专利名称：一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物及其制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种专一结合糖蛋白的分子印迹聚合物及其制法和在检测抗原糖蛋白中的应用。
背景技术：
糖蛋白是一类重要的蛋白质。在哺乳动物中，总蛋白的一半以上为糖蛋白。糖蛋白在生理过程中具有重要作用，如分子识别、细胞内/间信号、免疫应答、受精作用和发育调控等等。糖蛋白在重大疾病的早期诊断上具有重要意义，在美国食品和药物管理局 (FDA)批准的疾病标志物中绝大部分是糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)等。此外，促红细胞生成素(EPO)和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)等糖蛋白是体育运动中禁止使用的物质，这些兴奋剂的快速灵敏检测是具有挑战性的任务(参见F. Lasne，J. de Geaurriz，Nature 2000,405,635 ；何坚刚，刘震，刘晶，窦鹏，陈洪渊，色谱 2008，28，402-407)。抗体是分子生物学研究、蛋白质研究和疾病诊断等领域中不可缺少的核心分子工具。但是，抗体的使用存在几个不利因素。首先，抗体的制备困难，价格昂贵。其次，抗体的稳定性差。再者，一些抗体的特异性比较差。因此，研发选择性专一、价格低廉和稳定性好的替代者不仅具有重要的科学意义，而且具有可观的市场前景。分子印迹聚合物(MIP)(参见 G. ffulff, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995，34，1812—1832 ；G. Vlatakis, L. I. Andersson, P. Muller, K. Mosbach, Nature 1993，361，645-647)是重要的抗体的仿生材料。分子印迹技术的基本原理是首先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，然后加入交联剂形成聚合物从而将配合物固定并包裹在聚合物内部，最后采用一定的方法将模板分子提取出来，从而在聚合物中留下选择性的结合位点以及和模板分子形状相互补的空腔。分子印迹技术具有以下优点一、预定性，可以根据使用目的的不同而制备不同的分子印迹聚合物；二、专一性，能专一地识别模板分子，与模板分子间形成类似于抗体与抗原间的相互作用(分子印迹聚合物因此被称为“塑料抗体”或“人工抗体”)；三、 实用性，分子印迹聚合物可以通过化学合成大规模制备，价格低廉，而且适用于各种反应条件、稳定性高、使用寿命长。因为这些优点，分子印迹聚合物在对光学异构体拆分、固相萃取、化学仿生传感、模拟酶催化和药物分析技术等领域已展现了良好的应用前景(参见 L. X. Chen, S. F. Xu, J. H. Li, Chem. Soc. Rev. 2011，40，2922—2942)。生物大分子(尤其是蛋白质)的印迹有相当的挑战性，主要存在两个方面的困难第一，生物大分子在通常的聚合条件下容易发生构型变化甚至变性；其次，生物大分子在聚合物网络内的传质慢，模板分子的除去困难(参见Y.Hoshino，K. J. Shea, J. Mater. Chem. 2011，21，3517-3521 ；N. W. Turner, C. W. Jeans, K. R. Brain, C. J. Allender, V. Hlady, D. W. Britt, Biotechnol. Prog. 2006，22，1474-1489)。为了解决以上困难，已经有几种方法用于生物大分子的印迹，包括表面印迹(参见M. Kempe，M. Glad，K. Mosbach, J. Mol.Recognit. 1995，8，35-39)、抗原决定基印迹(参见 N. Nishino, C. S. Huang, K. J. Shea, Angew. Chem. Int. Ed. 2006，45，2392-2396)、金属配合法(参见 L. Qin, X. -ff. He, W. Zhang, W. -Y. Li, Y. -K. Zhang, Anal. Chem. 2009，81，7206-7216)和纳米技术(参见 D. Cai，L. Ren, H. Ζ. Zhao, et al. Nat. Nanotech. 2010，5，597-601)等等。相对于非糖蛋白，糖蛋白的分子印迹文献报道较少。Hjerten等采用物理包埋法，制备了能印迹包括糖蛋白转铁蛋白在内的多种蛋白质的低交联度凝胶(参见J.-L. Liao，Y. Wang, S. Hjerten，Chromatographia 1996,42, 259-262 ；S. Hjerten, J. L. Liao, K. Nakazato, Y. Wang, G. Zamaratskaia, H. -X. Zhang, Chromatographia 1997,44,227-234 ;D.Tong, Cs. Hetenyi, Zs.Bikadi, J.-P. Gao, S. Hjerten, Chromatographia 2001，54，7-14)。尽管包埋法印迹技术比较简单，而且可能是一种普遍适用的方法，但却存在着不少弊端，如印迹分子利用率低，印迹分子不易洗脱， 介质内部扩散阻力大，介质形态不规则等。采用表面印迹法，Mosbach等在多孔硅胶颗粒表面上的聚硅氧烷共聚物上印迹了糖蛋白转铁蛋白，但是该印迹聚合物对转铁蛋白的特异 生微弱(参见 Μ. Glad, 0. Norrlow, B. Sellergren, N. Siegbahn, K. Mosbach，J. Chromatogr. A 1985，347，11-23)。Ratner等发展了一类新的表面印迹技术蛋白质首先吸附到云母上，然后将一薄层的二糖分子包被在吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合，接着在糖分子表面聚合上一层光滑的荧光聚合物薄层，最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质， 即生成了具有蛋白质形状空穴的聚二糖表面印迹聚合物(参见H. Q. Shi, B. D. Ratner, J. Biomed. Mater. Res. ,2000,49,1-11 ；H. Q. Shi, W. -B. Tsai, S. Ferrari, B. D. Ratner, Nature 1999，398，593-597)。采用该技术，包括糖蛋白、免疫球蛋白在内的多种蛋白质得到成功的印迹。这种表面印迹技术在制备生物诊断芯片方面具有很好的应用前景。以蛋白质作模板，通过间氨基苯硼酸在聚苯乙烯材料表面的氧化聚合，Bossi等成功制备了包括糖蛋白辣根过氧化氢酶的多种蛋白质的分子印迹膜(参见A.Bossi，S. A. Piletsky, Ε. V. Piletska, P. G. Righetti, Α. P. F. Turner, Anal. Chem. 2001，73，5281—5286)，由于这种分子印迹聚合物稳定性高、专一性好，预期在生物技术、生物分析与传感等方面有广泛的应用。Ramanavicius等在钼黑电极表面通过电聚合法制备了印迹了牛白血病病毒糖蛋白 gp51的聚吡咯，但该方法重现性较差(参见A. Ramanaviciene, A. Ramanavicius, Biosens. Bioelectron. 2004，20，1076-1082)。Miyata 等报道了对糖蛋白甲胎蛋白(AFP)具有专一性识别和收缩效应的分子印迹凝胶，该方法以修饰了双键的伴刀豆球蛋白A(Con Α)和抗甲胎蛋白抗体(anti-AFP)为功能单体，通过形成Con A-AFP-anti-AFP复合物使得印迹凝胶在AFP存在时收缩，从而对AFP的存在进行响应(参见T. Miyata, M. Jige, T. Nakaminami, T. Uragami,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2006，103，1190-1193)。但是，目前的这些方法还存在着制备方法步骤多、周期长和抗干扰能力差等缺点，更为重要的是，还没有一种普遍适用的方法可用于糖蛋白的分子印迹。
发明内容
本发明克服现有分子印迹技术的不足，发明出一种快速便捷、可规模化生产、普适性的制备指定糖蛋白的人工抗体的分子印迹技术。本发明技术方案如下一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，它是以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，在碱性条件下，将指定的糖蛋白为模板(印迹分子)与含双键的取代苯硼酸(功能单体)形成复合物，和含双烯键的交联剂、紫外固化系统的光引发剂及致孔剂混合，通过紫外光照射引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的共聚反应形成聚合物，然后用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子(指定的糖蛋白)，得到含有与糖蛋白糖基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，所述的指定糖蛋白可以是辣根过氧化物酶、核糖核酸酶B、甲胎蛋白或抗甲胎蛋白抗体。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，所述的取代苯硼酸可以是对乙烯基苯硼酸、间乙烯基苯硼酸或间丙烯酰胺基苯硼酸。 上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，所述的交联剂可以是聚乙二醇双丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉双丙烯酰胺。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，所述的紫外固化系统的光引发剂可以是安息香二甲醚、偶氮二异丁腈、1-羟基环己基苯基酮(Irgacure 184)或安息香乙醚。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，所述的致孔剂可以是聚乙二醇。一种制备上述专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物的方法，它包括如下步骤步骤1.将指定糖蛋白的模板分子与功能单体含烯键的取代苯硼酸按 1 100-1 10000的质量比，在弱碱性条件下混合均勻，以形成共价复合物，加入光引发齐U，交联剂与致孔剂按ι 4-1 8的体积比加入，交联剂与功能单体含烯键的取代苯硼酸的质量比为1 100-1 1，混合均勻，得到的溶液成为预聚液，在表面修饰了双键的基片如玻璃片或滤纸上滴加预聚液，涂布均勻；步骤2.将带有特定图案的掩膜覆盖到上述基片上(如本发明的实施例的特定图案为多个圆点，图案也可以为其它形状)，在紫外光下曝光，透光部分因紫外光照射诱发而聚合，而被遮挡的部分则不聚合；步骤3.撤去掩膜，用溶剂(如乙腈/水溶液)清洗，除去未聚合部分，得到跟掩膜图案一致的分子印迹材料；步骤4.用酸性溶液荡洗步骤3得到的分子印迹材料，除去聚合物中的印迹分子， 则得到专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，也即为专一结合指定糖蛋白的人工抗体。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物的制备方法，所述的指定糖蛋白可以是辣根过氧化物酶、核糖核酸酶B、甲胎蛋白或抗甲胎蛋白抗体；所述的含烯键的取代苯硼酸可以是对乙烯基苯硼酸、间乙烯基苯硼酸或间丙烯酰胺基苯硼酸；所述的交联剂可以是聚乙二醇双丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉双丙烯酰胺；所述的紫外固化系统的光引发剂可以是安息香二甲醚、偶氮二异丁腈、1-羟基环己基苯基酮或安息香乙醚；所述的致孔剂可以是聚乙二醇。上述的制备过程采用了目前普遍流行的软光刻技术，制备过程简单便捷，不需要复杂设备，可规模化生产。聚合时间通常在1分钟内，模板分子的除去也相当容易，通常只需要用酸性溶液荡洗2小时。上述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物的制备技术是一个普适性方法，印迹特定糖蛋白时，只需要微调交联剂和致孔剂的比例。利用该印迹技术，已经成功制备了核糖核酸酶B (RNase B,分子量1. 5万，含1个糖基化位点，等电点8. 9)、辣根过氧化物酶 (HRP,分子量4. 4万，含9个糖基化位点，等电点3. 0-9. 0)、甲胎蛋白(AFP，分子量6. 7万， 含11个糖基化位点，等电点4. 7，5. 3)和抗甲胎蛋白抗体(anti-AFP，分子量15万，含2个糖基化位点，等电点7. 5-7. 9)。这些糖蛋白具有很好的代表性，分子量分布横跨1个数量级，分子上的糖基数目从1到11不等，等电点包含酸性到碱性范围。本发明是利用受pH调控的取代硼酸与糖基间可逆的共价相互作用，以含双键的取代硼酸作为功能单体，在碱性条件下将糖蛋白模板(印迹分子)与功能单体形成复合物， 加入交联剂、引发剂和致孔剂，通过紫外光照射引发功能单体与交联剂间以及交联剂与交联剂间的共聚反应，使用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有可与糖蛋白糖基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物(原理见图1)。该分子印迹聚合物在识别模板分子时，由于有空腔的协同作用，不再需要通常的、 没有印迹时所要求的碱性条件，在中性和弱酸性条件下即可与模板分子进行专一的相互作用；因此，在该条件下，通常的糖，如葡萄糖、果糖和甘露糖等，与取代硼酸作用力极弱，其对印迹材料对模板分子的识别作用的干扰得到有效的抑止。和其他以取代硼酸为配基的硼亲和功能材料(参见 L. B. Ren, Z. Liu, Y. C. Liu, P. Dou, H. -Y. Chen, Angew. Chem. Int. Ed. 2009,48, 6704-6707 ；L. B. Ren, Y. C. Liu, Μ. Μ. Dong, Ζ. Liu, J. Chromatogr. 2009,1216, 8421-8425 ；L. Liang, Ζ. Liu, Chem. Commun. 2011，47，2255—2257 ；Y. C. Liu, L. B. Ren, Z. Liu, Chem. Commun. 2011,47, 5067-5069 ；H. Y. Li, Y. C. Liu, J. Liu, Z. Liu, Chem. Commun. 2011,47, 8169-8171)相比较，该发明得到的分子印迹聚合物具有两个显著的优点。第一，采用通常的取代苯硼酸作为配基，在中性和弱酸性PH条件下即能与模板分子进行专一的相互作用，不需要调节PH，可以直接应用的样品范围宽。这对于生物医学研究和临床诊断等实际应用十分重要，因为常用的生理样品的PH为弱酸性到弱碱性，例如，血液的pH为7. 35-7. 4，眼泪的 pH为6. 5-7. 6。第二，该分子印迹材料具有极强的抗干扰能力，这对于复杂样品尤其是血液样品的分析非常有利。采用高灵敏显色反应、化学发光检测和质谱检测等手段，对印迹得到的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物抓取的抗原糖蛋白进行了检测，所得结果表明，由本发明制备得到的分子印迹聚合物具有非常优秀的专一性和抗干扰能力。此外，微观不均一性是糖蛋白的显著特征，即使只有一个糖基化位点的糖蛋白，由于糖基结构的不同，也存在不同的糖型。利用质谱作为检测工具，实验结果表明，由本发明制备得到的抗体材料能完整地保留印迹分子的微观不均一性，说明该人工抗体具有良好糖基差异识别能力。利用该性质，本发明可以用于制备识别糖基结构存在微小差异的糖蛋白。本发明的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物具有专一性高、抗干扰能力强、 重复性好、制备简单等优点，可直接于血清、尿液等复杂生物体系中检测待测抗原。该专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物可以和高灵敏的检测方法如化学发光等结合，可用于实际样品中糖蛋白的检测。
图1.本发明的糖蛋白分子印迹原理示意图。图2.以玻璃为基底的HRP的印迹聚合物和非印迹聚合物(预聚液中不含HRP)的照片(左)和电镜图(右)。MIP，分子印迹聚合物；NIP，非印迹聚合物。图3. HRP的印迹聚合物和非印迹聚合物在不同pH条件下对印迹分子的识别能力。 上，NIP (非印迹聚合物)；下，MIP (分子印迹聚合物)。NIP在pH = 6.0的时候没有显色， 在pH = 8. 5的时候才抓住HRP并显色。MIP在pH = 6. 0的时候就可以识别HRP并显色。图4. HRP印迹聚合物在复杂溶液中对HRP专一识别及裸眼检测。图中第3、4列显现蓝色，表明HRP印迹聚合物在复杂溶液中可以识别HRP并显色。图5.以BABEA处理后的滤纸为基底的HRP的印迹聚合物照片及裸眼检测。上，空白聚合物的照片，下，抓取HRP和的聚合物的照片。显色后图中I、II圈出现黄色，表明以滤纸为基底的HRP的印迹聚合物同样可以在弱酸性条件下识别HRP并显色。图6.核糖核酸酶B印迹聚合物对含核糖核酸酶B、核糖核酸酶A和肌红蛋白的溶液中专一抓取得到的目标物质的基体辅助激光解吸离子化-时间飞行质谱图。A，糖核酸酶B、核糖核酸酶A和肌红蛋白混合溶液(质量比=1 1 1)直接分析的质谱图；B，糖核酸酶B直接分析的质谱图；C，糖核酸酶B、核糖核酸酶A和肌红蛋白混合溶液(质量比= 1:1:1)经分子印迹聚合物抓取洗脱后洗出液的质谱图。图7. AFP的分子印迹聚合物照片(上)及对溶液中AFP抓取后的化学发光信号与 AFP在溶液中浓度的关系(下)。图8.抗AFP抗体的分子印迹聚合物对人血清中抗AFP抗体的抓取及化学发光检测。图9.滤纸㈧及以滤纸为基底的HRP的印迹聚合物(B)的显微照片。
具体实施例方式实施例1 辣根过氧化物酶(HRP)印迹聚合物的制备HRP分子印迹聚合物的制备过程如下1、准备预聚液，将0. 005g对乙烯基苯硼酸和0. 001 g的安息香二甲醚溶解在 400 μ 1的聚乙二醇200 (PEG200，平均分子量200)、100 μ 1的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGMA)， 磷酸盐缓冲溶液调整PH值至8. 5后加入10mg/ml的HRP溶液5 μ 1，涡旋2分钟(本实施例中指定糖蛋白HRP与功能单体对乙烯基苯硼酸的质量比为1 100)。2、在衍生有双键的玻璃基片上滴加100 μ 1预聚液，贴附含有特定结构的掩膜板，UV(365nm)曝光40s。去掉掩膜板，将聚合物浸泡于乙醇/水的混合溶液中(乙醇体积比为40%)振荡30min，再将聚合物浸泡在乙腈/IOM磷酸溶液(体积比3 7)中2小时，最后用清水清洗30分钟，得到HRP分子印迹聚合物。另外，采用与1中相同的配方但预聚液中不含HRP，采用与2中相同的步骤制备非印迹聚合物。HRP分子印迹聚合物与非印迹聚合物的照片及电镜图见图2。电镜结果表明所得的分子印迹聚合物为多孔结构。这多孔结构有利于印迹分子在印迹聚合物中的传质。实施例2 =HRP印迹聚合物对HRP的识别及与非印迹聚合物的比较 分别用HRP印迹聚合物和非印迹聚合物对HRP进行识别，并采用3，3‘ ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色法进行裸眼检测 1、配制TMB显色液，醋酸钠0. 136g，柠檬酸0. 016g，30%双氧水3μ 1，TMB 1. 5mg，蒸馏水加至5ml。2、分别在非印迹聚合物(图3上A)的A、B、C列上滴加5 μ 1的水(ρΗ 6. 0)、HRP 水溶液(10yg/ml,pH 6.0)和HRP磷酸盐溶液(10yg/ml,pH 8. 5)，2分钟后用乙腈/水的混合溶液(积比为30 70)冲洗非印迹聚合物1分钟，吹干聚合物，每个点上都滴加5 μ 1 TMB显色液，避光反应10分钟，显色后的聚合物用数码相机纪录(图3上)。2、分别在HRP印迹聚合物(图3下)的Α、B、C列上滴加5 μ 1的水(ρΗ6· 0)、HRP 水溶液(10 μ g/ml, ρΗ 6. 0)和HRP水溶液(5 μ g/ml, pH 6.0),2分钟后用乙腈/水的混合溶液(体积比30 70)冲洗印迹聚合物1分钟，吹干聚合物，每个点上都滴加5 μ 1 TMB显色液，避光反应10分钟，显色后的聚合物用数码相机纪录(图3下)。TMB显色照片表明，非印迹聚合物需要在碱性条件(ρΗ = 8.5)才能识别糖蛋白 HRP，而HRP印迹聚合物在弱酸性条件(pH = 6. 0)下即可识别HRP。这种弱酸性条件下的识别能力对于血液等真实样品的分析非常有利。实施例3分子印迹聚合物的抗干扰能力采用与实施例1中相同的制备步骤，配方中磷酸盐缓冲溶液调整ρΗ值至8，制备 HRP印迹聚合物。利用TMB显色法裸眼观测，HRP印迹聚合物在复杂体系中对HRP的识别1、配制复杂溶液1)将50 μ gHRP、Img果糖、Img卵清白蛋白、Img人血红蛋白、Img 牛血清白蛋白溶解于Iml人血清中；2)将10 μ gHRP、Img果糖、Img卵清白蛋白、Img人血红蛋白、Img牛血清白蛋白溶解于Iml人血清中；幻将5 μ gHRP、Img果糖、Img卵清白蛋白、Img 人血红蛋白、Img牛血清白蛋白溶解于Iml人血清中。2、分别在HRP印迹聚合物(图4A)的1、2、3、4、5列上滴加5 μ 1的水、血清、溶液 1)、溶液幻、溶液；3)，2分钟后用乙醇/水的混合溶液(体积比30 70)冲洗HRP印迹聚合物1分钟，吹干聚合物，每个点上都滴加5 μ 1 TMB显色液，避光反应10分钟，显色后的聚合物用数码相机纪录(图4Α和图4Β)。TMB显色照片表明，HRP印迹聚合物可以在复杂体系中识别HRP，具有良好的抗干扰能力。这种抗干扰能力对于血液等真实样品的分析非常有利。实施例4以BABEA (双酚A环氧丙烯酸酯)处理过的滤纸为基底的HRP的印迹聚合物以及对HRP的识别和检测以滤纸为基底的HRP分子印迹聚合物的制备过程如下1、配制环氧丙烯酸酯预聚液，双酚A环氧丙烯酸酯lOOmg，安息香乙醚lmg，超声溶解在200 μ 1乙醇中。2、在滤纸表面旋涂一层环氧丙烯酸酯预聚液，60°C热处理30分钟，贴附含有微结构的掩膜板，UV(365nm)曝光20s。去掉掩膜板，将滤纸浸泡在乙腈中30s，90°C下处理30分钟，清水浸泡10分钟后烘干，得到含有微结构的滤纸(图5A)。3、准备预聚液，将0. OOlg丙烯酰胺基苯硼酸和0. 005g的偶氮二异丁腈(AIBN)溶解在400 μ 1的聚乙二醇200(PEG200，平均分子量200)、100μ 1的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，磷酸盐缓冲溶液调整ρΗ值至8. 5后加入10mg/ml的HRP溶液1 μ 1，涡旋2分钟(本实施例中指定糖蛋白HRP与功能单体丙烯酰胺基苯硼酸的质量比为1 10000)。4、在滤纸微结构的每一个点内滴加1 μ 1的预聚液，UV(365nm)曝光40 S。将滤纸浸泡于乙腈/水的混合溶液中(乙腈体积比为30% )振荡30min，再将聚合物浸泡在30 70的乙腈IOM磷酸溶液中2小时，最后用清水清洗30分钟，得到以滤纸为基底的 HRP分子印迹聚合物。以BABEA处理过的滤纸为基底的HRP印迹聚合物对HRP进行识别，采用TMB显色法裸眼检测分别在I、II、III、IV圈内的白点上滴加1μ 1的HRP水溶液(100μ g/ml,pH 6.0)、 HRP水溶液(10 μ g/ml，pH 6. 0)、HRP水溶液(1 μ g/ml，pH 6. 0)、水，2分钟后乙醇/水的混合溶液(乙醇体积比为30% )冲洗HRP印迹聚合物1分钟，吹干聚合物，每个点上都滴加 2μ 1 TMB显色液，避光反应10分钟，每个点上都滴加2 μ 1 0. IM的硫酸终止显色反应。显色后的印迹聚合物用数码相机纪录(图5Β)。TMB显色照片表明，该分子印迹聚合物在弱酸性条件下可以识别HRP。实施例5核糖核酸酶B的分子印迹聚合物的制备及对核糖核酸酶B不同糖型的识别采用与实施例1中相同的制备步骤，配方中的HRP换成核糖核酸酶B，引发剂安息香二甲醚换成1-羟基环己基苯基酮，制备核糖核酸酶B分子印迹聚合物。采用基体辅助激光解吸离子化(MALDI)-时间飞行(TOF)质谱法，对该印迹聚合物抓取到的核糖核酸酶B糖型进行检测。1、配制待测溶液将核糖核酸酶B、核糖核酸酶Α、肌红蛋白各Img溶解在Iml的水中。2、在核糖核酸酶B分子印迹聚合物上滴加10 μ 1的待测溶液，30分钟后用Iml乙腈/水的混合溶液(体积比20 80)分3次冲洗印迹聚合物，吹干聚合物，用10μ1的乙腈IM醋酸混合液(体积比30 70)解吸抓取到的核糖核酸酶B，微量移液枪吸取转移到微量离心管。取0. 5μ1上述解吸液点板，待干后，取0. 5μ1肉桂酸溶液(lOmg/mlJO^乙腈，0.1%三氟乙酸)作为基质点在样品上。待其干后，进行质谱分析。质谱分析结果见图6。质谱结果表明，核糖核酸酶B分子印迹聚合物可以在混合溶液中专一抓取核糖核酸酶B，并完整地保留了该糖蛋白的微观不均一性。说明本发明所提出的分子印迹技术具有良好的糖基差异识别能力。利用该性质，本发明可以用于制备识别糖基结构存在微小差异的糖蛋白，如用于识别内源性和外源性的糖蛋白。此外，该结果表明， 本发明可用于印迹多个糖蛋白的混合物。实施例6甲胎蛋白分子印迹聚合物的制备及与化学发光检测联用对甲胎蛋白的检测采用与实施例1中相同的制备步骤，配方中的HRP换成甲胎蛋白，400 μ 1聚乙二醇 200更换成500 μ 1聚乙二醇300，100 μ 1的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGMA)更换成0. 05g的甲叉双丙烯酰胺，制备甲胎蛋白分子印迹聚合物。采用化学发光的方法检测甲胎蛋白印迹聚合物对血清中甲胎蛋白的识别1、配制鲁米诺混合液A) 3-氨基邻苯二甲酰肼177mg溶解在IOOml 0. IM的NaOH中，避光保存；B)对碘苯酚(PIP) IlOmg溶解在5ml的二甲基亚砜(DMSO)中，蒸馏水稀释至50ml，
避光保存；C)化学发光检测前分别取50 μ 1溶液A和溶液B混合，用ρΗ 8. 5的磷酸盐缓冲溶液稀释至1000 μ 1，加入3 %的双氧水3. 4 μ 1。
2、配制待测溶液1)将IOng甲胎蛋白溶解于Iml人血清中；2)将20ng甲胎蛋白溶解于Iml人血清中；3)将30ng甲胎蛋白溶解于Iml人血清中。3、分别在甲胎蛋白印迹聚合物(图7A)的1、2、3、4、5列上滴加2μ 1的水、血清、 溶液1)、溶液2、、溶液幻，2分钟后用乙醇/水混合溶液(体积比30 70)冲洗甲胎蛋白印迹聚合物1分钟，每个点上都滴加2 μ 1的0. lmg/ml HRP标记的抗甲胎蛋白抗体，2分钟后用乙醇/水混合溶液(体积比30 70)冲洗甲胎蛋白印迹聚合物1分钟，吹干聚合物。4、在每个点上都滴加2 μ 1鲁米诺混合液，随即用化学发光检测器检测并光强，重复3次实验，得到图7Β中的柱状图。实验结果表明，甲胎蛋白印迹聚合物可以识别人血清中的微量甲胎蛋白，说明该人工抗体具有非常优秀的专一识别性和抗干扰能力。实施例7抗甲胎蛋白抗体的分子印迹聚合物的制备及与化学发光检测联用对抗甲胎蛋白抗体的检测采用与实施例1中相同的制备步骤，配方中的HRP换成鼠抗人甲胎蛋白抗体， 400 μ 1聚乙二醇200更换成800 μ 1聚乙二醇200，制备鼠抗人甲胎蛋白抗体分子印迹聚合物。采用化学发光的方法检测鼠抗人甲胎蛋白抗体印迹聚合物对血清中鼠抗人甲胎蛋白抗体的识别1、配制待测溶液1)将Ing HRP标记的鼠抗人甲胎蛋白抗体溶解于Iml人血清中； 2)将5ng HRP标记的鼠抗人甲胎蛋白抗体溶解于Iml人血清中；3)将IOng HRP标记的鼠抗人甲胎蛋白抗体溶解于Iml人血清中；4)将IOOngHRP标记的鼠抗人甲胎蛋白抗体溶解于Iml人血清中。2、分别在鼠抗人甲胎蛋白抗体印迹聚合物的1、2、3、4、5列上滴加2μ 1的水、溶液 1)、溶液幻、溶液幻、溶液4)，2分钟后用乙醇/水混合溶液(体积比30 70)冲洗鼠抗人甲胎蛋白抗体印迹聚合物1分钟，吹干聚合物。3、在每个点上都滴加2μ1鲁米诺混合液，随即用化学发光检测器检测并光强，得到图8中结果。实验结果表明，鼠抗人甲胎蛋白抗体的印迹聚合物可以直接检测人血清中的微量鼠抗人甲胎蛋白抗体。该检测方法具有优异的专一选择性和检测灵敏度，检测下限达到了 lng/ml0实施例8 以滤纸为基底的HRP的印迹聚合物的制备采用与实施例1中相同的制备步骤，配方中ΙΟΟμΙ的聚乙二醇双丙烯酸酯 (PEGMA)更换成0. 05g的甲叉双丙烯酰胺，0. OOlg对乙烯基苯硼酸更换成0. Ig间乙烯基苯硼酸，直接在滤纸上制备圆形的HRP印迹聚合物。以滤纸为基底的HRP分子印迹聚合物的显微镜照片见图9B。图9说明分子印迹聚合物可以直接制备在滤纸上，滤纸可以无需前处理。
权利要求
1.一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是它是以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，在碱性条件下，将指定的糖蛋白为模板与含双键的取代苯硼酸形成复合物，和含双烯键的交联剂、紫外固化系统的光引发剂及致孔剂混合，通过紫外光照射引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的共聚反应形成聚合物，然后用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有与糖蛋白糖基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是所述的指定糖蛋白是辣根过氧化物酶、核糖核酸酶B、甲胎蛋白或抗甲胎蛋白抗体。
3.根据权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是所述的功能单体含双键的取代苯硼酸是对乙烯基苯硼酸、间乙烯基苯硼酸或间丙烯酰胺基苯硼酸。
4.根据权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是所述的含双烯键的交联剂是聚乙二醇双丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉双丙烯酰胺。
5.根据权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是所述的紫外固化系统的光固化剂是安息香二甲醚、偶氮二异丁腈、1-羟基环己基苯基酮或安息香乙醚。
6.根据权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，其特征是所述的致孔剂是聚乙二醇。
7.一种制备权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物的方法，其特征是它包括如下步骤步骤1.将指定糖蛋白的模板分子与功能单体含烯键的取代苯硼酸按1:100-1:10000的质量比，在弱碱性条件下混合均勻，以形成共价复合物，加入光引发剂，交联剂与致孔剂按1:4-1:8的体积比加入，交联剂与功能单体含烯键的取代苯硼酸的质量比为 1:100-1:1，混合均勻，得到的溶液成为预聚液，在表面修饰了双键的基片如玻璃片或滤纸上滴加预聚液，涂布均勻；步骤2.将带有特定图案的掩膜覆盖到上述基片上，在紫外光下暴光，透光部分因紫外光照射诱发而聚合，而被遮挡的部分则不聚合；步骤3.撤去掩膜，用溶剂清洗，除去未聚合部分，得到跟掩膜图案一致的分子印迹材料；步骤4.用酸性溶液荡洗步骤3得到的分子印迹材料，除去聚合物中的印迹分子，则得到专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，也即为专一结合指定糖蛋白的人工抗体。
8.权利要求1所述的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物在检测样品内特定糖蛋白中的应用。
全文摘要
一种专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物，它是以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，在碱性条件下，将指定的糖蛋白为模板(印迹分子)与含双键的取代苯硼酸(功能单体)形成复合物，和交联剂、引发剂及致孔剂混合，通过紫外光照射引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的共聚反应形成聚合物，然后用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子(指定的糖蛋白)，得到含有与糖蛋白糖基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物。本发明的专一结合指定糖蛋白的分子印迹聚合物具有专一性高、抗干扰能力强、实用样品范围宽、重复性好、制备简单等优点，可直接于血清、唾液等复杂生物体系中检测待测抗原。本发明公开了其制法。
文档编号C08F2/44GK102516458SQ201110416198
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者刘震, 李澧 申请人:南京大学