专利名称：一种分子印迹聚合物的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药活性成分的制备领域，特别涉及一种制备分子印迹聚合物的方法，及其该聚合物在精制丹参酮IIA中的应用。
背景技术：
丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，是治疗心脑血管疾病的传统中药。丹参的化学成分主要分为脂溶性成分及水溶性成分两大类，脂溶性成分主要为二萜类化合物，如丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I等。丹参酮类化合物为脂溶性主要成分，在生物体内的代谢产物表现出多种药理作用，对心脑血管疾病、肝炎、白血病等具有潜在的治疗作用。有关丹参酮的精制工艺文献报道很多，主要有乙醇回流或者渗漉法和超临界CO2 萃取法等。以上方法从提取原理上，都是利用相似相溶的原理，反复进行溶解、结晶、沉淀等步骤最终达到纯化的效果。由于以上方法选择性不强，而丹参中丹参酮等一类脂溶性的成分都具有相似的物化性质，结构类似物的杂质偏高，丹参酮IIA的含量相对来说偏低。加之需经过多步操作，耗时耗力，因此不是足够理想的方法。分子印迹技术是一种新型的技术，应用此技术可以有针对性地采用不同模板合成针对不同化合物的分子印迹聚合物。由于在合成过程中加入模板分子，和功能单体形成相互作用的复合物，然后再加入交联剂在引发剂的作用下引发聚合反应，形成高分子的聚合物，之后通过研磨，洗脱等工序除去模板分子，得到具有模板分子三维空穴的聚合物，这种聚合物因此对模板分子具有特异性的识别能力。因其制备简单，性质稳定，耐高温，耐酸碱， 耐有机溶剂等优点使其在色谱分离以及固相萃取等领域均有广泛应用。近年来，已经开始用于中药活性成分的分离。分子印迹技术在丹参分离上的应用，有报道的是乐康等人利用丹参酮IIA为模板，甲基丙烯酸为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，比例为1 4 M热聚合合成了分子印迹聚合物(华西药学杂志，2009，M (5) :443 445)。但是该实验中所述的吸附等温线测定所使用的模板分子的溶液浓度明显过大，我们经测试实验无法重复，故对其结果的可信性表示审慎的怀疑。另有中国发明专利申请201010167614.0提出一种芯-壳结构复合纳米表面分子印迹聚合物的制备方法，该方法制备过程复杂，成本高，不利于大规模制备和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子印迹聚合物的精制方法，以丹参酮IIA为模板，制备方法主要包括下列步骤(1)将丹参酮IIA、一种或几种功能单体、交联剂、引发剂、致孔剂按一定配比混合制成均相体系，在氮气保护下，于聚合4- 小时。(2)将步骤(1)制备的材料磨成粉末，过筛后先用醇类溶剂浸泡、清洗，然后用醇与有机酸的混合溶液进行洗脱，直至紫外检查洗脱液中不含丹参酮IIA分子，得到所述目标分子印迹聚合物。其中，所述单体有多种选择，包括丙烯酸类(例如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、 丙烯酸或丙烯酸酯类)、吡啶类、酰胺类和其他类单体等。优选的是酰胺类和吡啶类，更优选的是丙烯酰胺(AM)、2-乙烯基吡啶Q-VP)和甲基丙烯酸(MAA)。常用的交联剂，包括三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、二乙烯基苯(DVB)、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸等；优选的是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)。本发明中所述的致孔剂可采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、乙醇或甲醇；优选的是二氯甲烷和乙腈。本发明中所用的引发剂一般为有机过氧化物或偶氮化合物；优选为偶氮二异丁腈 (AIBN)。步骤(1)中功能单体与丹参酮IIA的物质的量比为3-8 1 ；交联剂与参酮IIA 的物质的量比为12-30 1;交联剂与功能单体的物质的量比为2-5 1;致孔剂用量为 6-15mL/mmol丹参酮IIA ；引发剂用量为60-200mg/mmol丹参酮IIA。本发明步骤(1)采用热引发聚合，反应方式将反应物用超声混合均勻后，加入到容器中，通入3-5分钟的氮气后密闭聚合。反应条件为于55-75°C聚合4- 小时。聚合反应完成后，所得到的聚合物中含有模板分子，需要经过清洗除去模板分子才可以使用。步骤( 中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇溶剂；所述有机酸为乙酸或甲酸；所述醇与有机酸的混合溶液中醇与有机酸的体积比为20-5 1 ；所述洗脱方法为索式提取或者浸泡抽滤。本发明的另一个目的是提供上述方法获得的分子印迹聚合物在精制丹参酮IIA 中的应用。本发明提供的分子印迹聚合物可以作为固相萃取材料来分离纯化丹参乙醇粗提物中的丹参酮IIA。该方法通过以下步骤实现将所述的分子印迹聚合物装柱，然后将样品溶液过柱，用醇类溶剂清洗去杂质后洗脱、收集精制的丹参酮IIA。本发明所述样品溶液为丹参药材提取液或丹参粗提物的溶液或含有丹参酮IIA的其他溶液。其中，去杂质所用洗脱剂为体积比为10-0. 5 1的乙醇或甲醇与水的混合溶液； 洗脱、收集丹参酮IIA所用洗脱剂为体积比为100-50 5-50 1的乙醇或甲醇与水、乙酸的混合溶液。本发明以丹参酮IIA为模板分子，制备的分子印迹聚合物在含水流动相中对丹参酮IIA表现出了很好的亲和性和选择性，使其作为一种使其作为一种特异性的分离材料在对中药中丹参酮IIA的分离、富集和提纯方面有着广阔的应用前景。本发明采用分子印迹技术，制备出一种新型的对丹参酮IIA具有特异选择性的分离介质，从而达到选择性分离的效果。本发明虽然使用的也是热聚合的引发方式，但是本发明合成时只需一步混合，较此文献报道的方法在制备过程上明显简化，大大的节省了所需时间，并且所用单体也不相同， 对聚合物的应用本发明尝试了多种条件，确定采用了水相洗脱系统，使其实际应用范围明显扩大，效果也明显优于以上文献报道的结果。
附图1是实施实例8的上样液的HPLC谱图。附图2是实施实例8的萃取之后的萃余液的HPLC谱图。附图3是实施实例8的60%除杂的除杂液的HPLC谱图。附图4是实施实例8的95%除杂的除杂液的HPLC谱图。附图5是实施实例8的洗脱液的HPLC谱图。附图6是实施实例8的模板分子对照品的HPLC谱图。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、2. 5mmol功能单体甲基丙烯酸(MAA) UOmmol 交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.05g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、5mL致孔剂氯仿，置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气IOmin后密封；置 60°C恒温水浴箱中聚合Mh，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用2X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用5X IOOmLl甲醇乙酸(V V = 9 1)的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用4X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮IIA分子印迹聚合物，MIPl。实施例2称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、2. 5mmol功能单体2-乙烯基吡啶Q-VP)、 IOmmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0. 05g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、 5mL致孔剂二氯甲烷，置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气 IOmin后密封；置65°C恒温水浴箱中聚合他，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用2 X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用6 X IOOmL甲醇乙酸(V V =9 1)的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5X100mL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮 IIA分子印迹聚合物，MIP2。实施例3称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、2. 5mmol功能单体丙烯酰胺(AM)、IOmmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0. 05g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、5mL致孔剂乙腈，置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气IOmin后密封；置 60°C恒温水浴箱中聚合12h，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用2X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用6X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5) 的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5X100mL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮IIA分子印迹聚合物，MIP3。实施例4称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、4mmol功能单体甲基丙烯酸(MAA)、20mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、6mL致孔剂氯仿， 置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气IOmin后密封；置55°C 恒温水浴箱中聚合Mh，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用3 X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用7 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5)的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5X100mL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外 270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮IIA分子印迹聚合物，MIP4。实施例5称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、4mmol功能单体2_乙烯基吡啶O-VP)、20mmol 交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、6mL致孔剂氯仿，置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气IOmin后密封；置 55°C恒温水浴箱中聚合Mh，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用3X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用7 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5) 的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5X100mL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮IIA分子印迹聚合物，MIP5。实施例6称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、3mmol功能单体2_乙烯基吡啶O-VP)、15mmol 交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0.08g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、5mL致孔剂二氯甲烷，置于50mL磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。冰浴中通氮气IOmin 后密封；置55°C恒温水浴箱中聚合Mh，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用4X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用SXlOOmL甲醇乙酸(V V = 8.5 1. 的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5 X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮 IIA分子印迹聚合物，MIP6。实施例7使用一种以上混合功能单体合成MIP称取0. 5mmol模板分子丹参酮IIA、2mmol功能单体2-乙烯基吡啶Q-VP)和2mmol 功能单体甲基丙烯酸(MAA)、20mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0. 06g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)、6mL致孔剂氯仿，置于50ml磨口圆底烧瓶中，超声IOmin至混合均勻。 冰浴中通氮气IOmin后密封；置55°C恒温水浴箱中聚合Mh，得到红色棒状聚合物。将聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，过筛。先用3 X IOOmL甲醇超声洗涤，抽滤，再用8 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8.5 1.5)的混合溶液超声清洗，离心，弃去上层洗涤液，再用5 X IOOml 甲醇超声洗涤，抽滤，反复洗至紫外270nm下无模板分子检出为止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹参酮IIA分子印迹聚合物，MIP7。实施例8以上分子印迹聚合物(MIP)对目标分子的吸附性能考察将0.03g本发明分子印迹聚合物以及其空白对照聚合物浸泡在5mL浓度为 0. 5mmol/L的丹参酮IIA甲醇溶液中，室温下振荡12h，使其达到吸附平衡。HPLC检测吸附后溶液中的丹参酮IIA的浓度，计算吸附量。结果列于表1。结果表明，本发明分子印迹聚合物对于目标分子具有较大的吸附量。而空白聚合物(即除了不加入模板分子，其余条件相同合成的聚合物)则吸附量较小。由此可见，此分子印迹聚合物对模板分子具有高选择性。表1.实施实例1-6中不同分子印迹聚合物(MIP)对目标分子的吸附性能考察结果
权利要求
1.一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于，通过以下步骤实现(1)将丹参酮IIA、一种或几种功能单体、交联剂、引发剂、致孔剂混合制成均相体系， 在氮气保护下，于55-75°C聚合4-M小时，所述功能单体与丹参酮IIA的物质的量比为 3-8 1;所述交联剂与丹参酮IIA的物质的量比为12-30 1 ；交联剂与功能单体的物质的量比为2-5 1 ；致孔剂用量为6-15mL/mmol丹参酮IIA ；引发剂用量为60-200mg/mmol 丹参酮IIA。(2)将步骤(1)制备的材料磨成粉末，过筛，先用醇类溶剂浸泡、清洗，然后用醇与有机酸的混合溶液进行洗脱，直至紫外检查洗脱液中不含丹参酮IIA，得到分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤⑴所述功能单体为甲基丙烯酸、2-乙烯基吡唆、甲基丙烯酸二乙胺乙基酯、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶。
3.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤(1)所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸。
4.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤(1)所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、乙醇或甲醇。
5.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤(1)所述引发剂为有机过氧化物或偶氮化合物。
6.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤(1)采用热引发聚合，将反应物用超声混合均勻后，加入到容器中，通入3-5分钟的氮气后密闭聚合，反应条件为于55-75°C聚合4- 小时。
7.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA的分子印迹聚合物的精制方法，其特征在于 步骤( 所述醇类溶剂为甲醇或乙醇溶剂；所述有机酸为乙酸或甲酸；所述醇与有机酸的混合溶液中醇与有机酸的体积比为20-8 1 ；所述洗脱方法为索式提取或者浸泡抽滤。
8.根据权利要求1所述方法获得的分子印迹聚合物在精制丹参酮IIA中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现将所述的分子印迹聚合物装柱，然后将样品溶液过柱，去杂质后洗脱、收集精制的丹参酮IIA。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于去除杂质所用洗脱剂的体积比为10-0.5 1的乙醇或甲醇与水的混合溶液；洗脱、收集所用洗脱剂为体积比为 100-50 5-50 1的乙醇或甲醇与水、乙酸的混合溶液。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述样品溶液为丹参药材提取液或丹参粗提物的溶液或含有丹参酮IIA的其他溶液。
全文摘要
本发明提供一种分子印迹聚合物的精制方法，以丹参酮IIA为模板，与功能单体、交联剂、引发剂、致孔剂混合制成均相体系，在氮气保护下聚合，然后将制备的材料磨成粉末过筛，用醇类溶剂浸泡、清洗、洗脱，获得。本发明制备的分子印迹聚合物在含水流动相中对丹参酮IIA表现出很好的亲和性和选择性，使其作为一种使其作为一种特异性的分离材料在对中药中丹参酮IIA的分离、富集和提纯方面有着广阔的应用前景。本发明合成时只需一步混合，制备过程明显简化，节省时间，采用水相洗脱系统，使应用范围扩大，洗脱效果明显。本发明提供的分子印迹聚合物可以作为固相萃取材料来分离纯化丹参乙醇粗提物中的丹参酮IIA。
文档编号C08F226/06GK102167777SQ20101061325
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者周长新, 王真真, 甘礼社 申请人:浙江大学