剂，用甲醇洗涤，用冰浴冷却滤液，将无水氨鼓泡通过该溶液20分钟，真空除去挥发组分，用反相HPLC提纯产物。
实施例1c制备实施例1a中前体药1a的半抗原，三甲基苯甲酸-5-氟尿苷的线性膦酸酯，化合物4a。
对于本实施例中黑体编号的化合物参考图1d在四个步骤中由溴化开始制备中间体磷氯化物2d，溴代用在THF中的正丁基锂处理，接着加入二乙基磷氯化物得到膦酸酯化合物2b，用三甲基甲硅烷基碘处理化合物2b，接着用稀释的HCl处理，得到相应的二羟基化合物2C。在50℃下用氯仿中的PCl5处理化合物2C，得到磷氯化物2d，在DMAP存在下在二氯甲烷中将化合物3f与磷氯化物2d结合，得到化合物3h。用Pd-C在乙酸乙酯中将化合物3h加氢，得到脱苄基的化合物，该化合物用无水氨处理得到半抗原4a。
具体合成如下2,4,6-三甲基苯基膦酸二乙酯2b在氩气氛和-78℃下通过一个注射管将正丁基锂(1.6M,16ml)溶液逐滴加入到2-溴代(4g,20mmol)在无水THF(100ml)的溶液中，并搅拌1小时，1小时后，加入碳氯化物(4.12g,1.2eq)的THF(10ml)溶液，搅拌1小时。反应完成后，将氯化铵溶液(10％,20ml)加到混合物中，并搅拌30分钟，分出有机相，干燥，浓缩，产物用闪蒸色谱法提纯，得到油状磷酸酯2b(1.75g,34％,Rf,0.34,乙酸乙酯，己烷，1∶3)。
1H NMR:7.42(m,10H),6.92(d,2H),4.16(m,4H),2.62(s,6H),2.32(s,3H)1.32(t,6H).
2,4,6-三甲基苯基羟基膦酸苄酯2c将二乙基磷酸酯2b(1.5g,5.8mmol)和三甲基甲硅烷基碘(2.4g,12mmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液在0℃下搅拌1小时。反应完成后，加入硫代硫酸钠(5％,5ml)，搅拌15分钟。分出有机相，干燥，浓缩得到一种油状化合物，将得到的化合物溶于THF(5ml)中，并与稀释的HCl(5％,5ml)一起搅拌1小时，分出有机相，干燥，浓缩得到油状羟基化合物(1g,85％)。
1H NMR:11.00(bs,2H),7.62(d,2H),3.32(s,6H),2.96(s,3H).
在氩气氛下，将二羟基化合物(1g,5ml)、苄醇(1.6g,3eq)和三氯乙腈(4.3g,6eq)在吡啶(15ml)中的溶液在75℃下加热过夜。反应完成后，真空除去溶剂，用闪蒸色谱法提纯产物，得到油状的单苄基化化合物2c(0.72g,50％,Rf,0.36,甲醇，二氯甲烷，1∶9)。
1H NMR:12.20(bs,1H),7.32(m,5H),6.92(d,2H),5.06(d,2H),2.64(s,6H),2.32(s,3H).
2,4,6-三甲基苯基膦酰氯苄酯2d将羟基化合物2c(0.58g,2mmol)、PCl5(0.56g,2mmol)的氯仿(10ml)溶液在50℃下加热2小时。反应完成后，除去溶剂，真空干燥化合物。
1H NMR:7.42(m,5H),6.92(d,2H),5.42(m,2H),2.72(s,6H),2.42(s,3H).
化合物3h在氩气氛下将磷氯化物2d(1.51ml,1.3eq)的二氯甲烷溶液通过一个注射管加入到羟基化合物3f(300mg,0.38mmol)、DMAP(61mg,0.5mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液中，反应完成后真空除去溶剂，用闪蒸色谱法提纯得到3h(138mg,33％，Rf,0.42，二氯甲烷/乙酸乙酯/己烷，3∶3∶4)。
1H NMR:7.82(m,4H),7.20(18H),6.42(t,2H),6.18(t,1H,NH),5.72(9m,1H),5.42,(m,1H),5.02(m,5H),4.24(m,3H),3.42(m,4H),2.62-2.40(单峰，Me,18H).
5-(4-氨基丁基)-5′-O-(2,4,6-三甲基苯基膦酰基)尿苷4a在Pd-C(10％,15mg)存在下在氢气氛下将化合物3h(156mg,0.14mmol)在乙酸乙酯(2ml)中的悬浮液搅拌2小时，反应完成后，过滤除去催化剂，除去溶剂得到氢化化合物(70mg,56％)。
在密封的管中将该氢化化合物(70mg,0.08mmol)、氢氧化铵(5ml)的甲醇(4ml)溶液加热一整夜，反应完成后，真空除去溶剂，用反相HPLC(乙腈(1)和水(99))提纯产物，得到无色固体的纯化合物4a(14mg,37％)。
1H NMR:7.92(s,1H),6.92(d,2H),6.02(d,1H),4.32(t,1H),4.18(m,1H),4.08(m,1H),3.92(m,1H),3.53(m,1H),3.00(m,2H),2.62(s,6H),2.22(s,3H),2.42(m,2H).
实施例2a制备前体药，分子内三甲氧基苯甲酸-5-氟尿苷，化合物10。
对于本实施例中的黑体编号化合物参考图2a。
将溴代苯甲酸5(其制备叙述于实施例8a中)进行锂-卤素交换，并用保护碘代乙醇7(见图2a)烷基化，将产物8脱水形成对称酐，该酐与5-氟尿苷反应生成稳定的前体药前体9，该前体的保护基可迅速除去，得到前体药10。
具体合成如下2-溴乙基-4,4′-二甲氧基三苯基甲醚6在室温下DMAP(100mmol)加到2-溴代乙醇(100mmol)和4,4′-二甲氧基三苯基甲基氯化物(100mmol)的DMF(100ml)溶液中，16小时后，将混合物倒入水(300ml)中，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取，有机相用水(100ml)洗涤，在无水Na2SO4上干燥，真空下浓缩。用闪蒸色谱法提纯混合物，得到无色固体产物。
4,4′-二甲氧基三苯基甲基2-碘代乙醚7将溴化物6(10mmol)和NaI(10mmol)在100ml丙酮中的溶液在蔽光下回流加热2小时，得到的混合物冷却至室温，过滤除去固体，从溶液中真空蒸出溶剂，得到的黄色油状物不经进一步提纯就可使用。
2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]-3,4,5-三甲氧基苯甲酸8将叔丁基锂(在正戊烷中的1.7M溶液，15mmol)加到溴化物5(5mmol)在50ml THF中的溶液中，同时保持混合物的温度低于-95℃。加完后，将混合物升温至-78℃，30分钟后，一次加入碘化物7。将混合物升温至0℃，加入水(50ml)，然后用0.1M HCl将混合物的pH小心地调至3。用乙酸乙酯(3×100ml)萃取混合物，有机相在无水Na2SO4上干燥，真空浓缩，用闪蒸色谱法提纯混合物，得到无色油状产物。
5′-O-[2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]-3,4,5-三甲氧基苯甲酰基]-5-氟尿苷9
在室温下将DCC(2.5mmol)在10ml CH2Cl2中的溶液加入到酸8(5mmol)在10ml CH2Cl2中的溶液中。1小时后，从混合物中过滤分出固体，用5ml CH2Cl2洗涤固体，将5-氟尿苷(2.5mmol)和1-羟基苯并三唑(0.25mmol)在10ml CH2Cl2中的混合物加入到合并的有机相中，当通过TLC观察到反应完成时，真空浓缩混合物。用闪蒸色谱法提纯混合物，得到无色固体产物。
5′-O-[2-(2-羟乙基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰基]-5-氟尿苷10在室温下将醚9(0.1mmol)一次加入到80％含水乙酸(10ml)中，15分钟后，将混合物倒入饱和NaHCO3(100ml)，用乙醚(3×100ml)萃取。合并的有机相用100ml 5％NaHCO3分批洗涤，直到不再有气体放出，然后用盐水(100ml)洗涤有机相，在无水Na2SO4上干燥，真空浓缩。混合物用闪蒸色谱法提纯，得到产物。
实施例2b制备实施例2a中前体药的半抗原三甲氧基苯甲酸-5-氟尿苷的环膦酸酯，化合物15。
对于本实施例中黑体编号的化合物，参考图2b。
按照一般的方法将膦酸芳基酯11进行溴化、锂化、羟烷基化和环化来合成环膦酸酯13。在65℃，将膦酸酯皂化、氯化，并与2′,3′-O-异亚丙基-5-氟尿苷65反应，接着用50％甲酸酸解，得到半抗原15。
具体合成如下3,4,5-三甲氧基苯基膦酸二乙酯11按照制备化合物2的方法，用亚磷酸二乙酯合成化合物11。
2-溴-3,4,5-三甲氧基苯基膦酸二乙酯12将溴(10mmol)在10ml乙酸中的溶液逐滴加入到水浴冷却的酯11(10mmol)在10ml乙酸中的溶液中，生成的混合物的红色产生之后，将混合物倒入饱和NaHCO3(100ml)中，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。用100ml 5％NaHCO3分批洗涤合并的有机相，直到不再有气体放出。然后用盐水(100ml)洗涤有机相，在无水MgSO4上干燥，真空浓缩，用闪蒸色谱法提纯混合物，得到浅黄色固体产物。
2,3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基亚膦酸乙酯13将叔丁基锂(在正戊烷中的1.7M溶液，0mmol)加入到溴化物12(5mmol)在50ml THF中的溶液中，同时保持混合物的温度低于-95℃。加完后，将混合物升温至-78℃，30分钟后，一次加入磺酸亚乙酯(5mmol)。将混合物升温至室温，1小时后，加入1M HCl(50ml)，再过1小时后，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取混合物，在无水MgSO4上干燥有机相，真空浓缩，用闪蒸色谱法提纯混合物，得到无色油状产物。
2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)丁基亚膦酸14在室温下用1M NaOH使酯13(5mmol)在50ml甲醇中的溶液保持在pH12，直到通过TLC观察到原料用尽。然后用1M HCl将pH调至2，真空蒸出甲醇，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取含水混合物，在无水MgSO4上干燥有机相，真空浓缩，用闪蒸色谱法提纯混合物，得到无色油状产物。
5′-O-[2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)丁基亚膦酰基]-5-氟尿苷15将亚硫酰氯(5mmol)加到用冰水浴冷却的酸14(5mmol)在50mlCH2Cl2中，然后加到用冰水浴冷却的2′,3′-O-异亚丙基-5-氟尿苷65(5mmol)和三乙胺(15mmol)在25ml CH2Cl2中溶液中。4小时后，将混合物倒入0.1M HCl(50ml)中，进行相分离，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水相，合并的有机相在无水MgSO4上干燥，真空浓缩，混合物用闪蒸色谱法提纯，得到的异亚丙基保护的中间体，其在65℃下用50％含水甲酸(10ml)处理2小时，真空浓缩，得到5′-O-[2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)-丁基亚膦酰基]-5-氟尿苷15。
实施例3制备前体药，半乳糖基胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，化合物19。
对于本实施例中黑休编号化合物参考图3。
首先将胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷过苯甲酰化，然后分别用苯甲酰氯和氢氧化钠O-脱苯甲酰化，得到N4-苯甲酰基ara-C16，然后在三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯存在下在乙腈中与β-半乳糖五乙酸酯结合生成部分被保护的化合物17。在二氯甲烷中用乙酸酯结合生成部分被保护的化合物18，在50℃下在甲醇中用氨将化合物18完全脱去保护，得到最终产物，β-gal ara-C19。
具体合成如下N4-苯甲酰胞嘧啶-β-D阿拉伯呋喃糖苷16将在50ml无水吡啶中的1.22g(5.02mmol)胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的悬液冷却到0℃，加入10ml苯甲酰氯，在室温下搅拌混合物16小时。将混合物倒入75ml 15％碳酸氢钠水溶液中，用CH2Cl2(2×150ml)萃取，用水(50ml)洗涤有机相，在无水MgSO4上干燥，真空浓缩。将混合物溶于50ml吡淀/甲醇/水(5∶3∶2V/V)中，并在冰浴中冷却。将冷的50ml在吡淀/甲醇/水(5∶3∶2V/V)中的2M氢氧化钠加到该溶液中。在0℃下将反应混合物搅拌15分钟，然后加入氯化铵将pH调至7，真空浓缩混合物，加入20ml甲醇，过滤混合物，用更多的甲醇(3×20ml)洗涤固体，收集所有的洗液和滤液并合并起来，真空浓缩。再溶于50ml甲醇/CH2Cl2(2∶8V/V)中，用闪蒸色谱法(用甲醇/CH2Cl2(1∶9-2∶8V/V))提纯混合物，需要进行上述第二次闪蒸色谱法提纯除去所有杂质，得到1.5g(86％)N4-苯甲酰基胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷16。
1H NMR(D2O+DMSO-d6,2∶8v/v)d 8.2(1H,d,J5.67Hz,H-6),7.95(2H,d,J7Hz,O-苯H×2),7.75-7.35(4H,m,H-5和苯H×3),6.1(1H,d,J1′,2′4Hz,H-J′),4.2-3.9(3H,m,H-2′,H-3′和H4′),和3.68(2H,d,J4′,5′4Hz,H-5′).
偶联反应制备化合物17在氩气氛下用2分钟将三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(TMS tf,354mg,1.5mmol)的无水乙腈(2.5ml)溶液通过一个注射管加到半乳糖基五乙酸酯(1.17g,3mmol)和化合物16(2mmol)的无水乙腈(5ml)溶液中，然后在室温下将反应混合物搅拌1小时，TLC分析显示出原料消失，同时形成两种新化合物(TLC，乙酸乙酯)，然后用含水碳酸氢钠将反应混合物急冷，用乙酸乙酯(50ml)萃取，分离有机层，干燥，浓缩得到含化合物混合物的无色固体。将混合物闪蒸色谱法提纯，得到化合物17(0.8g,59％和Rf,0.36在氯仿中的10％甲醇)。
1H NMR(CDCl3):9.60(bs,1H,NH),8.16(d,1H),7.86-7.42(m,6H芳烃的和1H杂环的),6.20(d,1H),5.32(m,3H，乙酸酯的CHO),4.62(d,1H,J=7.6Hz,芳烃的),4.20-3.78(m,8H)3.20(bs,1H),2.62(bs,1H,2xOH,与D2O交换)，2.18(s,3H),2.04(s,6H),2.01(s,3H)乙酸酯的所有CH3.
在二氯甲烷中用乙酐DMAP将化合物17过乙酰化，得到化合物18(Rf,0.28，乙酸乙酯二次，86％)，产物用闪蒸色谱法提纯。
1H NMR(CDCl3):8.18(d,1H,J=7.5Hz),7.82-7.42(m,6H芳烃的1H杂环的),6.42(d,1H,J=5.1Hz),5.62-5.08(m,5H,乙酸酯的OCH)，4.60(d,1H,J=7.8Hz，芳烃的)，4.28-3.82(m,6H,OCH)2.18(s,3H),2.14(s,3H),2.10(s,6H),2.06(s,3H),2.00(s,3H)乙酸酯的所有CH3)。
将化合物18(0.5g,0.6mmol)的甲醇(5ml)溶液和NH4OH溶液(5ml)在50℃下加热16小时，TLC分析显示出反应完成，真空除去溶剂，粗产物进行中压反相C18色谱(用在水中的2％甲醇作为溶剂)提纯，得到β-gal Ara-C的纯无色固体(0.22g,92％)。
1H NMR(D2O):7.80(d,1H),6.22(d,1H),6.02(d,1H),4.48(d,1H,J=8.1Hz，芳烃的)，4.40(t,1H),4.24(m,2H),3.92(m,2H),3.80-3.60(m,6H).
实施例4制备前体药半乳糖基5-氟尿苷，化合物24。
对于本实施例的黑体编号化合物参考图4。
按照类似的方法合成β-半乳糖基5-氟尿苷24。在DMF中的咪唑存在下在0℃下用叔丁基二甲基氯硅烷处理5-氟尿苷，得到部分被保护的化合物20。然后在DMAP和三乙胺存在下与乙酐反应，得到完全被保护的核苷21。在0℃下用对甲苯磺酸使甲硅烷基去保护，在乙腈中的三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯存在下，生成的产物22与β-半乳糖五乙酸酯偶合，得到完全被保护的化合物23，在甲醇中在50℃下用氨完全脱去保护，得到最终产物，β-半乳糖基5-氟尿苷24。
具体合成方法如下化合物21的制备向5-氟尿苷(1.31g,5mmol)的DMF的冷却溶液中依次加入咪唑(0.816g,12mmol)和叔丁基二甲基氯甲硅烷(0.90g,6mmol)，物料在0℃下搅拌2小时。反应(TLC，在氯仿中的10％甲醇)完成后，物料送到含有乙酸乙酯(100ml)的分液漏斗中，用水洗涤(3次，每次25ml)。分离出有机层，经干燥(MgSO4)和浓缩后得到作为油状化合物的单硅烷基化产物20(Rf,0.44，在氯仿中的10％甲醇)。
将如上得到产物20(1.80g，粗品，5mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，依次添加DMAP(1.34g,11mmol)和乙酐(1.22g,12mmol)，反应混合物在室温下搅拌1.5小时，TLC分析(1∶1的乙酸乙酯∶己烷)表明反应完成。随后反应混合物送到分液漏斗中，用水洗涤，并干燥和浓缩。产物用快速色谱法提纯得到纯的化合物21(Rf,0.48,1∶1的乙酸乙酯和己烷，1.90g,83％)。
1H NMR(CDCl3):8.02(d,1H),6.26(d,1H),5.34(m,2H,乙酸酯的CHO)4.22(m,1H),3.86(ABq,2H),2.08,2.04(2×s，每个3H乙酸酯的CH3),0.92(s,9H，叔丁基甲硅烷基)，0.12(s,6H，甲硅烷基的CH3)。
13C HNMR(CDCl3):169.99,169.72,157.06,156.71,149.61,142.51,139.35,85.46,84.12,73.25,71.94,63.28,25.74,20.70,20.68,20.37,18.37-5.70化合物22的制备向化合物21(1.69g,3.5mmol)的甲醇(6ml)加二氯甲烷(12ml)的冷却溶液(0℃)中，添加催化量的PTSA(100mg)，反应混合物0℃下搅拌30分钟。反应(TLC)完成后，用三乙胺(0.5ml)骤冷，并除去溶剂，得到油状的粗化合物22(Rf,0.22,1∶1的乙酸乙酯和己烷，920mg,76％)。
1H NMR(CDCl3):8.09(d,1HJ=6.3Hz),6.14(d,1H),5.43(m,2H，酸酯的CHO),4.21(m,1H),3.86(ABq,2H),2.08,2.04(2×s，每个3H，乙酸酯的CH3)。
13CHNMR(CDCl3):170.34,170.08,157.56,149.55,139.17,86.61,83.72,73.21,71.48,61.65,20.65,20.38.
偶合化合物23的制备半乳糖五乙酸酯和化合物22之间的偶合反应用如上所述的方法完成得到偶合化合物23(Rf,0.20,1∶1的乙酸乙酯∶己烷，59％)。
1H NMR(CDCl3):9.60(bs,1H,NH),8.18(d,1H,J=6.6Hz),6.34(m,1H),5.46-5.08(m,5H，乙酸酯的OCH),4.61(d,1H,J=8.1Hz，异头)，4.30-3.72(m,6H),2.16,2.13,2.11,2.09,2.05,2.01(6×s，每个3H乙酸酯的CH3)。
13C HNMR:170.37,170.10,169.34,157.00,156.64,149.43,142.52,139.37,100.44,85.83,82.35,73.35,71.63,70.35,70.34,68.57,68.11,66.74,61.13,20.34,20.07,20.39.
前体药β-D-半乳糖氟尿苷24的制备化合物23经如上所述的同样的方法，(氨)转化为前体药化合物24(92％)。
1H NMR(D2O):8.12(d,1H),5.88(d,1H),4.44(d,1H,J=7Hz异头)，4.36-3.62(m,11H).
实施例5a在实施例3和4中的前体药的半抗原的前体，化合物25的制备对于本实施例中的黑体字化合物参见附图5a。
氨基核苷25由5-氟尿苷根据附图5a中的图解制备。化合物22(附图4)用三苯膦和四溴化碳活化，随后用叠氮钠处理形成叠氮化物中间体。该中间体随后用10％Pd-C加氢得到胺，胺接着用甲醇中的甲醇钠脱保护得到氨基核苷25。氨基核苷用于随后的偶合反应得到脒化合物30b(R=5-氟尿苷)。
具体合成方法如下5′-氨基-5-氟尿苷25的制备向5′-羟基-2′,3′-二乙酸基-5-氟尿苷22(1当量)的二氯甲烷的溶液中依次添加三苯膦(1.1当量)和四溴化碳(1.2当量)，混合物在0℃搅拌，反应完成后，产物随后用于下一步骤。
溴化物化合物(1当量)随后溶于DMF(0.2M)中，用叠氮钠(3当量)在60℃加热。反应完成后，反应混合物被送到含有乙酸乙酯的分液漏斗中。溶液用水洗涤，分离出有机层，经无水MgSO4干燥并真空浓缩。粗产物用快速色谱法提纯得到化合物25的前体的叠氮衍生物。
叠氮衍生物溶于乙酸乙酯中，加入10％钯活性性炭(0.05当量)。向搅拌的悬浮液中用充满氢气的球形瓶充入1气压的氢气。反应完成后，经硅藻土床层过滤除去催化剂，收集滤液并浓缩得到相应的化合物25的氨基前体。
氨基前体溶于甲醇中，加入甲醇钠(0.05当量)。溶液在室温下搅拌，在反应完成时添加水醛酸(0.05当量)。溶液在室温下搅拌，在反应完成时添加冰醛酸(0.05当量)，在真空下浓缩混合物。化合物25在水作溶剂的甲醇中经中压逆相C18色谱法提纯。
实施例5b在实施例3和4中的前体药的半抗原，化合物30a和30b的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图5b和5c。
脒化合物30a和/或30b(R=araC或5氟尿苷)的制备过程可以通过两种不同的合成途径完成。一种合成途径由市场上可得到的双丙酮D葡萄糖开始(附图5b，在本文实施例5b中描述)，而另一途径由葡萄吡喃糖开始(附图5c，在本文实施例5c中描述)。
由双丙酮D葡萄糖开始，第一步骤包括在DMF中的咪唑存在下用叔丁基二甲基氯甲硅烷进行羟基的甲硅烷基化过程。随后用乙酸水溶液处理得到5.6二醇，接着该二醇在伯羟基位置用叔丁基二甲基氯甲硅烷进行甲硅烷基化，另一个仲羟基在三乙胺存在下用MsCl处理转化成甲磺酰基化物。所生成的甲磺酰基化物26随后经首先在丙酮中与碘化钠反应接着在DMF中用叠氮钠处理碘衍生物转化成叠氮化合物27。通过在60℃下用乙酸水溶液处理化合物27进行丙酮基的水解。所生成的二醇在异头位置上，在二噁烷水溶液中，用溴氧化得到的内酯化合物28。化合物28的叠氮基经用10％钯/碳的加氢转化成氨基，结果重排得到葡内酰胺29a衍生物。采用Mitsunobu反应步骤进行仲羟基的转化得到半乳糖内酰胺29b衍生物。用米尔文试剂活化，随后与氨基核苷25(实施例5a)偶合，接着用氟化物进行去甲硅烷基化得到最终的脒化合物30b(R=5-氟尿苷)。
具体的合成方法如下化合物26的制备向双丙酮D葡萄糖(5.2g,20mmol)的干燥DMF(50ml)的混合物中，依次加入咪唑(3.26g,48mmol)的叔丁基二甲基氯甲硅烷(3.60g,24mmol)，反应物在室温下搅拌4小时。反应完成后，反应混合物送到含有乙酸乙酯(250ml)的分液漏斗中，用水洗涤，干燥和浓缩，用快速色谱法提纯该产物。
得到的甲硅烷基化的化合物(6.73g,17.9mmol)溶于THF(50ml)中，在乙酸水溶液(6ml)中搅拌6小时。反应(TLC)完成后，除去溶剂，产物用快速色谱法提纯。
如上得到的二醇(5.38g,16.1mmol)溶于干燥DMF(60ml)中，依次加入咪唑(2.62g,2.4当量)和叔丁基二甲基氯甲硅烷(1.2当量)，在0℃下搅拌2小时。反应完成后，反应物溶于乙酸乙酯(200ml)中，用水洗涤，并干燥和浓缩，产物用色谱法提纯。
单甲硅烷基化羟基化合物(5.6g,12.5mmol)溶于二氯甲烷(40ml)中，冷却至0℃，依次加三乙胺(2.7ml)和MsCl(1.85g,1.3当量)，反应物在0℃下搅拌3小时。反应完成后，反应物被送到分液漏斗中，用水洗涤，并干燥和浓缩，得到相应的甲磺酰基化合物26。
叠氮化物27的制备将甲磺酰基化物26(5.26g,10mmol)和碘化钠(1.93g,13mmol)在丙酮(50ml)中的混合物回流加热4小时。反应完成后除去溶剂，所得物料溶于乙酸乙酯(100ml)中，用水洗涤，并干燥，用色谱法提纯产物。
将碘化物(4.54g,8mmol)和叠氮钠(1.30g,20mmol)的干燥DMF的混合物在60℃下加热6小时。反应完成后，用乙酸乙酯(200mmol)稀释，用水洗涤，干燥并浓缩，产物用色谱法提纯得到纯的叠氮化物27。
内酯28的制备将得到的叠氮化物27(2.89g,6mmol)溶于THF(30ml)和乙酸(10ml)的水溶液中，物料在60℃下加热6小时。反应完成后，除去溶剂，所得物料溶于乙酸乙酯中，经干燥和浓缩处到二醇。
将在二噁烷中的溴(1当量)溶液添加到上述得到的在含水二噁烷(10％,20ml)的二醇(1.77g,4mmol)中，所得混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，用乙酸乙酯(50ml)稀释，用含水硫代酸钠洗涤，经干燥和浓缩得到羟基内酯。
上述的内酯的羟基如上文描述被保护成为叔丁基二甲基甲硅烷基醚得到内酯28。
内酰胺29a的制备将在甲醇(10ml)中的叠氮化物28(1.10g,2mmol)和Pd-C(10％,110mg)的悬浮液用氢气球形瓶加氢4小时，反应完成后，用硅藻土过滤除去催化剂，并除去溶剂得到内酰胺29a。
具有半乳糖构型内酰胺29b的制备上述得到的内酰胺29a按下所述转化成半乳糖内酰胺。向内酰胺29a(0.86g,1.6mmol)和乙酸(2ml)的二氯甲烷(8ml)的溶液中在0℃下依次加入三苯膦(0.419g,1.6mmol)的偶氮二羧酸二乙酯(0.295g,1.7mmol)，反应混合物搅拌2小时。反应完成后，除去溶剂，用色谱法分离出产物，得到的乙酸酯用甲醇钠水解得到半乳糖内酰胺29b。
将半乳糖内酰胺29b(1当量)，米尔文试剂(三乙氧鎓四氟硼酸盐，在二氯甲烷中的1M溶液，1.2当量)在二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌1小时。然后加入氨基核苷25(1当量)，反应完成后，用快速色谱法提纯产物。
实施例5c在实施例3和4中前体药的半抗原，化合物30a和30b的另一制备方法。
对于本实施例中的黑体字的化合物参见附图5c。
由市场上可得到的葡萄吡喃糖31开始5-氟尿苷制备半乳糖-β-5-氟尿苷。用在丙酮中的2,2-二甲氧基丙烷在催化量的对甲苯磺酸存在下处理得到保护的化合物32。剩余的羟基用叔丁基二甲基氯酸存在下处理得到保护的化合物32。剩余的羟基用叔丁基二甲基氯甲硅烷进一步保护得到全保护的化合物33。用苄基醇回流加热打开内酯，得到的羟基化合物34用MsCl甲磺酰基化，接着首先在丙酮中使用甲磺酰基与碘化钠反应，随后用在DMF中的叠氮钠以叠氮其取代碘基，以二步法转化成叠化合物35。用10％Pd/碳加氢将叠氮基转化成氨基，然后将其环化成内酰胺。用三氟乙酸处理使丙酮脱保护二醇，随后用叔丁基二甲基氯甲硅烷保护伯醇得到葡内酰胺29a。仲羟基用Mitsunobu反应步骤转化，随后用米尔文试剂和氨基核苷25(实施例5a)分别进行酰胺的活化和偶合。最后用氟化物脱保护得到脒化合物30b(R2=5-氟尿苷)。
具体合成方法如下内酯32的制备将羟基化合物31(8.90g,50mmol)2,2-二甲氧基丙烷(4当量)和PTSA(0.5g)在二氯甲烷(400ml)和丙酮(100ml)中的混合物搅拌4小时。反应完成后，用三乙胺(3ml)骤冷，除去溶剂，生成的粗化合物用色谱活提纯得到化合物32。
化合物34的制备将化合物33(13.38g,30mmol)在苄基醇(100ml)和氯仿(300ml)混合物中的溶液在60℃下加热，直到反应完成。反应完成后，除去溶剂，用色谱法分离产物得到化合物34。如果使用甲醇则得到相应的羟基甲酯。
叠氮基酯35的制备采用与用于从羟基化合物26至化合物27的相同的反应顺序将羟基化合物34转化叠氮基化合物35，以得到叠氮基化合物35。
内酰胺29a和内酰胺29b的制备经过化合物35加氢(在上文所述的条件下)、用三氟乙酸保护(参见上文)和伯醇保护得到29a，内酰胺29a用Mitsunobu反应条件(参看上文)被转化成半乳糖内酰胺。
化合物29a至脒化合物30的转化过程可用上文描述的同步步骤(参看上文)完成。
实施例6前体药，脂族二乙基缩醛保护的醛磷酰胺，化合物38的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图6
当双(2-氯乙基)胺盐酸盐用过量的三氯氧化磷一起加热时，在蒸馏后，以好的产率作为结晶固体得到二磷酰胺36。二氯酰胺36与1摩尔当量的3-羟基丙醛二乙基缩醛反应得到单氯磷酰胺，其由氨处理得到3,3-二乙氧基丙酰基N,N-双(2-氯乙基)磷酰二胺38。
具体合成方法如下N,N-双(2-氯乙基)磷酰胺的二氯化物36将双(2-氯乙基)胺盐酸盐(5g)和POCl3(13ml)的混合物回流加热12小时，在此过程中，混合物变成均相溶液，通过蒸馏(bp105℃)除去过量的POCl3，随后蒸馏4.93g产物(bp110-114℃,0.1mmHg)。从丙酮/己烷中重结晶得到4.5g无色固体产物mp:54.5-56℃(文献，54-56℃,Friedman,O.M.等人，J.Am.Chem.Soc.76(1954):655-658)；1H NMR(CDCl3)δ3.62-3.68(m,2),3.71-3.77(m,6)。
3,3-二乙氧基丙酰基N,N-双(2-氯乙基)磷酰胺氯化物37将二氯化物36(1.75g)在5ml CH2Cl2中的溶液逐滴加入到3,3-二乙氧基-1-丙醇(1.0g)和DMAP(0.91g)在10ml CH2Cl2中混合物中。19小时后，形成沉淀物，过滤排出沉淀物，真空除去挥发性组分。残余物通过硅胶短柱，先后用25％和30％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到0.95g产物Rf0.38(25％乙酸乙酯/己烷)1H NMR(CDCl3)δ1.23(f,6),2.06(q,2),3.40-3.60(m,6),3.62-3.75(m,6),4.21-4.38(m,2),4.62(t,1).
3,3-二乙氧基丙酰基N,N-双(氯乙基)磷酰二胺38无水的氨气通过氯化物37(0.95g)在10ml CH2Cl2中的溶液鼓泡20分钟，结果形成沉淀物。经过滤除去固体物，真空除去挥发性组分得到0.71g油状物。一部分粗产物(100mg)通过硅胶短柱，用在50％乙酸乙酯/己烷中的3％Et3N洗脱，得到46mg无色油状的产物Rf0.16(在30％乙酸乙酯/己烷中的3％Et3N)；IR(CDCl3)3600-3100,2976,2932,2849,1573,1446,1376,1348,1225,1132,1056,985,752,657cm-1；1H NMR(CDCl3)δ1.20(t,6),1.95(q.2),3.34-3.75(m,12),4.00-4.15(m.2),4.63(t,1).
缩醛38的稳定性缩醛38的样品在室温下溶于D2O中的0.9(重)％NaCl中，两天后未观察到1H NMR光谱的变化。
实施例7前体药的脒基半抗原，脂族二乙基缩醛保护的醛磷酰胺，化合物43的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物，参见附图7。
N-t-Boc-氨基乙基膦酸39由2-氨基膦酸与二叔丁基双碳酸酯反应制备。随后与双(2-氯乙基)胺盐酸盐在三乙胺、4-二甲基氨基吡啶和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐存在下反应得到氨基膦酸40。经过首先用1-(2-基碘酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑活化并接着与氨反应转化成磷酰二胺。用三氟乙酸保护得到42,42与N,N-乙基-O-甲基异脲四氟硼酸盐反应得到最终的胍盐产物43。
具体合成方法如下N-t-Boc-氨基乙基膦酸39将1.25g 2-氨基乙基膦酸和4.2ml三乙胺溶于10ml水中，加入2.62g二叔丁基双碳酸酯在10ml干燥乙腈中的溶液。通过添加三乙胺保持pH值为9。反应完成后，混合搅拌2小时，然后真空浓缩。残余物再溶于0.01M NaHCO3(100ml)中，用乙酸乙酯(2×50ml)洗涤，通过添加0.1M HCl调节水相pH值为1，并用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。有机相经无水MgSO4干燥，真空浓缩得到N-t-Boc-2-氨基乙基膦酸39。
N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰胺酸40将2.25g N-t-Boc-2-氨基乙基膦酸39、2.14g双(2-氯乙基)胺盐酸盐、4.2ml三乙胺和0.146g 4-二甲基氨基吡啶溶于20ml DMF/CH2Cl2(1∶1V/V)中，加入2.3g 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐混合物在室温下搅拌16小时。混合物注入1M NaOAc,pH5(75ml)中，用乙醚(2×75ml)洗涤。水相用1M HCl调节pH1后直接用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。有机相用水(20ml)洗涤，经无水MgSO4干燥并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰胺酸40。
N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰二胺41将1.75g,N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰胺酸40溶于无水吡啶(50ml)中，并真空浓缩，用更多的吡啶(50ml)再次重复该过程。残余物溶于干燥吡啶(25ml)中，添加2.96g 1-(2-基磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑，鼓泡通入氨气60分钟。真空浓缩反应混合物，并将其再溶于乙酸乙酯(100ml)中，用饱和NaHCO3(2×100ml)饱和和NaCl(75ml)洗涤。有机相经无水MgSO4干燥，真空浓缩，用快速色谱法提纯得到N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰二胺41。
N,N-双(2-氯乙基)-P-[2-(2,3-二乙基胍基)乙基]膦酰二胺43将N,N-双(2-氯乙基)-P-[N′-(t-Boc)-2-氨基乙基]膦酰二胺410.873g溶于10ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸。60分钟后。反应混合物真空浓缩得到42，残余物再溶于1ml三乙胺和20ml水的混合物中。用更多的三乙胺调节pH值至8.5，加入0.872g N,N′-二乙基-O-甲基异脲四氟硼酸盐，同时用三乙胺保持pH值在8.5。16小时后，反应混合物用乙酸调节至pH7,并真空浓缩。残余物再溶于5ml水中，用逆相ODC色谱法提纯得到N,N-双(2-氯乙基)-P-[2-(2,3-二乙基胍基)乙基]膦酰二胺43。
实施例8a用于合成分子内烯醇三甲氧基苯甲酸酯磷酰胺前体药的酐中间体，化合物45的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图8a。
将市场上可得到的三甲氧基苯甲酸进行溴化，产物5经低温锂-卤素交换产生芳基锂中间体，活性中间体用保护的碘乙醇7烷基化，产物44经脱水形成对称的酐45。
具体合成方法如下2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸5
将在100ml乙酸中的溴(100mmol)溶液逐滴加入由冰水浴冷却的在100ml乙酸中的3,4,5-三甲氧基苯甲酸(100mmol)的溶液中。在所得到的反应混合物的红色消失后，混合物注入500g碎冰中。经过滤收集所得到的固体，经P2O5真空干燥，由Et2O重结晶后得到淡黄色固体的产物。
2[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]-3,4,5-三甲氧基苯甲酸(44)将叔丁基锂(在正戊烷中的1.7M溶液，15mmol)加入到在50mlTHF中的溴化物5(5mmol)溶液中，其间保持混合物的温度低于-95℃。在滴加完毕后，使混合物加热至-78℃，30分钟后，按一份加入碘化物7(在实施例2a中所述合成)，使混合物加热至0℃。加入水(50ml)，用0.1M HCl仔细调节pH值至3，混合物用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
2[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]-3,4,5-三甲氧基苯甲酐(45)将在10ml CH2Cl2加的DCC(5.5mmol)溶液在室温下加入到在25mlCH2Cl2中的酸44(10mmol)溶液中。1小时后，过滤除去所得固体，并用25ml CH2Cl2洗涤，真空蒸发掉滤液中的溶剂。产物被使用而不需要进一步提纯。酐用于实施例8b中的合成醛磷酰胺前体药化合物50(附图8b)。
实施例8b前体药，分子内烯醇三甲氧基苯甲酸酯磷酰胺，化合物50的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图8b。
前文制备的对称酐45(实施例8a)与β-甲硅烷氧基丙醛烯醇化物反应生成烯醇苯甲酸酯48，除去甲硅烷基保护基，于是显示出醇与磷酰胺二氯化物，接着与氨反应生成相对稳定的前体药前体49。前体49根据需要可以迅速转变成更有活性的前体药50。
具体合成方法如下3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-丙醇(46)
将熔于5ml DMF中的1,3-丙二醇(10mmol)、叔丁基二甲基氯甲硅烷(1lmmol)和咪唑(22mmol)混合物在室温下搅拌16小时。混合物注入0.1M HCl(100ml)中，用乙醚(3×100ml)萃取。有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙醇(47)将DNSO(24mmol)添加到冷却至-78℃的40ml CH2Cl2中的草酰氯(11mmol)中，15分钟后加入醇46(10mmol)。使混合物升温至0℃，然后注入0.1M HCl(100ml)中，进行相分离，水相用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙-1-烯基2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]3,4,5-三甲氧基苯甲酸酯(48)NaH(60％在矿物油中的分散液，11mmol)用己烷(2×10ml)洗涤，加入乙醚(20ml)，随后逐滴加入在20ml乙醚中的醋47(10mmol)溶液。添加完成后15分钟，按一份加入在20ml乙醚中的酐45(20mmol)溶液。再经0.5小时后，反应混合物注入饱和NH4Cl(20ml)中并进行相分离。水相用乙醚(3×40ml)萃取。合并的有机相用盐水(40ml)萃取，经无水MgSO4干燥，干燥并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
3-{2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯基甲氧基)乙基]3,4,5-三甲氧基苯甲酰氧基}丙-2-烯基N,N-双(2-氯乙基)磷酰二胺(49)将氟化四丁基铵(在THF中的1.0M溶液，2mmol)添加到冷却至-23℃的在50ml TTHF中的甲硅烷基醚48(2mmol)溶液中。五分钟后，添加三乙胺(2mmol)，再添加36(2mmol，按实施例6中所述合成)。再经过3小时后，加入NH3。另经过2小时后，反应混合物注入冰冷盐水中并用醚(4×100ml)萃取。合并的有机相经无水MgSO4干燥，干燥并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
3-[2-(2-羟基乙基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰氧基]丙-2-烯基N,N-双(2-氯乙基)磷酰二胺(50)将三苯甲基醚49(0.1mmol)在室温下按一次加入80％乙酸水溶液(10ml)中，15分钟后，混合物注入饱和NaHCO3(100ml)中，用乙醚(3×100ml)萃取。合并的有机相用几份100ml 5％NHCO3洗涤，直到不再出现气体逸出。然后有机相用盐水(100ml)洗涤。经无水MgSO4干燥并真空浓缩，混合物用快速色谱法提纯得到无色固体。
实施例8c分子内烯醇三甲氧基苯甲酸酯磷酰胺半抗原，化合物57的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图8c。
保护的芳基次膦酸酯51根据现有的文献合成。芳环被溴化，溴化物经锂-卤素交换，如此生成的芳基锂羟乙基化得到52。反应完成和脱保护后，得到环状次膦酸酯54。次膦酸酯54与α-溴醛经Perkow反应生成烯醇膦酸酯56。脱保护和与三氯氧化磷反应，接着与N-三氟乙酰基哌嗪反应，再与氨反应得到半抗原57，该半抗原可以通过哌嗪环与载体蛋白相连。
具体合成方法如下P-(3,4,5-三甲氧基苯基)-P-(二乙氧基甲基)次膦酸乙酯(51)根据Tetrahedron Lelt.26(1985):5939-5942的方法(引入本文作参考文献)制备3,4,5-三甲氧基溴苯。根据Tetrahedron 45(1989):3787-3808的方法(引入本文作参考文献)制备(二乙氧基甲基)次膦酸乙酯，并根据J.Met.Chem.32(1989):1580-1590的方法(引入本文作参考文献)，将其与3,4,5-三甲氧基溴苯反应。
P-(2-溴-3,4,5-三甲氧基苯基)-P-(二乙氧基甲基)次膦酸乙酯(52)将在10ml乙酸中的溴(10mmol)溶液逐滴加入由冰水浴冷却的在10ml乙酸中的酯51(10mmol)溶液中。在所得的混合物的红色消失后，混合物注入饱和HaHCO3(100mmol)中，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。合并的有机相用几份100ml的5％NaHCO3洗涤直到不再出现气体逸出。然后有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水MgSO4干燥并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到浅黄色固体产物。
P-二乙氧基甲基-2,3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基次膦酸酯(53)将叔丁基锂(在正戊烷中的1.7M溶液，10mmol)添加到在50mlTHF中的溴化物52(5mmol)的溶液中，在此期间保持混合物的温度低于-95℃。添加完成后，将混合物升温至-78℃，30分钟后，按一份加入亚乙基二磺酸酯(5mmol)，使混合物加热至室温。1小时后，加入1MHCl(50ml)。再经过1小时后，混合物用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。有机相经无水MgSO4干燥，并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)丁基次膦酸(54)将在20ml 36％HCl水溶液中的化合物53(5mmol)的混合物在100℃下加热2小时。冷却至室温后。反应混合物用200ml水稀释，并用乙酸乙酯(4×100ml)萃取，有机相经无水MgSO4干燥，并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
2-溴-3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙醛(55)将在乙酸乙酯(50ml)和氯仿(50ml)中的CuBr2(10mmol)和醛47(10mmol)的混合物在避光条件下加热回流6小时，混合物冷却至室温，经过滤除去固体，用乙酸乙酯(50ml)洗涤，合并的有机相经MgSO4干燥并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到浅黄色油状产物。
3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-1-丙烯基2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)丁基烷基亚膦酸酯(56)将54(1mmol)溶于六甲基二硅氮烷(1ml)中加热回流3小时。混合物冷却至室温，并真空蒸发性组分。醛55(1mmol)被加入到所得的油状物中，混合物于100℃在缓慢的氮气流下加热4小时。冷却后，用快速色谱法提纯混合物。
3-[P-氨基-P-(N-哌嗪基)磷氧基]-1-丙烯基-2,3-(3,4,5-三甲氧基苯并)丁基烷基亚膦酸(57)
将氟化四丁基铵(THF中的1.0M溶液，2mmol)加入到冷却至-23℃的在50ml THF中的甲硅烷基醚56(2mmol)中。5分钟后，加入三乙胺(2mmol)，随后加入POCl3(2mmol)，4小时后，按一份加入N-三氟乙酰基哌嗪(2mmol)和三乙胺(2mmol)的混合物。另经3小时后，加入NH3。再经过2小时后，将反应混合物注入冰冷盐水中，用乙醚(4×100ml)萃取。合并的有机相经无水MgSO4干燥并真空浓缩，用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
实施例9半乳糖基-胞嘧啶阿拉伯糖苷的前体药活性。
如实施例3中所概述方法来制备前体药半乳糖基-胞嘧啶阿拉伯糖苷(GalAraC)，并进行体外和体内毒性试验和由细菌，β-半乳糖苷酶的活性化试验。
将不同浓度的前体药GalAraC加入两种不同的组织培养细胞系(Colo 320 Dm和Lovo)中。细胞生长4天，随后除去培养基，细胞用PBS洗涤。在细胞用吉姆萨氏染剂染色后，在600nm测量附在培养壁表面的染色培养基的光密度，光密度的减少表明了附在培养壁上的细胞密度的减少。同样的步骤用测试AraC本身对两种细胞系的毒性，前体药和药对Colo 320DM细胞系的毒性比较示于附图9中。通过用于得到0.5OD(600)的前体药和药的浓度的比较，可以看出GalAraC的毒性比AraC至少低800倍。也就是说，人们必须使用800倍高浓度的GalAraC才能达到如AraC本身的相同的毒性，类似的结果可以从用于细胞系Lovo的附图10中看出，其中再一次看出前体药的毒性比药AraC至少低800倍。附图9和10均表明，当前体药被酶β-半乳糖苷酶活化时，其毒性相当于在同样浓度下纯药物的毒性。
为试验前体药是否能被β-半乳糖苷酶活化，酶被结合到抗体上，该抗体直接对抗癌胚抗原(CEA)，一种在Lovo培养细胞表面上的特异肿瘤抗原。Colo 320DM细胞没有这各睛面抗原，其用作对照组β-半乳糖苷酶结合抗体被加入到培养基中，并生长三天。作为对照组而言，没有酶的BSA加入培养基中，并向培养基中加入相同范围的前体药浓度。附图11显示了本实验的结果，其表明前体药可以被抗体酶结合物活化。比较附图11和附图12，显示前体药不仅被结合抗体活化，而且与加入了BSA和前体药的培养基相比较，带有CEA肿瘤标记的LoVo细胞按特性被杀死。上述结果表明，在抗原定位试验中前体药的毒性比药大约低200倍，并且当前体药由抗体在细胞表面相结合时由细菌酶在肿瘤细胞表面上按特性被活化。
为测试表面连接的结合物对产物活性药物细胞毒性含量的能力，ONPG作为底物测量产物形成的速率。按特性结合到LoVo细胞上的结合物被测出产生1.2×107分子的产物/分/细胞。在我们特殊的试验规格形式中，该速率相当于每分种形成1.6mM产物。因为据报道1.5mM AraC抑制50％的细胞增值(Gish.D.等人，J.Med.Chem.14(1971):1159)，所以实验得出的速率表明的体外试验中足以产生细胞毒性。
AraC和CalAraC用小鼠进行毒性和活化试验。在各自的实验中，向小鼠给药(经100mg/kg的浓度)Cal、AraC和先给药CalAraC接着给药β-半乳糖苷酶。5天后，对所有小鼠测试完整血细胞计数。通过比较药物和前体药(参阅附图13的条带)，显然在体内前体药实际上比药物具有较低的毒性。同样，附图14至17中的数据(附图13的图解与附图14至17的相同)表明在β-半乳糖苷酶存在下，前体药可以被活化以产生与药物本身一样高的毒性。这个效果在分节嗜中性白细胞中是相当明显的，而在红血细胞中则很低，其可能影响在不同的细胞群体中不同的细胞合成动力学。
总体来说，这些数据表明，前体药CalAraC在体内和体外已明显地降低了毒性，当被酶活化时，活化的前体药在体内和体外释放产生与Ara非常相似的毒性。
实施例10半乳糖基-5-氟尿苷(24)的前体药的活性。
在类似的实验装置中，将如实施例4中所述合成的前体药半乳糖基-5-氟尿苷(Cal5FU)和如上述的CalAraC进行试验。前体药和药物的毒性研究的结果在附图18中表示。可以看出，前体药的浓度需要增加超过500倍才能产生如药物5-氟尿苷的类似程度的毒性。如图CalAraC一样，前体药gal5FU可以在体外被活化以产生类似于纯药本身的药物含量。因此，在药物上添加半乳糖部分实际上降低了毒性，并使它达到了用于前体药的极好的候选物的程度。
半乳糖基-5-氟尿苷如CalAraC前体药所做的那样通过将β-半乳糖苷酶结合到具有同样CEA抗原肿瘤表面特性的抗体上进行靶活化试验。使抗体与带有抗原细胞(LoVo)和没有CEA抗原标记的对照细胞反应，随后前体药以不同的浓度加入到不同培养基中。
附图19显示本实验的结果，其表明定位在LoVo细胞表面上的抗体释放来自前体药的5-FU的毒性量比对照CoLo细胞低20至30倍(见附图20)。因此，前体药的特异活性的位置以相当低的浓度提高了药物的效力。
将gal5FU和5FU用小鼠进行试验并作比较，如同上述用于体内galAraC实验一样来进行体内研究。给药药物和前体药，在注射后6天测量血细胞计数和骨髓细胞性。实验结果示于附图21至25中，附图23和24的附解与附图21相同。
以与galAraC实验结果相似的方式，与药物本身比较，前体药显示出毒性的降低。这在嗜中性白细胞(参见附图23)和淋巴细胞(参见附图24)细胞群体中尤其得到证实。总白细胞(参见附图21)表明相同的标记结果，而红细胞群体在6天的实验中没有急剧减少。药物效果和前体药的较低毒性性质的总体差异的总骨髓细胞性测量中可最清楚地看出。这些结果示于附图25中。
不仅不存在前体药的影响，并且很明显它可用β-半乳糖苷酶活化，因此，半乳糖基-AraC和半乳糖基-5-氟尿嘧啶用作前体药的观念不仅是合理的方法，而且对于这些数据应该采用合理的成功的选择。
实施例15在实施例16和20中的前体药的中间体和实施例18和22的前体药的半抗原，噻唑基亚氨乙酸酯，化合物60的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图26。
制备N-烷氧基苯邻二甲酰亚胺溴化物58，然后用肼和2-甲酰氨基-4-噻唑基二羟乙酸处理得到酸59，接着使用TaKasugi等人(J.Antigiotics 36(1983):846-854)的方法。用N-羟基琥珀酰亚胺活化酸的羧基得到N-羟基琥珀酰亚胺基(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚氨乙酸酯60具体合成方法如下叔丁基2-溴-2-甲基丙酸酯(58)将异丁烯冷凝在(100ml)CH2Cl2中的2-溴-2-甲基丙酸(10mmol)和三氟甲烷磺酸(0.1mmol)的溶液中，直到经TLC观察起始物料消耗完。真空蒸发挥发性组分，残余物用50％乙醚/己烷通过中性氧化铝填塞物过滤，滤液真空浓缩，无需进一步提纯即可使用。
(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚胺乙酸(59)用溴化物58、N-羟基苯邻二甲酰亚胺和2-(甲酰氨基)-4-噻唑基二羟乙酸乙酯根据由Takasugi.H.等人(J.Antibiotics 36(1983):846-854，引入本文作参考文献)给出的方法合成化合物59。
N-羟基琥珀酰亚胺基(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基1-甲基)乙氧基亚胺乙酸(60)将10ml CH2Cl2中的DCC(11mmol)溶液在室温下加入到90mlCH2Cl2中的N-羟基琥珀酰亚胺(10mmol)和酸59(10mmol)的溶液中，迅速生成沉淀物。1小时后，过滤溶液，滤液用水(40ml)洗涤，经无水MgSO4干燥并真空浓缩得到无色固体产物。
实施例16前体药，5-氟尿苷取代β-内酰胺化合物68的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图27。
根据Evans,DA等人，(Tetrahedron Lett.(1985):3783-3786，引入本文作参考文献)的方法制备的3-(S)-氨基-4-(S)-羟基甲基氮杂环丁酮(61)用酯60酰基化得到酰胺62。酰胺经Swern氧化反应和Baeyer-Villiger重排(基于AfonsoA.等人的Bentler.等人编辑的“Recent Advances inthe Chemistry of β-Lactam Antibiotics”中的方法，The Royal Society ofChemistry Special Publ.No 70(1989):295-302，引入本文作参考文献)得到酯64，制备保护的5-氟尿苷65，并使其与酯64反应得到氮杂环丁酮66(基于Aoki等人的Heterocycles 15(1981):409-413和TetrahedronLett.(1979):4327-4330的方法，均引入本文作参考文献)。将醇加入到氮杂环丁酮中立体选择性地转化酰氨基。氮杂环丁酮66根据Cimarusti,C.M.等人(Tetrahedron 39(1983):2577-2589，引入本文作参考文献)的方法进行磺酯化，并脱保护得到前体药68。
具体合成方法如下3-(S)-氨基-4-(S)羟基甲基氮杂环丁酮(61)胺61可以根据Evans,D.A.等人，(Tetrahedron Lett.(1985):3783-3786，引入本文作参考文献)的方法制备。
3-(S)-[(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚氨乙酰基]氨基-4-(S)-羟基甲基氮杂环丁酮(62)将胺61(1mmol)、活化的酯60(1mmol)和DMAP(1mmol)溶于10mlDMF中，经TLC观察到起始物料消耗后，混合物注入水(50ml)中，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
4-(R.S)-羰氧基-3-(S)-[(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚氨乙酰基]氨基氮杂环丁酮(63)将10ml CH2Cl2中的草酰氯(1.1mmol)溶液冷却至-78℃，逐滴加入在1ml CH2Cl2中的DMSO(1.1mmol)溶液。15分钟后，逐滴加入在1mlCH2Cl2中的醇62(1mmol)溶液。30分钟后，按一份加入在1mlCH2Cl2中的三乙胺(1.2mmol)溶液，使混合物加热至室温。混合物注入水(50ml)中，用CH2Cl2(3×50ml)萃取，有机相用水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
4-(R,S)-羰氧基-3-(S)-[(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚氨乙酰基]氨基氮杂环丁酮(64)将m-cPBA(1.5mmol)加入在10ml CH2Cl2中的醛63(1mmol)溶液中，混合物在室温下静置直到经TLC观察起始原料消耗完为止。混合物注入1M NaHCO3(50ml)中，用乙酸乙酯(3×5ml)萃取，有机相经无水MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
2′,3′-O-异亚丙基-5-氟尿苷(65)将2,2-二甲氧基丙烷(2ml)加入在5ml DMF中的5-氟尿苷(1.05g,4mmol)和TsOH(20mg)的溶液中。经TLC观察起始物料消耗完后，加入20ml甲醇，使反应静置过夜。真空蒸出溶剂，所得固体从热甲醇中重结晶得到864mg无色产物。
1H NMR(DMSO-d6)d 1.26(s,3),1.45(s,3),3.50-3.66(m,2),4.04-4.14(m,1),4.70-4.78(m,1),4.82-4.91(m,1),5.81(bs,1),8.17(d,I,J=7Hz),11.86(bs,1)。
前体药的前体(66)的制备将1ml CH2Cl2中的BF3·OFt2(0.1mmol)溶液加入在5ml CH2Cl2中的酯64(1mmol)和醇65(1mmol)的溶液中，经TLC观察起始物料消耗完后，混合物注入0.1M NaHCO3(50ml)中用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，有机相水经无水MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
前体药的前体67的制备将三甲基甲硅烷基氯磺酸酯(2mmol)加入DMF(4ml)中，30分钟后，真空除去挥发性组分。将残余物加入冰浴冷却的在4ml CH2Cl2中的酰胺66(1mmol)的混合物中，30分钟后，溶液注入10ml 0.5M KH2PO4中。分离出有机相，水相用CH2Cl2(4ml)萃取，并蒸发至干。固体残余物用甲醇(40ml)研磨，真空浓缩有机洗涤物。该残余物无需进一步提纯即可使用。
5-氟尿苷取代的β-内酰胺前体药(68)的制备将三氟乙酸(1mml)加入冰浴冷却的在4ml CH2Cl2中的化合物67(1mmol)和苯甲醚(0.5ml)的混合物中。使混合物加热至室温，1小时后，真空蒸发挥性发组分。残余物通过逆相HPLC法用0.1M三乙基铵乙酸盐缓冲液(pH为7)和乙腈混合物作移动相进行提纯。将含有产物的馏分合并，并真空干燥，残余物由去离子水(2×)重新干燥，随后残余物通过SP-Sephadex离子交换柱(钾型)得到作为二钾盐的产物。
实施例17实施例16中的前体药的半抗原的中间体，5-炔基化尿苷，化合物74的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图28。
尿苷3a的羟基被保护得到化合物70，将化合物70在5位上碘化得到碘化物71。随后进行钯催化的炔基化得到化合物73，其在5′羟基上选择性脱保护得到中间体74。
具体合成方法如下5-碘-2′,3′-O-异亚丙基尿苷(69)将1ml CH2Cl2中的三醇(10mmol，如实施例16中所述的合成)、2,2-二甲氧基丙烷(30ml)和TsOH(1mmol)的溶液在室温下搅拌直到经TLC观察起始物料消耗完为止，加入三乙胺(2mmol)，真空蒸发挥发性组分。残余物用快速色谱法提纯得到无色固体产物。
5-碘-2′,3′-O-异亚丙基-5′-O-(4-甲基苯甲酰基)尿苷(70)将4-甲基苯甲酰氯(10mmol)加入在20ml吡啶中的醇69(10mmol)溶液中。在TLC观察不再进行反应后，真空蒸发挥发性组分。残余物用快速色谱法提纯得到无色固体产物。
4-叔丁氧基羰基氨基-1-丁炔(72)将加实施例16中所述的经肼解作用得到的粗胺71溶于50ml二噁烷和2ml三乙胺中，加入在10ml噁烷中的二叔丁基双碳酸酯(10mmol)溶液。经TLC观察反应完成后，混合物在0.05M HCL(50ml)和乙酸乙酯(3×100ml)之间分配，有机相经MgSO4干燥，并真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
5-(4-叔丁氧基羰基氨基-1-丁炔基)-2′,3′-O-异亚丙基-5′-O-(4-甲基苯甲酰基)尿苷(73)向150ml的三乙胺中的碘化物70(5mmol)脱气溶液中加入4-叔丁氧基羰基氨基-1-丁炔72(10mmol)、(Ph3P)2PdCl2(0.2mmol)和CuI(0.3mmol)。所得悬浮液在50℃下加热直到所有起始物料耗尽为止。真空蒸发挥发性组分，残余物溶于CHCl3(200ml)中，用5％二钠EDTA(2×100ml)和水(100ml)洗涤，经MgSO4干燥，真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱提纯得到无色油状产物。
5-(4-叔丁氧基羰基氨基-1-丁炔基)-2′,3′-O-异亚丙基尿苷(74)将浓缩的氢氧化铵(7ml)加入在90ml甲醇中的酯73(5mmol)溶液中。经TLC观察起始物料耗尽后，真空蒸发挥发性组分，残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
实施例18实施例16中的前体药的半抗原，环丁醇取代的5-氟尿苷，化合物81的制备对于本实施例中的黑字化合物参见附图29和30。
醇74经共轭加成至乙炔基碘酸酯75上得到烯醇醚76，叠氮基乙烯酮经[2+2]环化加成至烯醇醚76上得到环丁酮77。酮基、叠氮基和炔基反应得到氨基醇79，其经N-酰基化和脱保护得到化合物81，化合物81可在伯脂族氨基上连接到载体蛋白上。
具体合成方法如下叔丁基乙炔基磺酸酯(75)将在THF中的氯化乙炔基镁的溶液(0.5M,10mmol)加入冷却至-78℃的100ml THF中的硫酰氯(20mmol)溶液中。1小时后，逐滴加入在50ml THF中的叔丁醇(60mmol)和三乙胺(60mmol)的溶液。使溶液加热至室温，真空蒸发挥发性组分，残余物在乙醚(150ml)和0.05M HCl(50ml)之间分配，有机相用盐水(50ml)洗涤，经MgSO4干燥，并真空蒸发挥发性组分。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
尿苷5′-烯醇醚76的制备将甲醇钠(0.05mmol)加入在100mmol THF中的炔75(11mmol)和醇74(10mmol)溶液中，经TLC观察起始物料耗尽后，加入乙酸(0.1mmol)真空蒸发挥发性组分。残余物在5％NaHCO3(40ml)和乙酸乙酯(3×100ml)之间分配，有机相经MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。该残余物用快速色谱法提纯，得到无色油状产物。
环丁酮77的制备将在20ml CH2Cl2中的叠氮基乙酰氯(10mmol)溶液逐滴加到冷却至-78℃的50ml CH2Cl2中的三乙胺(11mmol)和烯醇醚76(5mmol)溶液中，使混合物缓慢加热至室温过夜，当经TLC观察不再进行反应时，加入1ml甲醇，并真空蒸发挥发性组分。残余物通过硅胶短柱，用乙酸乙酯作溶剂。
环丁酮78的制备将硼氢化钠(10mmol)加入到冰浴冷却的20mmol甲醇中的酮77(10mmol)溶液中，当经TLC观察到不再进行反应后，真空蒸发挥发性组分。残余物在0.05M HCl(40ml)和乙酸乙酯(3×100ml)之间分配，有机相经MgSO4干燥，真空蒸出溶剂。残余物通过硅胶短柱，用乙酸乙酯作溶剂。真空浓缩产物直接使用不用进一步提纯。
氨基醇79的制备将叠氮化物78(5mmol)溶于甲醇(100ml)中，加入5％Pd-C(按重量计10％)，混合物在氢气气氛中搅拌，直到起始物料耗尽为止。用硅藻土填塞物过滤出催化剂，催化剂用甲醇(100ml)漂洗。真空蒸发溶剂，产物直接使用而不需要进一步提纯。
酰胺80的制备根据用于酰胺62的方法由胺79和酯60合成酰胺80。
半抗原81的制备化合物80用化合物68的方法脱保护提到化合物81。然而，三氟乙酸盐可以用于将化合物81在伯脂族氨基上连接到载体蛋白上的反应中。
实施例19在实施例20中的前体药的中间体，5-氟尿苷5′-O-芳基酯，化合物85的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图31。
对溴化物5进行锂-卤素交换，接着与苄基氯甲酸酯反应得到单酯82，与5-氟尿苷进行酯化得到二酯83，其经选择性脱保护，并将苄酯基活化得到中间体85。
2-羧苄氧基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸(82)将叔丁基锂(在正戊烷中的1.7M溶液，15mmol)加入在50ml THF中的2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸5(5mmol，如实施例12中所述合成)，期间混合物的温度保持低于-95℃。添加完后，使混合物加热至-78。30分钟后，按一份加入苄基氨甲酸酯(5mmol)，使混合物加热至0℃。加入水(50ml)然后用0.1M HCl混合物的pH值仔细地调至3。混合物用乙酸乙酯(5×100ml)萃取，有机相经无水MgSO4干燥并真空浓缩。混合物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
二酯83的制备在室温下搅拌在50ml CH2Cl2中的酸82(5mmol)2′,3′-O-异亚丙基-5-氟尿苷65(5mmol)和EDC(6mmol)的混合物，直到起始物料耗尽为止。溶液用水(2×30ml)洗涤，水相用CH2Cl2(2×50ml)洗涤，有机相经无水MgSO4干燥，在真空下蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
单酸84的制备将二酯83(2mmol)溶于乙酸乙酯(100ml)，加入5％Pd-C(按重量计10％)，在氢气气氛中搅拌混合物直到起始物料消耗完为止。用硅藻土填塞物过滤出催化剂，催化剂用乙酸乙酯(100ml)漂洗。真空蒸发溶剂，产物无需进一步提纯即可使用。
酰基氯85的制备将单酸84(1ml)溶于CH2Cl2(20ml)中，加入亚硫酰氯(5mmol)。用等分试样的甲醇分解和1H NMR光谱学控制反应进行，当反应完成后，真空蒸发挥发性组分得到油状化合物85。
实施例20由5′-O-芳酰基-5-氟尿苷取代的β-内酰胺前体药，化合物90的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图32。
苏氨酸用羟胺进行N-酰基化和酰胺化得到异羟肟酸87。用酰基氯85与化合物87的更多酸性异羟肟酸羟基反应得到酰胺88(Miller,MJ-等人，Tetrahedron 39(1983):2575)，其经过Mitsunobu反应进行环闭合(Miller,M.J.等人，J.Am.Chem.Soc.102(1980):7026-7032)，随着脱保护得到β-内酰胺前体药90。
具体合成方法如下N-[(Z)-2-(2-甲酰氨基-4-噻唑基)-2-(1-叔丁氧基羰基-1-甲基)乙氧基亚氨乙酰基]苏氨酸(86)在室温下搅拌在30ml DMF中的L-苏氨酸(5mmol)、酯60(5mmol)和DMAP(5mmol)的混合物，经TLC观察起始物料消耗完后，混合物注入到0.05M HCl(50ml)中，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，并真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
苏氨酸异羟肟酸87的制备在室温下在50ml CH2Cl2中的DCC(5.5mmol)溶液加入到45mlCH2Cl2中的羟胺盐酸盐(5mmol)、三乙胺(5mmol)和酸86(5mmol)溶液中，迅速生成沉淀物。1小时后，过滤溶液，滤液用0.05M HCl(40ml)洗涤，水相用CH2Cl2(50ml)萃取，有机相经无水MgSO4干燥，并真空浓缩得到无色油状产物。
O-苯甲酰基异羟肟酸88的制备化合物85溶于5ml CH2Cl2中，并将其逐滴加入到冰浴冷却的在20ml CH2Cl2中的异羟肟酸87(1mmol)和DMAP(2mmol)的溶液中，2小时后，混合物注入水(50ml)中，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥并真空蒸发溶剂。残余物经快速色谱法提纯得到无色油状产物。
β-内酰胺89的制备在室温下搅拌在10ml THF中的DEAD(1.1mmol)溶液逐滴加入到在20ml THF中的化合物88(1mmol)和在三苯膦(1.1mmol)的溶液中。经TLC观察反应完成后，真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
β-内酰胺前体药90的制备将三氟乙酸(2ml)加入冰浴冷却的在10ml CH2Cl2中的化合物89(1mmol)和苯甲醚(1ml)的混合物中。使混合物加热至室温，1小时后，真空蒸发挥发性组分。残余物通过逆相HPLC法用0.1M三乙铵乙酸盐缓冲液(pH7)和乙腈混合物作移动相进行提纯。合并含有产物的部分并真空干燥，残余物由去离子水(3×)重新干燥，残余物通过SP-Sephadex离子交换柱(钾型)得到二钾盐产物。
实施例21实施例22中的半抗原的中间体，5-炔基化尿苷5′-O-芳基酯，化合物92的制备。
对于本实施例中的黑体字化合物参见附图33。
酸82用醇74酯化得到二酯91，苄基酯羟基进行选择性脱保护得到单酸92。
具体合成方法如下尿苷5′-O-芳基酯91的制备在室温下搅拌在50ml CH2Cl2中的酸82(5mmol)醇74(5mmol)和EDC(6mmol)的混合物，直到起始物料耗尽为止。溶液用水(2×30ml)洗涤，水相用CH2Cl2(2×50ml)洗涤，有机相经无水MgSO4干燥，在真空下蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
实施例22实施例20中的前体药的半抗原，被5′-O-芳酰基尿苷取代的环丁醇，化合物10的制备。对于本实施例中的黑体字化合物参见附图34。
根据文献中的方法制备的环丁烯二酮93经若干步骤转化成氨基环丁二醇97，选择性的N-和O-酰基化反应和脱保护基得到环丁醇半抗原100。
具体合成方法如下3-羟基-4-甲基-3-环丁烯-1,2-二酮(93)采用Bellus.D.等人(Hely.Chim.Acta 63(1980):1130-1140，引入本文作参考文献)的方法，合成化合物93。
3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-4-甲基环丁烯-1,2-二酮(94)将咪唑(11mmol)加入到冰浴冷却的在5ml DMF中的化合物93(5mmol)和叔丁基二甲基氯甲硅烷(5.5mmol)的溶液中。使混合物加热至室温，16小时后，混合物注入水(50ml)中，用乙醚(3×50ml)萃取，有机相同盐水(50ml)洗涤，并经无水MgSO4干燥，真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱提纯得到无色油状产物。
环丁烯二醇95的制备将硼氢化钠(20mmol)加入到冰浴冷却的在50ml乙醇中的化合物94(5mmol)的溶液中。在经TLC观察起始物料消耗完后，混合物注入水(100ml)中，用乙醚(4×75ml)萃取，有机相同盐水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱提纯得到无色油状产物。
氨基环丁二醇96的制备将氟化四丁基铵(在THF中的1.0M溶液，6mmol)加入到冰浴冷却的50ml THF中的化合物95(5mmol)的溶液中。30分钟后，加入二苄基胺(20mmol)，再经1 5分钟后，加入氰基硼钠(30mmol)。另经2小时后，混合物注入水(100ml)中，调节pH到10，混合物用乙醚(4×75ml)萃取，有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥并真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
氨基环丁二醇97的制备在室温和氢气气氛下搅拌在20ml甲醇中，加入5％Pd-C(按重量计10％)，和胺96(5mmol)的混合物，直到经TLC，观察起始物料消耗完为止。用硅藻土填塞物过滤出催化剂，另用150ml MeOH洗涤。真空蒸发溶剂，得到的油状物即可使用无需进一步的提纯。
酰胺98的制备将DMAP(16mmol)加入到在15ml CH2Cl2中的胺97(3mmol)的噻唑酯69(3mmol)的溶液中，经TLC观察到不再进行反应后，混合物注入水(50ml)中，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水MgSO4干燥，并真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯得到无色油状产物。
酯99的制备在室温下搅拌在10ml CH2Cl2中的酸92(1mmol)、醇98(1mmol)和EDC(1.2mmol)的混合物，直到起始物料被消耗完为止。溶液用水(2×20ml)洗涤，水相用CH2Cl2(2×20ml)洗涤，有机相经无水MgSO4干燥，真空蒸发溶剂。残余物用快速色谱法提纯后得到无色油状产物。
环丁醇半抗原100的制备将三氟乙酸(2ml)加到化合物99(1mmol)和苯甲醚(1ml)在由冰浴冷却的10ml CH2Cl2中的混合物中。让该混合物升到室温，1小时后，真空蒸发挥发性组分，残余物不用进一步提纯就用于连接到载体蛋白质上。
亚德里亚霉素和左旋苯丙氨酸氮芥前体药亚德里亚霉素和道诺霉素是蒽环类抗生素抗肿瘤抗体，发现其通过嵌入作用抑制DNA合成(Dimarco,A.，等人，Bicham.Pharmacol 20(1971):1323-1328)。其说明通过糖残基(六碳氨糖)的氨基和DNA的磷酸酯基之间的发色团相互作用和静电的相互作用，这些化合物插入碱基对(Dimarco,A.，等人，Cancer Chemoth.Rep.,Vol 6 No 2(1975):91-106)。
其说明通过酰胺键形成产生氨基(Chandra,P.,Cancer Chemoth.Rep.(1975):115-122)，通过氨基酸、缩氨酸或其他羧酸减少这些化合物的毒性(Levin.D.,Febs Letters 119-122)。
实施例23亚德里亚霉素前体药；芳酰基酰胺化合物103的制备对该实施例中的黑体编号化合物参考图35。
亚德里亚霉素前体药103的合成可由亚德里亚霉素101和苯甲酸120(图35)开始进行。在DMF中的1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)的存在下，亚德里亚霉素101用苯甲酸102处理。详细的合成情况如下合成亚德里亚霉素前体药103的苯甲酰胺的一般方法。
向在DMF(0.015M)中的亚德里亚霉素101(1当量)溶液中顺序地加入苯甲酸102(1当量)、1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC，1.05当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT 1当量)，在室温氩气氛下搅拌反应混合物，反应完后，用色谱法提纯产物103。可以用同样的方法。用取代的合适的芳酰基羧酸来制备其他的芳酰基酰胺。
实施例24实施例23中的前体药的半抗原的制备，亚德里亚霉素的芳酰基酰胺的磷酸酯化合物104。
对该实施例中黑体字编号的化合物参考图36。
过渡态的亚德里亚霉素类似物(化合物104)的合成可以由亚德里亚霉素101和苯膦酸105进行。在DMF中的EDC和1-羟基苯并三唑的存在下，用苯膦酸105处理亚德里亚霉素101。
详细的合成方法如下向在DMF中的亚德里亚霉素101(1当量)的溶液中顺序地加入苯膦酸105(1当量)、1-乙基3(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(DEC,1当量)和1-羟基苯并三唑(1当量)，在室温搅拌反应混合物，反应完成后，可用色谱法提纯产物104。
实施例24a在实施例23中的前体药的半抗原的制备，亚德里亚霉素的芳酰基氨磺酰化合物106。
对该实施例中，黑体编号的化合物参考图37。
可以在无水DMF中的三乙胺的存在下，通过用苯磺酰氯107处理亚德里亚霉素101来制备芳酰基氨磺酰半抗原化合物106。
详细的合成方法如下
TS类似物化合物106的合成在0℃，在氩气氛下，在三乙胺(1.5当量)的存在下，向在DMF中的亚德里亚霉素101(1当量)的溶液中慢慢地加入苯磺酰氯107(1.1当量)。在室温搅拌反应混合物，反应完成后，可以用色谱法提纯产物106。
实施例25左旋苯丙氨酸氮芥芳酰基酰胺前体药109的制备对该实施例中黑体编号的化合物参考图38。
左旋苯丙氨酸氮芥前体药109的合成可由左旋苯丙氨酸氮芥108和苯甲酰氯来完成。
化合物109的详细的合成方法，按照制备106所述的同样的方法，其中用苯甲酰氯代替苯磺酰氯。
实施例26a实施例25中的前体药半抗原的制备，磺酰胺化合物110。
对该实施例中黑体编号的化合物参考图39。
左旋苯丙氨酸氮芥半抗原，化合物110的合成，可以用类似于制备106所述的反应条件，由左旋苯丙氨酸氮芥108和苯磺酰氯107来进行。
该化合物的详细的合成情况按照合成106所述的相同方法。
实施例27氟尿苷酯前体药的相对毒性氟尿苷是一种胞毒抗肿瘤的核苷类似物，其临床上用于治疗各种组织中的实心肿瘤。但是，氟尿苷对正常组织是有毒的，特别是对骨髓和肠胃的上皮有毒。通过用把肿瘤细胞作为目标的催化抗体或酶活化的氟尿苷前体药明显改善了氟尿苷的指数。最好该前体药不被内原酶活化，而很容易被催化抗体活化。
通过直接法制备裂开酯的催化抗体。连到氟尿苷的5′-位上的酯取代基使其变的无毒，并保护其不被尿苷磷酸化酶降解。把氟尿苷的5′-苯甲酸酯和取代的5′-苯甲酸酯前体药给鼠药，测定在苯甲酸酯部分上的取代基是否能改善被内采酶的脱酯作用，由此使得前体药比氟尿苷本身的毒性明显的低。
方法以下列剂量，通过腹膜内注射，把氟尿苷(FUrd)和氟尿苷前体药给药于几组(n=7)20克重的雄Balb/c鼠1．氟尿苷10mg/Kg,2．氟尿苷50mg/Kg，3．氟尿苷100mg/Kg，4．5′-苯甲酰基氟尿苷(BZ-FUrd)139.7mg/Kg，5．5′-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氟尿苷(TMB-FUrd)156.9mg/Kg，6．5′-(3,4,5-三甲基氧苯甲酰基)氟尿苷(TMOX-FUrd)175.2mg/Kg。
三种氟尿苷的芳族脂的剂量是摩尔当量的100mg/Kg氟尿苷。
第七组(对照组)仅仅注射液料(0.4ml 10％DMSO在0.9％盐水中)。
氟尿苷或它的前体药给药后7天，从后眼窝的窦房结取血样，测定不同的血细胞计数，从每一个鼠的一个腿采集细胞，以计数总的骨髓细胞结构，并采集脾脏及称重。也测定体重。
结果以尿嘧啶给药，结果是血细胞计数和骨髓细胞计数的取决剂量的减小。
100mg/Kg氟尿苷使得体重和脾重明显的减少。5′-苯甲酰基氟尿苷(139mg/kg)。预期其要被鼠酯酶活性裂开。其在毒性方面大约等于摩尔当量的单独的氟尿苷(100mg/Kg)，如所有的试验的指数所反映的情况。
5′-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氟尿苷(TMB-FUrd)产生很少的毒性，仅红细胞计数明显低于对照值。由测定的骨髓细胞计数和中性白细胞计数所示，这种化合物对骨髓产生很少的损害，仅是1/10摩尔当量的氟尿苷(Furd 10mg/Kg)。
5′-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)氟尿苷(TMOX-FUrd)的毒性比1/2摩尔当量的氟尿苷(FJ 50mg/Kg)稍低。
数据列于表1和2。
表1细胞构成组 体重克脾重(mg) 骨髓(106细胞/腿)对照20.1±0.5 89.9±3.4 8.28±0.69FUrd 10mg/kg 89.9±2.0ns 5.83±0.77*FUrd 50mg/kg 69.6±2.4*2.85±0.16*FUrd 100mg/kg 16.3±0.6*57.7±2.5*0.98±0.19*BZ-FUrd 17.5±0.6*61.8±1.2*1.23±0.10*TMB-FUrd19.6±0.4ns99.2±4.4ns7.88±0.47nsTMOX-FUrd 20.0±0.5ns73.3±3.5*3.42±0.29*图表符号*表明比对照值明显地低，P＜0.05；ns表明与对照组(未处理的)没有差别。
表2氟尿苷和氟尿苷前体药的相对毒性-血细胞计数组 血小板(K/ml) 中性白细胞(K/ml) 红细胞(K/ml)对照741±15 1.747±.7379.01±0.09FUrd 10mg/kg705±14ns607±330ns 8.33±0.09*FUrd 50mg/kg433±39*.020±.036*7.81±0.11*FUrd 100mg/kg 155±20*.010±.019*7.59±0.25*BZ-FUrd 209±31*.011±.030*7.76±0.22*TMB-FUrd707±23ns1.30±.338ns 8.69±0.07*TMOX-FUrd 628±27*.093±.039*7.65±0.11*图表符号*指明大大低于对照值，P＜.05；ns表明与对照组(未处理的)没有差别。
实施例27a在高剂量下5-氟尿苷酯前体药的相对毒性在类似于实施例27所述的实验中，以高剂量用鼠试验2,4,6-三甲氧基苯甲酰基5-氟尿苷和2,6-二甲氧基苯甲酰基5-氟尿苷的毒性，以便确定最大容许剂量。
部分Ⅰ用如下的6组Balb C雌鼠，比较2,4,6-三甲氧基苯甲酰基5-氟尿苷与5-氟尿苷及对照物的毒性。1)对照-盐水 0.2mli.p. 5只鼠2)FlUrd 10mg/kg 5只鼠3)FlUrd 50mg/kg 5只鼠4)三甲氧基苯甲酰基FlUrd(TMOXFlUrd)(摩尔当量100mg/kg FlUrd)158mg/kg5只鼠5)TMOXFlUrd 316mg/kg(摩尔当量200mg/kg FlUrd)5只鼠6)TMOXFlUrd 790mg/kg(摩尔当量500mg/kg FlUrd)3只鼠给药后7天，从后眼窝的窦房结取血样，测定血细胞计数的差别。结果如下表3所示，仅仅在最高剂量，相应于500mg/kg，对该前体药改善了血细胞计数，在该剂量所示的毒性大约相当于稍大于10mg/kg的FlUrd药本身的剂量，表明毒性比约为50∶1。当与FlUrd药比较时，只要这些前体药显著的降低了它们的毒性，这些高剂量的前体药就不会杀死动物。
表3FlUrd与2,4,6-三甲氧基苯甲酰基FlUrd比较的结果WBC 血小板 中性白细胞淋巴细胞组 k/μl k/μl k/μl k/μl对照 10.32±0.34 730.6±33.7 1.635±0.259 8.31±0.22FlUrd 10mg/kg 9.82±0.89ns 683.8±25.6ns 0.654±0.200*8.79±0.76nsFlUrd 50mg/kg 12.03±0.77ns 312.3±45.3*0.058±0.033*11.90±0.76TMOX FIUrd10.22±0.80ns 730.6±58.7ns 1.674±0.212ns 7.91±0.64100mg/kgnsTMOXFlUrd 9.28±0.32ns 833.8±79.6ns 0.985±0.167ns 7.83±0.15200mg/kgnsTMOX FlUrd7.23±0.24*771.7±29.5ns 0.513±0.231*6.60±0.20500mg/kg图表符号*表示大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。
部分Ⅱ用如下的8组Balb C雌鼠，比较高剂量的2,6-二甲氧基苯甲酰基5-氟尿苷与5-氟尿苷及对照物的毒性。1)对照-盐水0.2mli.p. 7只鼠2)FlUrd 5mg/kg6只鼠3)FlUrd 10mg/kg6只鼠4)FlUrd 50mg/kg6只鼠5)FlUrd 100mg/kg 6只鼠6)2,6二甲氧基苯甲酰基FlUrd(DMOX FlUrd)摩尔当量100mg/kg FlUrd 6只鼠7)DMOXFlUrd，摩尔当量200mg/kg FlUrd 6只鼠8)DMOX FlUrd，摩尔当量500mg/kg FlUrd 5只鼠给药后7天，由后眼窝的窦房结取血样，测定血细胞计数的差别。结果如下表4所示，在该实验中使用大剂量的2,6二甲基苯甲酰基氟尿苷，通过测量白血细胞、血小板、中性白细胞和淋巴细胞，表明没有产生明显的毒性。该前体药特别是在其高剂量时是很无毒的，对于中性白细胞其与FlUrd的毒性比大于50∶1，白细胞类型大部分对胞毒化学治疗药都很敏感。
表4FlUrd与2,6二甲氧基FlUrd对血细胞计数的影响WBC 血小板 中性白细胞 淋巴细胞组 k/μl k/μl k/μl k/μl对照 7.34±0.46 769.1±26.4 0.971±0.1416.02±0.33FlUrd 5mg/kg 7.43±0.55ns 736.0±37.2ns 1.473±0.386ns 5.58±0.38nsFlUrd 10mg/kg 8.27±0.64ns 820.5±34.6ns 0.637±0.084ns 7.16±0.59nsFlUrd 50mg/kg 4.88±0.70*489.0±72.3*0.208±0.183*4.62±0.51*FlUrd 100mg/kg 1.88±0.46*178.3±14.8*0.007±0.003*1.87±0.46*DMOX FlUrd 7.48±0.29 784.3±11.9 1.335±0.1015.86±0.37100mg/kgDMOX FlUrd 9.90±0.76 895.0±25.9 2.083±0.2427.43±0.76200mg/kgDMOX FlUrd 9.02±0.59 909.6±30.3 1.972±0.1946.78±0.60500mg/kg图表符号*表示大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。
实施例28:5-氟尿苷和5′-β-半乳糖基氟尿苷的相对毒性5′-β-半乳糖基氟尿苷(Gal-Furd)是一种氟尿苷的前体药，其可以被非哺乳动物的酶β-半乳糖苷酶或被合适的催化抗体活化。关键的问题是这样一种程度，在这种情况下，共价连接到5′位上的糖降低了氟尿苷的毒性。对抗肿瘤的氟化的嘧啶类似物，初级的限定剂量的毒性是对骨髓的损害。用鼠，用血细胞计数和骨髓细胞计数作为毒性指数，试验氟尿苷与Gal-Furd的毒性。此外，如果前体药可以在体内被酶活化的话，Gal-Furd与酶β-半乳糖苷酶一起给药来测定。
1)对照-盐水0.2mli.p.
2)氟尿苷-10mg/kgi.p.
3)氟尿苷-100mg/kgi.p.
4)Gal-Furd-160mg/kgi.p.(摩尔当量100mg/kg氟尿苷)5)β-半乳糖苷酶-5mg/kgi.p.
6)Gal-Furd 160mg/kg+β-半乳糖苷酶
5mg/kgi.p.(分别注射，-β半乳糖苷酶给药后Gal-Furd给药)氟尿苷或Gal-Furd给药后7天，从后眼窝的窦房结取血样，测定不同的血组胞计数，并采集每只鼠的一条腿的细胞，计算总的骨髓细胞构形；也采集脾脏，测定其重量。
结果氟尿苷给药后7天，结果是所有的试验的血液学指数都显著下降。相反，Gal-Furd给药后7天，血细胞和骨髓细胞计数都在Balb/c鼠的正常值范围内。Gal-Furd和β-半乳糖苷酶共同给药(每种药分别注射给药，所以在约药之前，前体药和酶不接触)，结果产生了血液学毒性，表明相对非毒的前体药通过体内酶β-半乳糖苷酶的作用而转化成活性胞毒药。这些结果汇集在表5及6和图25中。
表5Furd和Gal-Furd对脾重和骨髓细胞构成的影响骨髓细胞构成组 脾wt(Mg)(106细胞/腿)对照92.8±3.58.86±1.09Furd 10mg/kg100.5ns ---------Furd 100mg/kg 53.2±2.1*0.96±0.25*Gal-Furd 160mg/kg 89.9±3.4ns 9.70±0.81ns半乳糖苷酶 91.3±1.9ns ---------Gal-Furd+半乳糖苷酶 80.2±4.3*4.04±0.84*图表符号*表示大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。
表6Furd与Gal-Furd对血细胞计数的影响组血小板 中性白细胞 淋巴细胞(k/ml) (k/ml) (M/Ml)对照 833±2.25±.22 10.37±0.68Furd 10mg/kg 809±28ns 0.75±.15*7.28±0.67*Furd 100mg/kg242±12*0.08±.02*3.07±0.23*Gal-Furd 160mg/kg770±25ns 1.90±.22nd 7.39±0.45*Gal-Furd+半乳糖苷酶 572±39*0.74+.07*4.78+0.21*图表符号*表示大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。
实施例28a高剂时5-氟尿苷和5′-β-半乳糖基氟尿苷的相对毒性用类似于实施例28所述的试验方法，试验较大剂量的5′-β-半乳糖基氟尿苷，以确定前体药的毒性极限。将雌Balb C鼠分成小组并单独用下述的药剂量注射给药处理1)FlUrd150mg/kg5只鼠2)FlUrd200mg/kg5只鼠3)FlUrd250mg/kg5只鼠4)半乳糖基FlUrd750mg/kg3只鼠5)半乳糖基FlUrd1500mg/kg 3只鼠每天检查鼠的死亡率和毒性的征状。氟尿苷给药7天，从每一组中的2只鼠取血样。结果该试验的结果列于下表7。药物处理之后开始的大约5天，接受氟尿苷的所有鼠开始头屑满顶并失去大约其20％的体重。接受半乳糖基氟尿苷的鼠在任何时间都没有表现出明显的毒性征状。
中性白细胞计数是由氟尿苷引起的最敏感的骨髓损害的标志。1500mg/kg剂量的Gal-FlUrd改变的中性白细胞计数小于10mg/kg剂量的氟尿苷。1500mg/kg Gal-FlUrd后的中性白细胞计数实际上都在正常范围(1-2.5k细胞/微升)。在体内Gal-FlUrd与FlUrd对骨髓的毒性比大于100∶1，即FlUrd对骨髓的毒性大于Gal-FlUrd的100倍。
Gal-FlUrd在150mg/kg剂量对Balb C鼠基本上无毒。这一剂量远高于在包括以通过抗连锁的催化蛋白质活化氟尿苷前体药为目标的治疗方案中要给予的剂量。
表7FlUrd与高剂量的Gal-FlUrd对死亡率和血细胞计数的影响。A.死亡率组死亡率FlUrd 150mg/kg 2/5FlUrd 200mg/kg 5/5FlUrd 250mg/kg 5/5Gal-FlUrd 750mg/kg 0/3Gal-FlUrd 1500mg/kg0/3
用氟尿苷处理之后直到10天还没有鼠死亡。所有死亡的动物都在约药后的第10-15于。对鼠所公开的5-氟尿苷的LD50是160mg/kg，其与在该研究当中作为氟尿苷剂量的函数所得到的死亡率结果很一致。B．血细胞计数WBC 中性白细胞 血小板组k/μ k/μ k/μFlUrd 150mg/kg1.00.015145.5FlUrd 200mg/kg0.80.02 115FlUrd 250mg/kg0.75 0.01 98Gal-FlUrd 750mg/kg7.25 1.705862Gal-FlUrd 1500mg/g6.61.315835因为每一组仅有2只鼠作了血细胞计数采样，所以仅给出平均值而没有统计值。实施例29环磷酰胺和氧代磷酰胺二乙基缩醛的相对毒性环磷酰胺是一种抗肿瘤的烷基化剂，其必须在肝中酶催经转化形成它的活性胞毒分解代谢产物的前体。因此，虽然环磷酰胺是一种临床上重要的药物，但是它本身不是进行输送的合适的选择物。它的活性胞毒分解代谢产物前体例如氧代磷酰胺是不稳定的。氧化磷酰胺的二乙基缩醛作为氧代磷酰胺的前体药来制备，氧代磷酰可以在单个催化步骤用合适的催化蛋白质例如催化抗体来活化。在该试验中，把环磷酰胺和氧代磷酰胺二乙基缩醛给鼠用药，以确定是否氧代磷酰胺二乙基缩醛实际上是相对无毒的，因此适于用抗体-催化剂结合物进行活化。
将雌鼠Balb/C鼠(20克)分成4组，每组7只。
1)．对照-盐水0.2mli.p.
2)．环磷酰胺(CYP)-30mg/kgi.p.
3)．环磷酰胺-150mg/kgi.p.
4)．氧代磷酰胺二乙基缩醛(ALP-DEA)-188mg/kgi.p.(摩尔当量150mg/kg环磷酰胺)。
给药以后四天，从后眼窝的窦房结取血样，测定差异的血细胞计数，并采集每只鼠的一个腿的细胞，以计算总的骨髓细胞构成。结果环磷酰胺给药(150mg/kg)后4天，所试验的所有的血液指数都明显的降低。相反，氧代磷酰胺二乙基缩醛给药后4天，白血细胞和骨髓细胞计数都在Balb/C鼠的正常值的范围。实际上，氧代磷酰胺二乙基缩醛没有减少中性白细胞计数，通过减少环磷酰胺的剂量(30mg/kg)可明显减少中性白细胞计数。也许，中性白细胞计数是由环磷酰胺的活性分解代谢产物引起的造血损害的最敏感指数。因此，与环磷酰胺比较，氧代磷酰胺二乙基缩醛对造血的细胞是相对无毒的。
表8环磷酰胺与氧代磷酰胺二乙基缩醛对骨髓细胞构成的影响骨髓细胞构成组 (106细胞/腿)对照 6.33±0.45CYP 30mg/kg 6.03±0.29nsCYP 150mg/kg 2.09±0.14*ALP-DEA 188mg/kg 7.79±0.59ns注*表示比对照值显地低，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。
表9环磷酰胺与氧代磷酰胺二乙基缩醛对血细胞计数的影响中性白细胞淋巴细胞血小板组(K/μl) (M/μl) (K/μl)对照 1.11±.105.59±0.44 775±25CYP 30mg/kg 0.47±.084.14±0.19*796±20nsCYP 150mg/kg 0.04±.0.1*1.98±0.12*591±14*ALD-DEA 188mg/kg 1.20±.18ns 5.52±0.40ns 743±12ns注*表示大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。实施例30左旋苯丙氨酸氮芥、苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥和3,4,5-三甲氧基苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥的相对毒性左旋苯丙氨酸氮芥是氮芥的苯丙氨酸衍生物，其也称作L-苯丙氨酸氮芥。这种烷基化剂常常用于治疗多发性骨髓瘤、乳房癌和卵巢癌，并且已有报导其对恶性黑瘤有一定的好效果。左旋苯丙氨酸氮芥的毒性主要是对血液的，其类似于其他烷基化剂的毒性。
制备苯甲酰基和3,4,5-三甲氧基苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥作为左旋苯丙氨酸氮芥的前体药，指定该前体药要用单步骤的催化抗体分裂来活化，使其释放该活性药，左旋苯丙氨酸氮芥。
在本实验中，比较该前体药与活性药的血液毒性。该前体药以相当于5、10和20mg/kg左旋苯丙氨酸氮芥的量给药。把Balb C雌鼠分成10组，每组6只，这些鼠以如下的药物和剂量给药1)．对照-盐水0.2mli.p.
2)．左旋苯丙氨酸氮芥(Mel)5mg/kgi.p.
3)．左旋苯丙氨酸氮芥 10mg/kgi.p.
4)．左旋苯丙氨酸氮芥 20mg/kgi.p.
5)．苯甲酰基左旋苯丙氨氮芥(BMel)(5mg/kg摩尔当量的Mel)6)．B Mel(10mg/kg摩尔当量的Mel)7)．B Mel(20mg/kg摩尔当量的Mel)8)．3,4,5-三甲氧基苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥(TMB)(5mg/kg摩尔当量的Mel)9)．TMB(10mg/kg摩尔当量的Mel)10)．TMB(20mg/kg摩尔当量的Mel)给药之后四天，从后眼窝的窦房结取血样，测定不同的血细胞计数。结果如下表10所示，左旋苯丙氨酸氮芥给药后四天，所有试验的血液指数都显著的降低。相反，前体药给药之后，白血球计数或者没有显著改变(某些情况下稍有升高)，或者当稍微减少前体药的最大剂量时也没不会减少计数到接近最低剂量的左旋苯丙氨酸氮芥的值。对任何剂量的二种前体药，中性白细胞计数都没有改变，其都在正常值。因此，二种前体药表明它们的毒性显著降低，比左旋苯丙氨酸氮芥降低得多。
表10左旋苯丙氨酸氮芥与苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥及三甲氧基苯甲酰基左旋苯丙氨酸氮芥对血细胞计数的影响
WBC淋巴细胞 血小板中性白细胞对照7.34±0.46 769.1±26.4 0.971±0.141 6.02±0.33Mel 5mg/kg 2.66±0.21*779.6±42.6ns 0.354±0.036*2.18±0.19*Mel 10mg/kg 1.28±0.09*643.0±28.9*0.078±0.011*1.17±0.07*Mel 20mg/kg 0.06±0.08*570.0±41.5*0.026±0.007*0.58±0.08*BMel 5mg/kg 5.34±17.5ns 746.3±17.5ns 0.980±0.105ns 4.09±0.48*B Mel 10 5.34±0.31*869.6±20.1 1.141±0.157ns 3.98±0.26*mg/kgB Mel 20 5.49±0.37*881.9±12.8 1.357±0.190ns 3.76±0.20*mg/kgTMB mel 5 6.88±0.36ns 681.2±26.2*1.126±0.178ns 5.38±0.46mg/kgnsTMB mel 10 4.67±0.28*723.2±23.0ns 0.995±0.110ns 3.45±0.18*mg/kgTMB mel 20 5.54±0.41*755.4±26.4ns 0.928±0.099ns 4.44±0.48*mg/kg图表符号*表明大大低于对照值，P＜.05；ns表示与对照组(未处理的)没有差别。实施例31制备前体药，四(2-氯乙基)氧代磷酰胺二乙基缩醛，化合物112。
对本实施例中，黑体编号的化合物，请参考图40。
磷酰胺二氯化物36与双(2-氯乙基)胺反应，生成磷酰胺氯化物111，然后其与3,3-二乙氧基-1-丙醇的醇锂反应形成前体药112。
详细的合成方法如下N,N,N′,N′-四(2-氯乙基)磷酰二胺氯化物111在室温，将三乙胺(1.18ml，8.4mmol)加到二氯化物36(1.0g,3.9mmol)、双(2-氯乙基)胺盐酸盐(0.758g,4.2mmol)和38ml甲苯的混合物中。然后回流下加热该混合16小时。冷却到室温后，用10％KH2PO4(2×20ml)洗涤该混合物，用乙醚(2×10ml)萃取含水相，将混合的有机相浓缩，并用闪蒸色谱法(25％乙酸乙酯/己烷，在30％乙酸乙酯/己烷中产物Rf0.25)提纯，得到0.52g油(37％)；1HNMR(CDCl3)d 3.45-3.63(m,8),3.65-3.78(m,8)。化合物112的合成在室温，将正丁锂在己烷(0.81ml,2.0mmol)中的2.5M溶液加到3,3-二乙氧基-1-丙醇(0.91ml,1.3mmol)d 6ml THF中的溶液中，30分钟后，将反应混合物冷却到0℃，并加入氯化物111(0.47g,1.3mmol)。让混合物升至室温，1小时后，加10％NaHaPO4溶液(8ml)，用乙醚萃取(3×8ml)该混合物，用无水MgSO4干燥有机相，真空中蒸发溶剂。用闪蒸色谱法(用25,30,40和50％乙酸乙酯/己烷洗脱，在30％乙酸乙酯/己烷中产物Rf0.22)提纯残余物，得到132mg油状产物(21％)；IR(纯的)2976,2932,2899,2879,1455,1375,1347,1306,1225,1132,1088,1056,980,921,893,760,723,658cm-1；1H HMR(CDCl3)d1.22(t,6 J=7.0Hz),2.00(q,2,J=6.1Hz),3.36-3.70(m,20),4.11(q,2,J=6.4Hz),4.63(t,1,J=5.6Hz)；13C NMR(CDCl3)d 15.30,34.72,34.82,42.31,49.65,49.71,61.70,62.20,99.83.
实施例32制备实施例31中前体药的半抗原四(2-氯乙基)氧代磷酰胺二乙基缩醛的三甲基胺盐类似物，化合物119。
对本实施例中黑体编号的化合物参考图41。
先制备连接体部分，然后连到半抗原的磷上。甘氨酸的氮被保护为对硝基苄基尿烷形成化合物113。然后，羧基被保护为N-羟基琥珀酰亚胺酯，形成化合物114，其与过量的哌嗪反应，形成连接体部分，化合物115。化合物115与二氯化物36反应，形成-氯化物116。化合物116与2-(二甲基氨基)乙醇的醇锂反应，得到偶磷二酰胺117。将化合物117的叔胺用Mel季胺化，得到化合物118。试图使化合物118的类似物去保护，在这里甘氨酸被保护为低活性苄基尿烷，未成功；但是，很容易除去更不稳定的对硝基苄基尿烷保护基，得到半抗原119。
详细的合成方法如下化合物113的合成将4-硝基苄基氯甲酸酯(3.16g,14.6mmol)在15ml二噁烷中的溶液加到甘氨酸(1.0g,13.3mmol)在7ml水中的溶液中，用三乙胺保持溶液的pH为9。搅拌该混合物65小时。然后用乙醚洗涤混合物，调整含水相的pH到1，用乙酸乙酯萃取混合物，用无水MgSO4干燥有机相，真空中蒸出溶剂，得到3.9g油状产物；1HNMR(CDCl3)δ4.05(d,2,J=6Hz),5.23(s,2),5.43(d,1),7.52(d,2,J=8Hz),8.22(d,2,J=8Hz).
化合物114的合成在室温下,将吡啶(1.24ml,15.4mmol)和N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3.93g,15.3mmol)加到酸113(3.9g,15.3mmol)和76ml乙腈的混合物中。16小时后，真空中蒸发溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯并用水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，真空中蒸出溶剂，得到4,41g油状产物(82％)。
化合物115的合成将化合物114(4.4g,12mmol)在400ml CH2Cl2中的溶液滴加到迅速搅拌的冷却到-78℃的哌嗪(5.4g,63mmol)和1000ml CH2Cl2的混合物中。将混合物升至室温过夜。浓缩该混合物到200ml体积，用5％HCl萃取，用Na2CO3调节含水层的PH到9，并用乙酸乙酯和CH2Cl2萃取含水层。用无水Na2SO4干燥有机相，真空中蒸出溶剂，用闪蒸色谱法(10％甲醇/CH2Cl2，产物Rf0.19)提纯产物，得到15.0g油(37％)；1H NMR(CDCl3)d 2.84(bs,4),3.36(bs,2),3.58(bs,2),4.01(bs,2),5.20(bs,2),6.00(bs,1),7.49(d,2,J=8Hz),8.17(d,2,J=8Hz).
化合物116的合成将三乙胺(0.24ml,1.7mmol)加到胺115(0.55g,1.7mmo1)和9ml甲苯的混合物中，然后加二氯化物36(0.44g,1.7mmol)，将混合物在回流下加热14小时，在此期间，形成一些深色不溶的物质。将混合物冷却，倒入饱和NaH2PO4中，并用乙酸乙酯和CH2Cl2萃取，用无水Na2SO4干燥有机相，真空中蒸出溶剂，用闪蒸色谱法(90％乙酸乙酯/己烷，在乙酸乙酯中产物Rf0.65)提纯产物，得到0.2g油(22％)；1H NMR(CDCl3)δ3.23-3.40(m,4),3.40-3.63(m,6,3.63-3.84(m,6),4.00-4.07(m,2),5.23(s,2),5.87(s,1),7.53(d,2,J=8Hz),8.22(d,2,J=8Hz).
化合物117的合成在0℃，将正丁基锂在己烷(0.154ml,0.39mmol)中的2.5M溶液加到2-(二甲基氨基)乙醇(37ml,0.37mmol)在1.5ml THF中的溶液中。在室温下搅拌混合物1小时。将溶液再冷却到0℃，并加氯化物116(0.2g,0.37mmol)在2.5ml THF中的溶液。在室温下将混合物搅拌1.5小时。然后，将大约100ml三乙胺加到混合物中，在真空下蒸出挥发组分，用闪蒸色谱法(5％甲醇/CH2Cl2，在10％甲醇/CH2Cl2中产物Rf0.44)提纯产物。将产物溶于乙酸乙酯中，并用5％NaHCO3洗涤。用无水Na2SO4干燥有机层后，蒸出溶剂，得到0.1g油状产物(46％)；1H NMR(CDCl3)δ2.25(s,6),2.54(t,2,J=5Hz),3.08-3.23(m,4),3.28-3.45(m,6),3.52-3.69(m,6),3.95-4.01(m,2),4.01-4.14(m,2),5.18(s,2),5.95(s,1),7.47(d,2,J=8Hz),8.16(d,2,J=8Hz).
化合物118的合成在室温下，将甲基碘(30ml,0.48mmol)加到胺117(100mg,0.16mmol)在2ml THF中的溶液中，经过24小时，形成黄色不溶的油状物。真空中蒸发挥发组分，得125mg黄色油；IR(CD3OD)2952,2855,1709,1651,1607,1522,1453,1412,1372,1350,1277,1235,1220,735,725cm-1；1H NMR(CD3OD)d 3.27(s,9),3.19-3.61(m,12),3.71(dd,4,J=6.3,6.3Hz),3.82(bs,2),4.03(s,2),4.50(bs,2),5.23(s,2),7.60(d,2,J=8,2Hz),8.21(d,2,J=8.2Hz).
化合物119的合成将化合物118(124.6mg,0.17mmol)溶于6ml 1∶1甲醇和水中，加10％pd-C(12mg)，在氢气氛下搅拌该混合物18小时。用硅藻土板过滤该混合物，用1∶1甲醇和水洗涤，真空中除去挥发组分，得到89mg黄色固体(94％)；1H NMR(CD3OD)d 3.29(s,9),3.16-3.30(m,4),3.38-3.56(m,6),3.56-3.68(m,4),3.68-3.79(m,4),3.82-3.90(m,2),4.50(bs,2).实施例33制备实施例31中的前体药的半抗原四(2-氯乙基)氧代磷酰胺二乙基缩醛的二丙基甲基铵盐类似物，化合物121。
对本实施例中的黑体编号的化合物参考图42。
按照W.W.Hartmann在Organic syntheses,Collective Vol.11；Blatt,A.H.,Ed；John wiley&Sons:New york,(1943):183-184(此文在此列为参考文献)中的方法制备2-(二正丙基氨基)乙醇，化合物120。化合物120与化合物116反应，在另外的二个步骤中转化产物，得到半抗原121。
详细的合成方法如下2-(二-正丙氨基)乙醇120
化合物120是用二丙胺和2-氯乙醇按照Organic Syntheses上的Hartman,W.W.的方法(Collective Vol.Ⅱ；Blatt.A.H.,Ed.；John wiley&Sons；New York(1943):183-184，此文在此引入做为参考)合成的。
合成化合物121化合物121是按照由化合物116和2-(二乙氨基)乙醇合成化合物119所用的方法，由化合物116和120合成的(参看实施例32)。实施例34制备前体药，分子内的二(2-羟基乙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷，化合物128。
该实施例中黑体编号的化合物参见图43。
2-溴乙醇被保护为对甲氧基苄醚，得到化合物122。缩合2,6-二羟基苯甲酸和甲醇生成化合物123。使用溴化物122使化合物123二烷基化得到化合物124。为了测定前体药128对不希望的非催化的内酯化和伴随释放该药的稳定性，将化合物124去保护，生成化合物125。将化合物125溶于0.9％在D2O中的NaCl溶液。在室温下静置96小时后在这个样品的1HNMR谱上没有观察到变化。皂化化合物124得到酸126，将酸126与化合物65缩合，得到化合物127。化合物127酸性脱保护得到前体药128。
详细的合成方法如下2-(4-甲氧基苄氧基)溴乙烷122在室温下，将三氟甲烷磺酸(30ml)加到2-溴乙醇(0.5ml,6.7mmol)、4-甲氧基苄基三氯乙酸酰胺酯(3.8g,13.4mmol)和15ml THF的混合物中。一小时后，加5％的NaCHO3中和该反应，用乙酸乙酯萃取该混合物，有机层用无水MgSO4干燥，浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯(用0.1和2.5％乙酸乙酯/己烷洗脱，产物在10％乙酸乙酯/己烷中Rf0.48)得到1.3g油(79％)；1HNMR(CDCl3)d 3.49(t,2,J=7Hz),3.79(t,2,J=7Hz),3.82(s,3),4.55(s,2),6.91(d,2,J=9Hz),7.21(d,2,J=9Hz).2,6-二羟基苯甲酸甲酯123将DCC(26.3g 127mmol)加到2,6-二羟基苯甲酸(10g,64mmol)和200ml甲醇与CH2Cl2的1∶1混合物的混合物中，在室温下将此混合物搅拌64小时。然后过滤除去不溶物，在真空下浓缩所得的溶液，残留物溶于乙酸乙酯中再过滤，滤液用水和盐水洗涤，用无水MgSO4干燥，浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯(10％乙酸乙酯/己烷，产物Rf0.29)得到8.14g无色固体(76％)；1H HMR(CDCl3)d 4.08(s,3),6.48(d,2,J=8Hz),7.31(dd,1,J=8Hz).
2,6-二[2-(4-甲氧基苄氧基)乙氧基]苯甲酸甲酯124在室温下将联苯酚123(50mg,0.30mmol)、溴化物122(292mg,1.19mmol)、K2CO3(414mg,3.0mmol)和6ml DMF的混合物搅拌6小时。然后再另外加一些K2CO3，再过17小时之后，将该混合物于80℃下加热1小时。冷却后加1M HCl将混合物的pH值调到5。该混合物在乙酸乙酯和水之间分配，有机层用无水MgSO4干燥，真空蒸发溶剂，残留物用闪蒸谱法(30％乙酸乙酯/己烷，产物在50％乙酸乙酯/己烷中Rf0.58)提纯，是到87mg油状产物(59％)；1HNMR(CDCl3)d 3.79-3.90(m,4),3.81(s,6),3.85(s,3),4.20(dd,4,J=5,5Hz),4.59(d,2,J=9Hz),6.93(d,4,J=9Hz),7.27(dd,1,J=9,9Hz),7.31(d,4,J=9Hz).
2,6-二(2-羟基乙氧基)苯甲酸甲酯125将8.7mg 10％Pd-C加到化合物124(87mg,0.18mmol)在3ml甲醇中的溶液中，该混合物在氢气氛下于室温搅拌1小时。通过硅藻土(Celite)过滤除去催化剂，用甲醇洗涤。真空蒸发溶剂，残留物通过制备性薄层色谱(TLC)(产物在70％乙酸乙酯/己烷中Rf0.54)提纯得到31mg油状产物(79％)，1H NMR(CDCl3)d 3.82-3.96(m,4),3.92(s,3),4.08-4.20(m,4),6.58(d,2,J=8Hz),7.29(dd,1,J=8,8Hz)；(0.9％NaCl在D2O)d 3.90(dd,4,J=4,4Hz),3.97(s,3),4.17(dd,4,J=4,4Hz),6.79(d,2,J=8Hz),7.45(dd,1,J=8,8Hz).
二醇酯125对内酯化的稳定性将二醇酯125的样品溶于0.9％NaCl的D2O溶液中。这个样品在室温下静置96小时后在1H NMR谱上没有观察到变化。
2,6-二[2-(4-甲氧基苄氧基)乙氧基]苯甲酸(126)将1N NaOH(25ml)加到化合物124(1.22g,2.46mmol)和30ml二噁烷的混合物中，然后将10ml MeOH加到该混合物中以有助于维持溶液均匀。混合物用油浴于100℃加热24小时。将混合物冷却到室温，用1N HCl将该溶液的pH调到5。混合物倒入乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，真空浓缩。粗产品1.1g，不用进一步精制就可使用，Rf0.40(5％MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(CDCl3)d3.76-3.89(m,10),4.19(dd,4,J=9,9Hz),4.55(s,4),6.59(d,2,J=8Hz),6.88(d,4,J=8Hz),7.24-7.37(m,5).
合成化合物127将化合物65(81mg,0.27mmol)加到化合物126(516mg,1.07mmol),864ml吡啶和1ml CH2Cl2的混合物中，然后加入EDC(205mg,1.07mmol)和DMAP(65mg,0.53mmol)，将该混合物于80℃下加热24小时。将该混合物冷却至室温，加入10ml MeOH。再过30分钟后，真空蒸发挥发性组分，残留物溶于乙酸乙酯中，用饱和NaHCO3、水、饱和NH4Cl和水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，真空浓缩。用闪蒸色谱法(用20、30、40、50和60％乙酸乙酯/己烷洗脱)提纯残留物，得到154mg产物(75％)；Rf0.50(60％的乙酸乙酯己烷溶液)；1H NMR(CDCl3)d1.34(s,3),1.57(s,3),3.71-3.76(m,4),3.79(s,6),4.16(dd,4),4.29(dd,1,J=2.5,12.2Hz),4.46(d,1,J=3.1Hz),4.46(d,2,J=12.6Hz),4.50(d,2,J=12.6Hz),4.66-4.74(m,2),4.82(dd,1,J=3.2,6.1Hz),5.90-5.91(m,1),6.57(d,2,J=8.5Hz),6.86(d,4,J=8.6Hz),7.24(d,4,J=8.6Hz),7.28(d,1,J=8.5Hz),7.42(d,1,J=6.2Hz),9.11(d,1,J=4.2Hz).
合成化合物128按照合成化合物1a的方法进行反应。实施例35制备实施例34中的前体药的半抗原二(2-羟基乙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷的环状膦酸酯类似物，化合物137。
本实施例中的黑体编号的化合物参看图44。
用溴化物122使间苯二酚单烷基化得到化合物129。酚129磷酸化得到磷酸三酯130，用LDA邻位锂化后，将三酯130进行磷迁移，得到化合物131。用碳酸亚乙酯或乙二醇亚硫酸酯使化合物131羟乙基化得到化合物132，化合物132在高稀释条件下环化得到化合物133。皂化得到酸134，将酸134活化并与化合物3f反应得到化合物135。化合物135的甲苯酰基断开得到化合物136，化合物136脱保护并还原得到半抗原137。
详细的合成方法如下合成化合物129在室温下搅拌间苯二酚(5mmol)、化合物122(1mmol)、K2CO3(5mmol)和25ml的DMF的混合物直到原料耗尽(通过TLC观察)，该混合物0.1M HCl中和，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用无水MgSO4干燥、浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色油状产物。
合成化合物130将氯代磷酸二苯酯(1.2mmol)和5ml CH2Cl2的混合物加到冷却到0℃的化合物129(1mmol)和5ml吡啶的混合物中。当通过TLC观察原料消耗之后，真空蒸发挥发性组分，残留物在乙酸乙酯和0.1M HCl之间分配，有机相用无水MgSO4干燥，浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色油状产物。
合成化合物131将1.5M的LDA的THF(1.1mmol)溶液滴加到冷却到-78℃的化合物130(1mmol)的THF(20ml)的溶液中。当通过TLC观察原料消耗之后，该混合物在乙酸乙酯和0.1M HCl之间分配。有机相用无水MgSO4干燥，浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色油状产物。
合成化合物132将化合物132(1mmol)、碳酸亚乙酯或乙二醇亚硫酸酯(10mmol)、K2CO3(10mmol)与50ml DMF的混合物于100℃下加热直到原料消耗尽为止(通过TLC观察)。该混合物冷却到室温，用0.1M HCl中和，用水稀释，用乙酸乙酯萃取。有机相用无水MgSO4干燥、浓缩、残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色油状产物。
合成化合物133将化合物132(1mmol)、无水KF(10mmol)、18-冠-6(1mmol)和100ml THF的混合物在回流下加热直到原料消耗尽为止(通过TLC观察)。然后真空蒸发溶剂，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色油状产物。
合成化合物134将0.2M NaOH(5ml)在室温下加到化合物133(1mmol)的5ml二噁烷的溶液中。当通过TLC观察原料消耗之后，用0.1M HCl将混合物的pH调到2，该混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用无水MgSO4干燥，浓缩，用闪蒸色谱法提纯得到无色固体产物。
合成化合物135在室温下搅拌化合物134(1.1mmol)和10ml亚硫酰氯的混合物直到完全转化成酰基氯(通过1等分的用甲醇急冷的反应的1H NMR来测定)。真空蒸发未反应的亚硫酰氯。残留物溶于5ml的CH2C12中，并缓慢地加到冷却至0℃的化合物3f(1mmol)和5ml吡啶的混合物中。通过TLC观察在原料消耗之后，真空蒸发挥发性组分，残留物溶于乙酸乙酯中，有机相用饱和NaHCO3、0.1M HCl和盐水洗涤，用无水MgSO4干燥，真空浓缩。用闪蒸色谱法提纯残留物得到无色固体产物。
合成合合物136在0℃下将浓氢氧化铵(1ml)加到化合物135(1mmol)和20ml甲醇的混合物中。使溶液升温至室温。用TLC观察原料消耗之后，真空蒸发挥发性组分，残留物闪蒸色谱法提纯得到无色固体产物。
合成化合物13710％pd-C(10％重)加到化合物136(1mmol)和20％含水甲醇(10ml)的混合物中，在氢气氛下搅拌该混合物。当反应完成时，催化剂通过硅藻土过滤、用20％含水甲醇洗涤来除去。真空蒸发挥发性组分得到固体产物。实施例36制备前体药分子内的二(3-羟基丙氧基)苯甲酸酯-5-氟尿苷，化合物138。
本实施例中黑体编号的化合物参看图45使用与制备前体药128(参看实施例45)所用的相同的反应条件将3-溴-1-丙醇转化成前体药138。
详细的合成如下。
合成化合物138按照合成化合物128的方法合成化合物138，不过开始采用3-溴-1-丙醇代替2-溴乙醇。实施例37制备实施例36中的前体药的半抗原二(3-羟基丙氧基)苯甲酸楷-5-氟尿苷的环状膦酸酯类似物，化合物139。
本实施例中的黑体编号的化合物参看图46。
使用与制备半抗原137(见实施例35)所用的反应步骤相同的反应步骤，用3-溴丙基4-甲氧苄基醚(在实施例36中做为中间物制备的)将间苯二酚转化成环状膦酸酯半抗原139。
详细的合成方法如下合成化合物139按照合成化合物137的方法合成化合物139，不过开始用3-溴-1-丙醇代替2-溴乙醇。实施例38制备前体药5′-O-(2,4,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷，化合物141。
本实施例中黑体编号的化合物参看图47。
2,4,6-三甲氧基苯甲酸使用EDC与化合物65缩合得到酯140。接着，除去异亚丙基保护基得到前体药141。
详细的合成方法如下2′,3′-O-异亚丙基-5′-O-(2,44,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷1402,4,6-三甲氧基苯甲酸(300mg,1.42mmol)溶于2ml CH2Cl2中，加入1.15ml吡啶。加入化合物65(106mg,0.35mmol)，再加EDC(300mg,1.56mmol)。混合物搅拌24小时，然后加入10ml甲醇。再过30分钟后，真空蒸发挥发性组分，残留物溶于乙酸乙酯(75ml)中，用饱和NaHCO3(2×50ml)、水(15ml)、饱和NH4Cl(2×30ml)和水(15ml)洗涤。所有含水相用乙酸乙酯(50ml)萃取，有机相用无水MgSO4干燥、浓缩。残留物用制备型TLC(10％甲醇/CH2Cl2，在8％甲醇/CH2C12中Rf0.50)提纯得到100mg无色固体产物(58％)；1HNMR(CDCl3)d 1.38(s,3),1.61(s,3),3.81(s,6),3.83(s,3),4.33(dd,1,J=24,12.3Hz),4.62(dd,1,J=small,2.2Hz),4.72-4.77(m,2),4.83(dd,1,J=2.1,6.1Hz),5.92-5.93(m,1),6.11(s,2),7.58(d,1,J=6.3Hz).5′-O-(2,4,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷141化合物140(100mg,0.20mmol)和1.5ml 50％的甲酸的混合物于65℃下加热2小时。将该混合物冷却，真空蒸发挥发性组分。残留物用制备TLC(10％甲醇/CH2Cl2,Rf0.52)提纯得到无色固体产物(92％)；1H NMR(CD3OD)d 3.76(s,6),3.80(s,3),4.10-4.12(m,1),4.18(dd,1,J=5.1,5.1Hz),4.23-4.27(m,1),4.34(dd,1,J=2.6,16Hz),4.62(dd,1,J=2.2,16),5.88(dd,1,J=1.6,4.1Hz),6.21(s,2),7.76(d,1,J=6.6Hz).实施例39制备实施例38中的前体药的半抗原，尿苷的吡啶鎓醇取代的类似物，化合物149。
本实施例中的黑体编号的化合物参看图48a和48b。
按照文献的方法合成化合物142，化合物65的醛。醛基进行witting反应生成化合物143。化合物144按照文献的方法合成并溴化得到-溴化物145。人们已经知道，为了进行选择性的-溴化作用，化合物144必须过量且反应在低温下进行，否则主要产物是2,6-二溴-3,4-二甲氧基吡啶。化合物145进行锂-卤交换，活性中间物与化合物143反应得到吡啶鎓醇146。氨解得到三醇147，三醇147在更多的亲核吡啶氮存在下选择性甲基化得到季铵盐148。最后，还原得到半抗原149。
详细的合成方法如下合成化合物142按照Ranganathan,R.S.；Jones,G.H.；Moffat,J.G.J.Org.Chem.39*1974):290-298的方法(此文在此引入做为参考文献)由化合物65合成化合物142。
合成化合物143将(三苯基亚正膦基)乙醛(1.1mmol)的5ml CH2Cl2溶液在室温下加到化合物142(1mmol)在5ml CH2Cl2的溶液中。在用TLC观察原料消耗之后，该混合物浓缩至其体积的一半并用闪蒸色谱法提纯得到无色固体产物。
2-溴-3,5-二甲氧基吡啶145将溴(0.17ml,3.3mol)在66ml CH2Cl2中的溶液滴加到冷却到-78℃的3,5-二甲氧基吡啶，化合物144(1.83g,13.2mmol，按照Johnson,C.D.；Katritzky,A.R.Viney,M.J.Chem.Soc.(B),(1967):1211-1213的方法制备的，此文引入作为参考)在66ml CH2Cl2中的溶液中。一小时后，使混合物在16小时内逐渐升温到室温。真空蒸发挥发性组分，残留物在乙酸乙酯和用1M NaOH将pH调节到10的硫代硫酸钠水溶液之间分配，有机相用无水Na2SO4干燥，真空浓缩。用闪蒸色谱法(20％乙酸乙酯/己烷)分离黄色的油得到1.0g产物(在50％乙酸乙酯/己烷中Rf0.53)和1.1g回收的原料(在50％乙酸乙酯/己烷中Rf0.28)；1H NMR(CDCl3)d 3.91(s,3),3.93(s,3),6.77(bs,1),7.73(bs,1).
合成化合物146将2.5M正-BuLi的己烷(0.4ml,1mmol)溶液在0℃加到化合物145(0.9mmol)在10ml THF中的溶液中。1小时后，将混合物冷却至-78℃，将化合物146(0.9mmol)在1.5ml THF中的溶液一次加入。使该溶液在一小时后升温至室温。在用TLC观察原料消耗之后，加水，混合物用乙酸乙酯萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色固体产物。
合成化合物147浓缩的氢氧化铵(1ml)于0℃下加到化合物146(1mmol)和20ml甲醇的混合物中。使溶液升温至室温。在用TLC观察原料消耗以后，真空蒸发挥发性组分，残留物用闪蒸色谱法提纯得到无色固体产物。
合成化合物148在密封管中的化合物147(1mmol)、甲基碘(2mmol)和10ml THF的混合物于60℃下加热直到用TLC观察原料消耗为止。沉淀物过滤，用乙醚洗涤得到固体产物。
合成化合物14910％Pd-C(10％重)加到化合物148(1mmol)和20％含水甲醇(10ml)的混合物中，在氢气氛下搅拌该混合物。当反应完成时，用硅藻土过滤，用20％含水甲醇洗涤除去催化剂。真空蒸发挥发性组分得到固体产物。
实施例40环磷酰胺和3,3-二乙氧基丙基N,N′,N′,-四(2-氯乙基)二氨基磷酸酯(Tetrakis)的相对毒性在这个试验中，将环磷酰胺和3,3-二乙氧基丙基N,N,N′,N′-四(2-氯乙基)二氨基磷酸酯Tetrakis给鼠给药以确定氧代磷酰胺二乙基缩醛实际上是否相对无毒，因而适宜通过抗体-催化剂结合物对其活化。
雌Balb/c鼠(20g)分成四组，每组包括5只1．对照-盐水0.2mli.p.
2．环磷酰胺(CYP)-30mg/kgi.p.
3．环磷酰胺-150mg/kgi.p.
4．Tetrakis-248mg/kgi.p.(150mg/kg环磷酰胺的摩尔当量)给药后五天，从后眼窝窦房结中取血样的确定各种血细胞计数。结果环磷酰胺(150mg/kg)给药后五天，所测的所有血液指标都有显著的下降。相反，Tetrakis给药后五天Balb/c鼠的白血球和骨髓细胞计数都在正常值范围内。实际上Tetrakis没有减少中性白细胞计数，而这个计数通过较低的环磷酰胺(30mg/kg)的剂量则可使之显著降低。中性白细胞计数或许是对环磷酰胺的活性代谢产物引起的造血损害极为敏感的指数。这样，与环磷酰胺比较，Tetrakis对于造血细胞是相对无毒性的。
表11环磷酰胺与Tetrakis比较对血细胞计数的影响中性白细胞 淋巴细胞 血小板组(K/_l) (K/_l) (K/_l)对照 0.82+.32 4.26+0.68 765+41CYP 30mg/kg 0.41+.23*3.96+0.66ns 776+37nsCYP 150mg/kg 0.07+0.6*2.53+0.26*867+109nsTetrakis 248mg/kg0.775+.28ns 3.45+0.88ns 1000+177ns*表示比对照值显著下降，P＜.05ns表示与对照(未处理)组没有差别实施例41通过化学变体抑制对治疗的非人体抗体的免疫应答非人体抗体的治疗效果由对病人有潜在危害的免疫应答所限制。可能出现严重的并发症，包括血清病，过敏反应性症状以及毒性免疫复体在肝脏沉积(Abuchowski,A.,“Effect of Covalently Attachedpolyethylene Glycol on the Immunogenicity and Activity of Enzymes”,Rutgers University,New Jersey,1975；Sehon,A.H.,“Suppression ofAntibody Responses by Chemically Modified Antigents”,Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.94(1991):11-20)。排除致免疫性的两种方法是使用人体抗体和使用原生的“人体化的”动物抗体，在该劝物抗体中例如从鼠科的抗体，CDRs已被移植到人体抗体组织中。换句话说，可以用化学方法得到具有掩盖外来蛋白质的非致免疫分子、非变应原分子和非抗原性分子的抗体，因而这种抗体可以抑制宿主免疫应答(Abuchowski,A.,“Effect of Covalently Attached polyethylene Glycol onthe Immunogenicity and Activity of Enzymes”,Rutgers University,NewJersey,1975；Sehon,A.H.,“Suppression of Antibody Responses byChemically Modified Antigents”,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.94(1991)11-20)。宿主免疫应答可以通过外来蛋白质与例如D-谷氨酸和D-赖氨酸(D-GL)的共聚物、聚乙二醇(PEG)、-甲氧基聚乙二醇(mpEG)或聚乙烯醇(PVA)结合而显著减少(Sehon,A.H.,“Suppression of the IgEAntibody Responses with Tolerogenic Conjugates of Allergens andHaptens”,In progress In Allergy,Vol.32(1982):161-202)。在每种情况下，象抗体(Ab)这样的蛋白质是用多分子(n)结合物来改性的；(即Ab(pEG)n)。抑制免疫应答取决于n的最佳值，如果n太小或太大，则效果不明显(Jackson,C.and J.C.,Charlton,J.L.,Kuzminski,K.,Lang,G.M.,Sehon,A.H.,“synthesis,Isolation,and Characterization of Conjugatesof Ovalbumin with Monomethoxypolyethylene Glycol Using CyanuricChloride as the Coupling Agent”,Anal.Biochem.165(1987):114-127)。通过制备具有不同n值的抗体并确定在宿主动物中每种变化抗体的致免疫性，由熟悉本技术人员不需过多的经验就可以确定n的最佳值。
催化抗体或催化/肿瘤结合的双特异性抗体与非抗原分子的结合可以如下进行(Jackson,C.and J.C.,Charlton,J.L.,Kuzminski,K.,Lang,G.M.,Sehon,A.H.,“synthesis,Isolation,and Characterization ofConjugates of Ovalbumin with Monomethoxypolyethylene Glycol UsingCyanuric Chloride as the Coupling Agent”,Anal.Biochem.165(1987):114-127)。由熟悉本技术的人员试验确定n的最佳值(参看上文)，要达到这种结合程度可采取不同的方法。最好抗体是同mPEG结合，不过其它结合物也可以提供所需的效果。mPEG优于PEG，因为PEG有两个可能分享不希望的结合物的分子内或分子间交联的端羟基(Sehon,A.H.,“Suppression of Antobody Responese by ChemicallyModified Antigens”,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.94(1991):11-20)。不需太多的经验就可能选择mPEG的类型，例如，pMEG6(平均分子量=6000)或mPEG20(平均分子量=20000)。此外，方法的规模也可以相应地变化，其取决于可得到或需要多少结合的抗体。mPEG结合抗体的制备包括两个主要步骤1．制备活性中间体，2-O-mPEG-4,6-二氯-S-三嗪(“mPEG中间体”)。
2．mPEG中间体与抗体以合适比例反应，生成具有所需的n值的结合物。
因为氰尿酰氯和mPEG中间体很容易水解，所以所有试剂必须完全无水并应避免受空气中的水分的影响。mPEG(20g)在80℃溶于无水苯(320ml)中。可与mPEG结合的任何水分通过苯蒸馏除去，至约160ml。在氮气氛下加入过量氰尿酰氯(6.64g，从无水苯中重结晶的)，接着加入碳酸钾(4.0g，无水粉末)，混合物在室温下搅拌15小时。然后，混合物用烧结玻璃滤器过滤(在氮气保护下)。滤液与无水石油醚(200ml)混合，沉淀出mPEG中间体，它是在氮气保护下通过烧结玻璃滤器过滤而从反应物中分离的。沉淀物溶于150ml苯中，再用石油醚沉淀。该操作重复7次，除去所有残余的氰尿酰氯。然后，将mPEG中间体溶于苯中，在-78℃冻结。在高真空下使苯升华，留下白色粉末(mPEG中间体)。mPEG中间体可贮藏在-60℃氮气保护下的密封的管形瓶中(每瓶1g或更少)。
为了得到具有不同n值的抗体-mPEG结合物(Ab(mPEG))，将不同量的mPEG中间体加入溶于四硼酸钠(4lml,0.1M,pH9.2)中的40mg Ab中。混合物在4℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌30分钟。
结合作用后，使混合物通过SephadeX G-25柱(2.5×40cm)该柱用25mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)平衡。最后，结合物用DEAE-Trisacryl柱(5×40cm)纯化，该柱用25mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)预平衡。在起始缓冲液中蛋白质被结合在柱上，接着在相同的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中洗涤。蛋白质用最终成为50mM NaCl,25mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)的；盐溶液线性梯度洗脱。实施例42把肿瘤抗原作为靶子并在肿瘤处使前体药活化成活性抗癌药的双特异性抗体的制备和应用前体药5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基-5-氟尿苷，即实施例1a中的化合物1c，按实施例1a中描述的方法制备，并用小鼠进行毒性试验。通过对分段中性白细胞数的作用测定的前体药的体内毒性比5-氟尿苷药的毒性小50多倍。过渡态类似物二甲氧基苯甲酰基尿苷的膦酸酯，即化合物155，按实施例44中描述的方法制备。在膦酸酯类似物结合到载体蛋白，钥孔血兰蛋白上之后，通过传统的方法用结合物使小鼠免疫，并产生单克隆抗体。另外，具有高滴度抗血清的小鼠脾脏被用作多腺苷酰化的RNA的来源。在PCR放大方法中用补偿小鼠免疫球蛋白族系的寡核苷酸引物起动RNA。按专利申请WO92101047(在此引入作为参考)中描述的方法将PCR产物克隆进入fd噬菌体载体。用该文献中描述的方法筛选得到的噬菌体库和用传统方法制备的单克隆抗体以便结合在过渡态类似物上。按上述文献中题目为“筛选酯酶催化活性抗体”的部分中描述的方法筛选用于催化作用的具有催化潜力的选择物抗体。
双特异性单链抗体用下述方法制备。在这种情况下，对所研究的癌具有特异性的单克隆抗体B72.3或现有技术中已知的其他肿瘤特异性抗体用已描述的方法克隆。抗体被克隆成单链形式，其特征是用现有技术中已知的载体表达。然后，该单链抗体基因与按上述方法分离的催化抗体的单链基因结合。这两个单链基因的结合是以对于单链结合已描述过的连接体形式或抗体区域的结合所涉及的已知的其他顺序，特别是为(ser-lys-ser-thr-ser)3编码的基因，或者铰链区。然后，将这些结合的基因放入表达载体内；在这种情况下，载体是由InVitrogen Inc.得到的PRC/CMS，或现有技术中已知的其他相似的表达载体。该双特异性单链基因被引入表达载体中后，将结合的载体引入表达载体的宿主中，在载体是pRC/CMS的情况下，哺乳动物细胞为宿主。令人欣慰的是现有技术中存在许多宿主载体体系，它们具有某些已知的优点。作为这些体系的例子，大肠杆菌、酵母和昆虫细胞在上述体系的领域中是广为人知的。
表达的双特异性单链的回收是通过现有技术中已知的蛋白提纯方法进行。回收的蛋白的特征在于它决定了催化活性及与催化活性结合的结合性的特异性活性，从而决定了治疗动物和人的肿瘤的物质的纯度。如对提纯的双特异性单链(二价)抗体所做的那样，将用传统的单克隆方法得到的抗体和用噬菌体库方法得到的抗体结合，并裂解化合物1c。
按上述文献中题目为“制剂和给药”部分中描述的方法，将二价抗体和前体药配制成制剂并给药。实施例43实施例38中前体药141的半抗原，5′-O-(2,4,6-三甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷的线性膦酸酯，即化合物152的制备该实施例中黑体数字的化合物参考图49。
1,3,5-三甲氧基苯用正丁基锂锂化，然后与N,N-二异丙基甲基氯代膦酰胺反应，得到化合物150。接着在四唑存在下与3f缩合，并就地用mCPBA氧化，得到化合物151。用苯硫酚、催化加氢和氢氧化铵除去所有保护基，得到前体药的半抗原152。
合成方法详细说明如下化合物150将正丁基锂(2-5M己烷溶液，1mmol)加入1,3,5-三甲氧基苯(1mmol)的2ml THF溶液中，同时保持混合物的温度低于0℃。加完后混合物在0℃搅拌2小时。然后冷却到-78℃，随后加入N,N-二异丙基甲基氯代膦酰胺(1mmol)。加完后混合物-78℃再搅拌2小时。加入三乙胺(5ml)的EtOAc(45ml)溶液，将混合物倾入饷的碳酸氢钠(75ml)溶液中。有机相进一步用饱和碳酸氢钠(75ml)和盐水(50ml)处理，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，再溶于三乙胺(0.3ml)的己烷(2.7ml)溶液中，通过快速色谱提纯，用10％三乙的己烷溶液洗脱，得到产物(化合物150)，为无色固体。
化合物151将化合物150(1mmol)溶于3ml CH2Cl2中，加入化合物3f(0.20mmol)接着加入四唑(2.5mmol)。1小时后加入mCPBA(1.25mmol)，混合物搅拌15分钟，倾入饱和的NH4Cl溶液(30ml)中，用EtOAc(2×50ml)萃取。有机相用无水MgSO4干燥，真空浓缩。混合物用快速色谱提纯，得到产物，化合物151。
化合物152将化合物151(1mmol)溶于1ml二噁烷中，加入苯硫酚(10mmol)和三乙胺(10mmol)的二噁烷(5ml)溶液。混合物搅拌16小时。然后真空浓缩，再溶于2ml CH2Cl2中，并在搅拌下将其滴加到300ml石油醚中。倾析后收集沉淀物，再溶于2ml CH2Cl2中，在搅拌下将其再滴加到另一300ml石油醚中。倾析后再收集沉淀物，再溶于20ml EtOAc中，加入5％Pd-C(10％(重量))，混合物在室温和氢气氛下搅拌直至完成氢气的吸收。用硅藻土填料过滤除去催化剂，用甲醇洗涤。收集滤液，真空浓缩，该加氢化合物(1mmol)和氢氧化铵(10ml)的甲醇(10ml)溶液在密封管中加热过夜。反应完成后真空除去溶剂，产物用反相HPLC提纯，得到化合物152。
实施例44实施例1a中前体药1c的半抗原，5′-O-(2,6-二甲氧基苯甲酰基)-5-氟尿苷的线性膦酸酯，即化合物155的制备该实施例中的黑体数字化合物参考图50。
1,5-二甲氧基苯用正丁基锂锂化，然后与N,N-二异丙基甲基氯代膦酰胺反应，得到化合物153。接着在四唑存在下与3f缩合，并就地用cCPBA氧化，得到化合物154。用苯硫酚、催化加氢和氢氧化铵除去所有保护基，得到前体药的半抗原155。
合成方法详细说明如下
化合物153将正丁基锂(2-5M的己烷溶液，1mmol)加入1,5-二甲氧基苯(1mmol)的2ml THF溶液中，同时保持混合物温度低于0℃。加完后混合物在0℃搅拌2小时。然后冷却到-78℃，随后加入N,N-二异丙基甲基氯代膦酰胺(1mmol)。加完后混合物在-78℃再搅拌2小时。加入三乙胺(5ml)EtOAc(45ml)溶液，将混合物倾入饱和和碳酸氢钠溶液(75ml)中。有机相进一步用饱和碳酸氢钠(75ml)和盐水(50ml)处理，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，再溶于三乙胺(0.3ml)的己烷(2.7ml)溶液中，通过快速色谱提纯，用10％三乙胺的己烷溶液洗脱，得到产物(化合物153)，为无色固体。
化合物154将化合物153(mmol)溶于3ml CH2Cl2中，加入化合物3f(0.20mmol)接着加入四唑(2.5mmol)。1小时后加入mCPBA(1.25mmol)，混合物搅拌15分钟，倾入饱和的NH4Cl溶液(30ml)中，并用EtOAc(2×50ml)萃取。有机相用无水MgSO4干燥，真空浓缩。混合物用快速色谱提纯，得到产物，化合物154。
化合物155将化合物154(1mmol)溶于1ml二噁烷中，加入苯硫(10mmol)酚和三乙胺(10mmol)的二噁烷(5ml)溶液。混合物搅拌16小时，然后真空浓缩，再溶于2ml CH2Cl2加，在搅拌下将其滴加到300ml石油醚中。倾析后收集沉淀物，再溶于2ml CH2Cl2中，在搅拌下将其再滴加到另一300ml石油醚中。倾析后再收集沉淀物，再溶于20ml EtOAc中，加入5％Pd-c(10％(重量))，混合物在室温和氢气氛下搅拌直至完成氢气的吸收。用硅藻土填料过滤除去催化剂，用甲醇洗涤。收集滤液，真空浓缩，该加氢化合物(1mmol)和氢氧化铵(10ml)的甲醇(10ml)溶液在密封管中加热过夜。反应完成后真空除去溶剂，产物用反相HPLC提纯，得到化合物155。
上述内容用来说明本发明但并不限制本发明。在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种变化和改进。
权利要求
1．一种制备具有下式的取代的芳族酯化合物的方法
式中X是药物XOH的残基，R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并且各自是H、具有1-10个碳原子的烷基、具有1-10个碳原子的烷氧基、单环芳基、具有1-10个碳原子的烯烃、羟基、羟烷基、氨基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、烷基膦酸酯、烷基磺酸酯、烷基羧酸酯或烷基铵，条件是R1至R5中至少一个不是H，并且其中所述化合物不是Ara-C-2,4,6-三甲基苯甲酸酯、Ara-C-3,4,5-三甲基苯甲酸酯或Ara-C-2,6-二甲基苯甲酸酯；其特征在于使下式化合物或其反应性衍生物与药前XOH反应，
其中X、R1、R2、R3、R4和R5的定义同上。
2．根据权利要求1的方法，其中XOH是细胞毒性药物。
3．根据权利要求1的方法，其中XOH是抗肿瘤核苷类似物、阿霉素或烯醇式醛膦酰胺。
4．根据权利要求1的方法，其中R1或R5不是H。
全文摘要
本发明公开的和要求保护的前体药通过催化蛋白例如酶和催化抗体活化。本发明包括这些前体药以及诱出活化前体药的催化抗体的半抗原。前体药用作细胞毒性化学治疗剂,如抗肿瘤剂。
文档编号C07D233/88GK1217335SQ96123479
公开日1999年5月26日 申请日期1996年12月30日 优先权日1991年8月5日
发明者J·H·肯顿, R·冯波斯特尔, J·M·卡萨戴, B·卡米雷迪, M·T·马丁, R·J·马西, A·D·纳帕, D·M·辛普森, R·G·史密夫, R·C·蒂特马斯, R·O·威廉斯 申请人:伊根国际有限公司