两亲性嵌段聚合物、光和pH双重响应的聚合物复合型囊泡及其制备方法和应用与流程

本发明属于高分子材料及其应用技术领域，具体涉及一种两亲性嵌段聚合物、光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

超分子自组装的概念在分子科学中非常重要。设计恰当的基元分子，通过超分子自组装构建结构复杂尺寸在纳米级别的物质，这一概念的提出极大的支撑了许多领域(例如材料科学以及分子生物学)的发展。基于超分子大环主体分子的主客体相互作用性质已经被超分子化学家们广泛地研究，通过这种主客体相互作用，两个或多个分子可以被简单地整合到一起，且得到的该超分子复合物具有一定的可逆性。这种构建方法可以被用来构建新型的超分子结构。其中柱芳烃可作为主体分子，包封对应的各种类型的客体分子，形成刺激响应性超分子结构，这种主客体复合物具有较高的稳定性，已被用来构建各种新型的多功能化的超分子纳米材料。

由于其独特的结构和自组装形态的多样性，两亲性嵌段共聚物的设计合成一直备受人们的重视，而以两亲性嵌段共聚物作为基本结构单元，通过自组装方法制备刺激响应性的共聚物高分子材料更是近来人们的研究热点之一。刺激响应性两亲性嵌段共聚物是指共聚物因外界环境的改变而自身会发生相应变化的行为。外界环境的刺激包括化学刺激和物理刺激两类，其中化学刺激包括溶剂的种类、极性、溶液的ph、离子强度、氧化还原性等，而物理刺激包括外界温度、磁场、光、电等。这些外界环境的刺激最终会使两亲性嵌段共聚物在形貌、相态、透光性、机械性能、表面能和渗透速率等方面发生物理或化学性质相应方面的突变。刺激响应性两亲性嵌段共聚物由于独特的刺激响应性，可在特定的条件下形成特定的结构，并根据具体应用领域的需要设计合成出不同种类的高分子聚合物，满足其在药物的运输及控制释放、生物传感器、催化、纳米反应器、组织工程、污水处理以及其它生物医药等方面的应用。

囊泡是由双亲分子自组装形成的一种超分子聚集体，它们是由密闭双分子层所形成的球形的单腔室或多腔室的缔合结构，类似于细胞膜结构。它的一个重要的应用是作为药物的载体。与其它微结构相比，囊泡具有奇特的结构，即存在亲水微区和疏水微区，这使得囊泡具有同时运载水溶药物和水不溶药物的能力。同时，囊泡作为药物载体，具有改变药物在体内的分布、防止药物降解失活、延长药物的作用时间以及降低药的毒、副作用等特性。因此在囊泡在应用方面有巨大的潜力。

如申请号为201310552348.7的中国发明专利公开了两亲性嵌段聚合物、由其组成的聚合物囊泡以及该聚合物囊泡的制备方法和应用，该两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过可逆加成-断裂链转移聚合(raft)法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了三硫酯的聚乙二醇，其分子量为1000～20000da。通过使用该两亲性嵌段聚合物，实现了囊泡负载的亲水和疏水分子的可控同步释放，刺激调控囊泡负载的酶反应器的生物催化活性。另外，在刺激触发交联的过程中，聚合物囊泡的双层膜中产生的筛状亲水通道和膜的渗透性能够通过刺激的持续时间来控制。但到目前为止，尚未见有具有多重响应性能的聚合物复合型囊泡及其作为药物载体的研究报道。复合型囊泡指大囊泡中包含许多尺寸较小的囊泡结构，这种独特结构的囊泡在载药性能和药物传递过程中的行为仍未知。另外，偶氮苯作为亲水链段的药物载体的研究报道也未知。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种含偶氮苯作为亲水链段的两亲性嵌段聚合物、光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡及其制备方法和应用。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种两亲性嵌段聚合物，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过开环聚合和原子转移自由基聚合法获得，其中所述亲水链段为偶氮苯基团修饰的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，所述亲水链段的结构为下式a所示，

式a：其中m＝12～90，x＝1～3；

所述疏水链段为聚己内酯嵌段，结构为下式b所示，

式b：其中n＝50～200。

优选的，所述两亲性嵌段聚合物的数均分子量为16400～53500g/mol。

本发明还提供一种光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡，所述聚合物复合型囊泡由所述两亲性嵌段聚合物与具有ph响应性的柱[6]芳烃通过主客体络合自组装形成，所述柱[6]芳烃的结构为下式c所示，

式c：

所述两亲性嵌段聚合物的结构为下式d所示：

式d：其中m＝12～90，x＝1～3，n＝50～200。

优选的，所述聚合物复合型囊泡的结构为大囊泡内包含若干个小囊泡。

优选的，所述聚合物复合型囊泡的最外层和最里层是由所述两亲性嵌段聚合物中的亲水链段构成，所述最外层和最里层之间的中间层由所述两亲性嵌段聚合物中的疏水链段构成，其中所述大囊泡的尺寸为100～200nm，所述小囊泡的尺寸为10～60nm。

本发明还提供一种所述聚合物复合型囊泡的制备方法，包括以下步骤：

a)将两亲性嵌段聚合物溶于良溶剂中形成溶液一，备用；将柱[6]芳烃溶于缓冲溶液中形成溶液二，备用；

b)将所述溶液一以预设的速度注入至所述溶液二中，混合均匀后置于透析袋中以透析除去有机溶剂，从而获得聚合物复合型囊泡分散液；

c)将所述聚合物复合型囊泡分散液冷冻干燥，从而获得光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡。

优选的，所述步骤a)在室温条件下进行，所述溶液一与溶液二的体积比为1：8～10。

优选的，所述良溶剂为n，n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜或二甲基乙酰胺；所述柱[6]芳烃为水溶性柱芳烃；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，ph大于或等于7.4。

本发明的所述聚合物复合型囊泡作为药物载体的应用，所述聚合物复合型囊泡的中间层用于负载疏水性药物，所述聚合物复合型囊泡中间空腔用于负载亲水性药物。

本发明还提供所述聚合物复合型囊泡负载药物的方法，包括以下步骤：

1)将两亲性嵌段聚合物溶于良溶剂中形成溶液三；将柱[6]芳烃溶于缓冲溶液中形成溶液四；

2)将所述疏水性药物溶于良性溶剂形成疏水性药物溶液或亲水性药物溶于缓冲溶液中形成亲水性药物溶液，并将疏水性药物溶液与所述溶液三混合均匀形成溶液五或将亲水性药物溶液与所述溶液四混合均匀形成溶液六；

3)将所述溶液五以预设的速度注入至所述溶液四或将所述溶液三以预设的速度注入至所述溶液六中，混合均匀后置于透析袋中以透析除去有机溶剂，从而获得含有药物的聚合物复合型囊泡分散液；

4)将含有药物的聚合物复合型囊泡分散液冷冻干燥，从而获得负载药物的光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡。

优选的，所述疏水性药物或亲水性药物与两亲性嵌段聚合物的质量比为1：1～3。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

1)本发明在嵌段聚合物分子亲水链段中引入光响应基团，同时亦可引入其他的刺激响应性基团，拓宽聚合物的功能；

2)本发明利用水溶性柱[6]芳烃与嵌段聚合物络合，构建双重响应体系，同时偶氮苯基团引入到两亲性分子的亲水链段中，与柱[6]芳烃形成主客体结构，自组装形成了复合型囊泡结构，可在不同条件刺激下进行可逆形貌转变，同时这种结构与溶酶体吞噬过程相似，更有利于聚合物复合型囊泡进入细胞。

3)本发明制备的载药聚合物复合型囊泡具有光和ph双重响应，可在相应的条件下进行刺激响应释放，具有潜在的应用价值。

4)本发明制备的聚合物复合型囊泡具有较低的细胞毒性，载药的聚合物复合型囊泡具有较高的细胞相容性，可作为药物的载体，具有潜在应用价值。

5)本发明的光和ph双重响应的聚合物复合型囊泡的制备方法和负载药物的方法，制备条件温和，工艺简单，高效实用。

附图说明

图1是本发明实施例2的嵌段聚合物自组装形成的核壳结构形貌图。

图2是本发明实施例4的聚合物复合型囊泡的形貌图。

图3是本发明所述聚合物复合型囊泡的刺激-响应释放曲线。

图4是本发明所述聚合物复合型囊泡的细胞毒性测试。

图5是本发明所述聚合物复合型囊泡的细胞吞噬测试。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。

实施例1：

1、聚己内酯大分子引发剂的合成

在洁净的带有搅拌磁子的schlenk反应瓶中依次加入己内酯、甲苯、2-羟乙基-2-溴-2甲基丙酸酯，反应体系进行三次液氮冷却-抽真空-充氮-解冻循环后，加入催化剂辛酸亚锡，接着在氮气气氛下密封，置于120℃油浴中反应24h后，淬冷至室温终止反应；将聚合反应溶液倒入沉淀剂中沉淀，重复溶解沉淀操作三次，过滤得到卤代端基聚己内酯大分子引发剂，mn＝26600g/mol，pdi＝1.08，组成为pcl170-br。其中，己内酯、2-羟乙基-2-溴-2甲基丙酸酯、辛酸亚锡的摩尔比为300：1：0.1。

2、两嵌段聚合物的合成

在洁净的带有搅拌磁子的schlenk反应瓶中依次加入pcl170-br、四氢呋喃、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，反应体系进行三次液氮冷却-抽真空-充氮-解冻循环后，加入催化剂溴化亚铜cubr，接着在氮气气氛下密封，置于60度的油浴中反应3h后，投入液氮中终止反应；然后加入适量四氢呋喃，并过中性氧化铝层析柱，浓缩后倒入沉淀剂中沉淀，重复溶解浓缩沉淀操作三次，过滤得到两嵌段聚合物，mn＝36700g/mol，pdi＝1.11，组成为pcl170-b-pdm72。其中，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚己内酯pcl170-br、cubr的摩尔比为100：1：1。

3、偶氮苯基团小分子的制备

将亚硝酸钠溶液缓慢注入对甲氧基苯胺的盐酸溶液中，冰水浴中搅拌2小时，再将上述混合溶液注入至苯酚的氢氧化钠溶液中，冰水浴中搅拌2小时，苯酚与对甲氧基苯胺的摩尔比为1：1，产物经洗涤干燥后与1，4-二溴丁烷、无水碳酸钾、碘化钾一起混合至三口烧瓶中，接着加入无水丙酮进行溶解；混合物进行氮气保护并在65℃油浴中反应24h，混合物经过过滤，旋蒸，乙酸乙酯重结晶，得到偶氮苯基团小分子bmazo。

4、光响应的两亲性嵌段聚合物的制备

向三口烧瓶中加入上述合成的pcl170-b-pdm72和偶氮苯基团小分子bmazo，然后在氮气氛围下加入20mldmf溶解，其中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(dm)单元与偶氮苯基团小分子的摩尔比为1：50，在80℃下反应24小时后，产物装入透析袋内，用dmf透析去除未反应的bmazo，接着在去离子水中透析，除去有机溶剂dmf，冷冻抽干得到光响应的两亲性嵌段聚合物，为下式所示：

光响应的两亲性嵌段聚合物的疏水链段pcl如式a所示：

a：n为50-200之间的整数；

光响应的两亲性嵌段聚合物的亲水链段pdmazo如式b所示：

b：m为12～90之间的整数，x为1～3之间的整数；

其中，光响应的两亲性嵌段聚合物的数均分子量mn为16400～53500g/mol，分子量分布为1.10～1.30。

亲水链段与疏水链段长度比将影响聚合物自组装的纳米结构，因此作为优选方案，两亲性嵌段聚合物结构式中的n为170，m为72。本实施例获得的两亲性嵌段聚合物具有光响应性。

实施例2：

将实施例1中得到的含偶氮苯基团的两亲性嵌段聚合物在25℃下溶解于dmf中，配成浓度为1mg/ml的溶液。将聚合物溶液以5ml/h，缓慢注入到ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，二者体积比为1：9，混合均匀注入到透析袋中，用相同的磷酸盐缓冲溶液透析，除去有机溶剂。将制备的透析液液冷冻干燥，即制得由两亲性嵌段聚合物自组装形成的纳米粒子(如图1所示)。

本实施例说明该两亲性嵌段聚合物可在磷酸盐缓冲溶液中自组装形成以pcl嵌段为核，含偶氮苯嵌段为壳的核壳结构纳米粒子。

实施例3：

光与ph双重响应的聚合物复合型囊泡的制备方法，包括以下步骤：

1)将实施例1获得的光响应的两亲性嵌段聚合物溶解于n，n-二甲基甲酰胺dmf中，配制成浓度为1mg/ml的溶液一，置于10～40℃(优选为25℃)环境温度下备用；

2)将水溶性柱[6]芳烃溶解于ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液形成溶液二，置于25℃环境温度下备用；

3)将溶液一以5ml/h的速度缓慢注入至溶液二中，溶液一与溶液二的体积比为1：9，混合均匀注入到透析袋中，用相同的磷酸盐缓冲溶液进行透析72h，除去有机溶剂，获得聚合物复合型囊泡分散液；

4)将步骤3)的聚合物复合型囊泡分散液冷冻干燥36h，获得聚合物复合型囊泡。

本实施例利用水溶性柱[6]芳烃与嵌段聚合物络合，构建双重响应体系，同时偶氮苯基团引入到两亲性分子的亲水链段中，与柱[6]芳烃形成主客体结构，自组装形成了囊泡复合型结构。

另外，本实施例的磷酸盐缓冲溶液的ph还可大于7.4；溶液一与溶液二的体积比还为1：8或1：10或1：8.5。体积比不同对囊泡的光和ph响应性无影响，但可能对自组装形貌有一定的影响。

另外，本实施例的n，n-二甲基甲酰胺dmf可替换为二甲基亚砜或二甲基乙酰胺，良溶剂的改变对自组装的形貌有一定的影响。

实施例4：

通过实施例3获得的聚合物复合型囊泡由实施例1的两亲性嵌段聚合物与具有ph响应性的柱[6]芳烃通过主客体络合自组装形成，其中，柱[6]芳烃的结构如下式c所示，

式c：

本实施例获得的聚合物复合型囊泡如图2所示，聚合物复合型囊泡的结构为大囊泡内包含若干个小囊泡，大囊泡的尺寸为100～200nm，所述小囊泡的尺寸为10～60nm，且聚合物复合型囊泡具有如下特征：聚合物复合型囊泡的最外层和最里层是由两亲性嵌段聚合物中的亲水链段构成，最外层和最里层之间的中间层由两亲性嵌段聚合物中的疏水链段构成；

本实施例的聚合物复合型囊泡可在不同条件刺激下进行可逆形貌转变，同时这种结构与溶酶体吞噬过程相似，更有利于聚合物复合型囊泡进入细胞。

实施例5：

光与ph双重响应的聚合物复合型囊泡负载亲水性药物(盐酸阿霉素)的负载方法，包括以下步骤：

a)将实施例1获得的光响应的两亲性嵌段聚合物溶解于dmf中，配制成浓度为1mg/ml的溶液五，将溶液五置于25℃环境温度下备用；

b)将柱[6]芳烃和盐酸阿霉素溶解于ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液形成溶液六，其中两亲性嵌段聚合物和盐酸阿霉素的质量比为2：1，将溶液六置于25℃环境温度下备用；

c)将溶液五以5ml/h的速度缓慢注入至溶液六中，混合均匀后注入到透析袋中，用相同的磷酸盐缓冲溶液透析72小时，除去有机溶剂；

d)将步骤c)中透析好的分散液冷冻干燥36小时，即制得负载亲水性盐酸阿霉素的具有光与ph双重响应的聚合物复合型囊泡。

实施例6：

将实施例5中的两亲性嵌段聚合物与盐酸阿霉素的质量比由2：1分别更换为1：1和3：1，其余条件不变，得到不同的载药量与包封率如下表1所示：

表1不同药物比率下聚合物复合型囊泡的包封率和载药量

本实施例说明聚合物质量与盐酸阿霉素质量比为2:1时，得到的载药聚合物复合囊泡具有较高的包封率和载药量。

实施例7：

将实施例5制得的装载盐酸阿霉素的聚合物复合型囊泡用于不同刺激条件下的体外释放，操作如下：取10mg聚合物复合型囊泡干粉溶于10mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，装入透析袋中；将透析袋放入装有150mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液的烧杯中，每隔一定的时间取4ml烧杯中缓冲液，同时加入4ml新鲜的磷酸盐缓冲溶液，用紫外分光光度计测量盐酸阿霉素的累积释放量，得到无刺激条件下的药物累积释放曲线；用同样的方法，调节烧杯内溶液的ph为3.0，其他操作不变，得到ph刺激条件下的药物累积释放曲线；在外加365nm紫外光刺激条件下，用同样的方法测量盐酸阿霉素的累积释放量，得到紫外光刺激条件下的药物累积释放曲线。当调节其溶液的ph至酸性，柱[6]芳烃上的羧酸氨被质子化形成羧酸的形式，降低了其在水溶液中的溶解性，超分子囊泡结构被破坏解组装从而释放出其中包载的抗癌药物。同时在紫外光刺激下，顺式偶氮苯与柱[6]芳烃的络合解开，超分子囊泡结构被破坏解组装从而释放出其中抗癌药物。如图3所示，其结果表明，载药的聚合物复合型囊泡具有光与ph双重刺激响应来释放包载的药物。

实施例8：

mtt法测未载药的聚合物复合型囊泡对mcf-7人乳腺癌细胞的毒性测试，其操作如下：mtt法使用人乳腺细胞mcf-7，以5×10³个/ml将细胞种于96孔板，每孔100μl，24小时后培养至细胞贴壁70％左右；然后，实验组各孔中分别加入含有聚合物浓度分别为100、200、300、400和500μg/ml的未载药的聚合物复合型囊泡样品，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔(复4孔)。培养48小时后，每孔加入mtt(5.0mg/ml)10μl，继续培养4小时后每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)溶解生成的结晶，用酶标仪于570nm处测吸光度值(a)，以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。结果如图4所示，当聚合物复合型囊泡的浓度从0.1增到0.5mg/ml时，mcf-7细胞的存活率仍高于98％，说明本发明的复合型聚合物复合型囊泡具有良好的生物相容性。

实施例9：

装载盐酸阿霉素的聚合物复合型囊泡的内吞和细胞内释放实验。实验以dapi标记mcf-7细胞的细胞核，在激光激发下显示蓝色荧光、盐酸阿霉素自身在激光激发下显示红色荧光、采用激光共聚焦显微镜(clsm)跟踪测定。将400μl的mcf-7细胞的1640培养基悬浮液铺于24孔培养板(每孔5×10⁴个细胞)中，37℃、5％二氧化碳条件下培养24h。将100μl装载盐酸阿霉素的复合型聚合物复合型囊泡的磷酸盐缓冲溶液加入孔中(fitc终浓度为15μg/ml)，分别孵育1、3、6小时后，移去培养基，用4％的多聚甲醛溶液200μl固定15min、磷酸盐缓冲溶液洗3次。最后用激光共聚焦观察拍照，其结果如图5所示，其中“细胞核染料”列为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)标记的细胞核，可在激光的激发下显现蓝色信号，“药物”列为自带荧光的盐酸阿霉素，可在激光激发下显现红色信号，“合图”列为前两列的合并图像。肿瘤细胞的通透性比正常细胞要高，因而更易于吞噬聚合物复合型囊泡，聚合物复合型囊泡被癌细胞吞噬以后，由于细胞内环境的改变(如ph)，聚合物复合型囊泡结构被破坏解组装从而释放出其中抗癌药物，从而杀死癌细胞。相比于普通囊泡，聚合物复合型囊泡形貌特殊，在大囊泡中包含许多小囊泡，这种结构与溶酶体在细胞吞噬过程中的结构相似，更利于囊泡的吞噬与药物的释放。实验结果表明肿瘤细胞对聚合物复合型囊泡有很好的吞噬作用，且药物释放速率更快，能更快地杀死癌细胞，可用作潜在的药物载体。

实施例10：

将实施例5中的盐酸阿霉素药物更改为疏水性药物吲哚美辛，具体的光与ph双重响应的聚合物复合型囊泡负载疏水性药物(吲哚美辛)的负载方法，包括以下步骤：

a)将实施例1获得的光响应的两亲性嵌段聚合物溶于dmf中，配制成浓度为1mg/ml的溶液七，将吲哚美辛溶于dmf形成疏水性药物溶液，将溶液七与疏水性药物溶液混合均匀形成溶液八，将溶液八置于25℃环境温度下备用，其中两亲性嵌段聚合物与吲哚美辛的质量比为2：1；

b)将柱[6]芳烃溶于ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液形成溶液九，将溶液九置于25℃环境温度下备用；

c)将溶液八以5ml/h的速度缓慢注入至溶液九中，混合均匀后注入到透析袋中，用相同的磷酸盐缓冲溶液透析72小时，除去有机溶剂；

d)将步骤c)中透析好的分散液冷冻干燥36小时，即制得负载疏水性吲哚美辛的具有光与ph双重响应的聚合物复合型囊泡，由紫外-可见光谱图测得包封率为54％，载药量为21％。聚合物复合型囊泡的最外层和最里层是由两亲性嵌段聚合物中的亲水链段构成，最外层和最里层之间的中间层由两亲性嵌段聚合物中的疏水链段构成，疏水性药物被装载在囊泡壁的中间疏水层上，因此相比于亲水性药物的装载，其包封率与载药量较低。

本实施例的两亲性嵌段聚合物与吲哚美辛的质量比为2：1可更换为1：1或3：1，得到不同的吲哚美辛负载量。

以上对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。