一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及用壳青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏编号是: CGMCC 11573 保藏日期：2015年11月03日) 生产包含吲哚生物碱类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在抗H1N1病毒中的用途。

背景技术：

本发明人将壳青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏编号是: CGMCC 11573)在液体培养基中培养时添加吲哚（终浓度150mg/L），从得到的发酵产物中分离出一个吲哚生物碱类化合物。研究发现所示该吲哚生物碱化合物具有显著的抗病毒活性，表明上述吲哚生物碱进一步有可能开发成新型抗病毒药物。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种结构新颖的具有抗病毒活性的新化合物。其结构式是

式 Ⅰ

本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物在含吲哚的发酵培养条件下来获取含有该类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用Sephadex LH20凝胶柱层析，反相中压MPLC,反相半制备HPLC方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏编号是: CGMCC 11573) 制备本发明式Ⅰ化合物的实例。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子或氮原子的标位)是：

化合物Ⅰ

实施例1 化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制

1 发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取壳青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏编号是: CGMCC 11573)适量，接种到PDA固体平面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。

取固体平面培养4天的壳青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)适量，接种到装有300 mL培养基[培养基组成（克/升）：可溶性淀粉 40.0，酵母膏 1.0，味精 2.0，蔗糖 40.0，麦芽糖 30.0，黄豆粉 0.5，蛋白胨 2.0，MgSO₄ · 7H₂O 0.3，KH₂PO₄ 0.5]的1000 mL锥型瓶中，并加入吲哚(45mg, 由500μL DMSO溶解)，使其在培养基中的终浓度150mg/L，在28摄氏度条件下静置培养30天，获得发酵产物。

2 浸膏的获得

将所得发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏，共1.2克。

3 化合物的分离精制

浸膏（1.2克）用甲醇溶解后，以甲醇为溶剂进行LH20柱层析，分为4个流份。组分2先以C-18 ODS中压柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，最后经反相半制备高效液相色谱（甲醇：水=75:25）得化合物Ⅰ（15 mg）。

化合物Ⅰ 乳白色粉末，分子式C₂₈H₂₇NO₆，HR-ESI-MS m/z: 474.1910 [M+H]⁺，计算值474.1911。IR (KBr) v_max 3345, 2923, 1625, 1330, 744 cm^-1。¹H和¹³C-NMR数据见表1。

表 1 化合物Ⅰ的¹H和¹³C NMR数据（500和125 MHz，in DMSO-d₆）^a

a) 本表信号归属基于HMQC及HMBC图谱解析结果。

b) 此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹³C核。

实施例2化合物的抗病毒活性测试

1 实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。

抗H1N1流感病毒活性采用CPE 方法测定，及采用细胞培养技术，以抗病毒药物利巴韦林为阳性对照药，比较观察化合物对流感病毒引起的细胞病变（CPE）的抑制作用。将流感病毒液接种到单层 MDCK 细胞上于37^oC 吸附 1 个小时，弃上清液。加入待测化合物 DMSO 溶液（终浓度 50ug/ml），37 ^oC保温 48 小时，用 PBS 洗 3 次，结晶紫溶液（1%的结晶紫溶解于20%乙醇和3.7%甲醛的水溶液中）染色，之后至于酶标仪上测定 630nm 处的光密度 OD值。

抑制率按照以下公式计算：

病毒抑制率(%)= （药物对照组OD值-病毒对照组OD值）/（细胞对照组OD值-病毒对照组OD值）*100%

抑制率大于70%视为具有强效抗流感病毒活性，介于50%~70%为中效，介于30%~50%为弱效。

2 实验结果

采用CPE 方法对所示化合物Ⅰ抗H1N1流感病毒活性进行了研究，以抗病毒药物利巴韦林为阳性对照药，结果发现所述化合物Ⅰ对流感病毒引起的细胞病变（CPE）有明显的抑制作用。化合物Ⅰ在50μg/ml终浓度下对病毒的抑制率为82.5% （阳性对照药利巴韦林在50μg/ml浓度下抑制率为72.1%），IC₅₀为34μM（阳性对照药利巴韦林IC₅₀为94 μM）。

3 结论

化合物Ⅰ具有较好的抗H1N1流感病毒活性，可作为新型抗病毒药，用于治疗H1N1流感病毒感染。