玉米胚性愈伤组织诱导相关基因GRMZM2G023133的InDel分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子遗传学领域，涉及一种玉米胚性愈伤组织诱导相关基因grmzm2g023133的indel分子标记及应用。

背景技术：

玉米是全世界重要的粮食作物和能源作物，中国虽然是全世界玉米第二大生产国，但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和适应性广的优质玉米种质资源。转基因育种是改良玉米种质资源的重要途径之一。幼胚诱导胚性愈伤组织这一过程是整个玉米遗传转化的重要环节，诱导效率的高低直接影响着转基因成功率的高低。

研究和生产实践表明，幼胚胚性愈伤组织诱导率是一个复杂的数量性状，在玉米自交系间存在显著的基因型差异。大多数玉米骨干自交系胚性愈伤组织诱导率很低，有些甚至根本无法诱导出胚性愈伤组织，因而不能直接作为外源基因的直接受体，只能以回交转育的方法接受来源于转基因自交系的目的基因。我国传统的转基因玉米品种培育技术体系须经历遗传转化、自交纯化、回交转育、杂交组配等几个环节，仅转化体中目标基因回交转育至骨干自交系则需3～5年时间，极大的延长了玉米转基因育种周期。鉴定控制玉米胚性愈伤组织诱导相关基因，阐明愈伤组织形成的分子机理，为培育更多高胚性愈伤组织诱导率骨干自交系提供理论支持，为加快转基因玉米育种进程奠定基础，另一方面也能促进整个基因功能研究领域的快速发展。

全基因组关联分析(gwas)是一种在自然群体中基于连锁不平衡(ld)鉴定表型性状与遗传标记间关系的分析方法，是挖掘优良等位基因的有效途径。qtl定位则是利用连锁群体基于遗传标记与qtl是否连锁鉴定影响数量性状的基因在染色体上所处的区段。qtl定位是针对全基因组的qtl扫描，而关联分析可以对某个snp进行更精确地定位。因此，关联分析和qtl定位是互补的，可用关联分析鉴定出显著的snp位点，然后在连锁群体中对其进行验证，两种方法的整合将大大促进复杂数量性状的剖析。目前，玉米种质改良和分子辅助育种中尚未有胚性愈伤组织诱导相关基因分子标记开发与利用的报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供玉米胚性愈伤组织诱导相关基因grmzm2g023133的indel分子标记，该indel标记与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率显著相关。

本发明的第二个目的是提供扩增上述indel标记的引物对。

本发明的第三个目的是提供上述indel标记的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：收集中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系301份，作为本研究的关联群体，结合关联群体自交系幼胚胚性愈伤组织诱导率的表型数据和snp基因型数据，运用tassel软件的一般线性模型和混合线性模型两种方法进行全基因组关联分析，检测到一个(maizeb73refgen_v3chr6:1647888954bp)与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率显著关联的indel位点。该位点位于grmzm2g023133基因内部，等位基因为7bp插入/缺失，在供试自交系中有缺失和插入两种纯合基因型，所述7bp的序列如seqidno.1所示，该等位基因的侧翼序列如seqidno.2所示。

该indel分子标记与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率显著相关，等位基因为7bp插入的玉米自交系材料胚性愈伤组织诱导率高于等位基因为7bp缺失的玉米自交系材料。

筛选到一个显著关联的indel后，基于位点侧翼序列，申请人设计了包含上述indel位点的检测玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率相关基因grmzm2g023133的特征性引物对。引物对序列如下所示：

上游(f)：caagatggctcggccattgga(seqidno.3)

下游(r)：agtaaagttggacgtacggggc(seqidno.4)

进一步，本发明提供了上述indel分子标记在鉴定玉米幼胚胚性愈伤组织诱导能力相关基因grmzm2g023133中的应用；及在筛选或鉴定玉米幼胚胚性愈伤组织诱导能力高的种质资源中的应用；在玉米种质改良中的应用。以及在提高玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率中的应用。优选地，indel分子标记的位点基因型7bp插入为优异基因型。本发明还提供了上述indel分子标记在玉米转基因育种中的应用。

本发明提供一种检测玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率相关基因grmzm2g023133的方法，用上述引物对进行pcr扩增，待检测玉米基因组dna，如果能够扩增出seqidno.2所示的片段，则说明该待检测玉米存在幼胚胚性愈伤组织诱导率相关基因grmzm2g022133。

pcr程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35个循环；68℃再延伸10min。

同时，发明人利用已构建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群体的239个家系为连锁群体，结合binmarker基因型数据和幼胚胚性愈伤组织诱导率的表型数据，进行qtl定位。结果发现上述indel分子标记落在qtl定位的区段里，进一步验证了上述indel分子标记与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率的重要性。

为进一步验证所开发标记的有效性，发明人在关联群体和连锁群体里各挑选8份玉米自交系，测定其幼胚胚性愈伤组织诱导率(见图1)，并以基因组dna为模板，利用上述引物和程序进行pcr扩增并测序验证，结果显示该indel位点成功在16份玉米自交系进行长度多态性检测(见图2)。

本发明还提供了一种检测玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率相关基因grmzm2g022133的试剂盒，其含有seqidno.3和seqidno.4所示的引物对。

本发明利用全基因组关联分析和qtl定位相结合的策略，揭示了该基因与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率之间的内在联系，发掘其中显著的功能位点，并作为遗传标记应用于玉米分子育种，对加快玉米转基因育种进程具有重要意义。

本发明的有益效果在于：结合全基因组关联分析和qtl定位策略，快速精确地检测到与特定性状显著关联的snp或indel位点。玉米第6号染色体1647888954bp位置的indel位点(maizeb73refgen_v3chr6:1647888954bp)与幼胚胚性愈伤组织诱导率显著相关，解释表型变异分别为6.19％。该indel位点能够作为遗传标记，用于分子育种，提高玉米幼胚胚性愈伤组织诱导能力，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为8份关联群体自交系(027、141、155、208、333、336、339、356)和8份连锁群体自交系(003、009、062、097、144、182、270、327)的幼胚胚性愈伤组织诱导率。其中003、027、097、141、155、182、208、270表现出较高的诱导率，而009、062、144、327、333、336、339、356的诱导率几乎为0。

图2为上述8份关联群体自交系和8份连锁群体自交系pcr扩增indel位点的测序结果。其中方框标识出高胚性愈伤组织诱导率自交系的位点基因型为7bp的插入，而对应低胚性愈伤组织诱导率自交系的位点基因型为7bp的缺失。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用试剂如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

实施例1.玉米基因grmzm2g022133与幼胚胚性愈伤组织诱导率显著相关的一个indel分子标记的获得。

方法如下：

1)收集301份来自中国、美国、墨西哥的玉米自交系，构建了作图所用的关联群体。该群体有着丰富的遗传多样性，包含121个温带玉米自交系和180个热带/亚热带玉米自交系。

2)关联群体表型鉴定。分别于2015年和2016年在四川农业大学西双版纳基地和崇州基地对获得的301份玉米自交系进行田间种植，设置单行区，每行7穴，每穴2株，54000株/hm2，3次重复。以套袋自交种子用作幼胚培养的试验材料，授粉12-15天左右，每个dh系取自交果穗3个(即3次重复)，每个果穗接种3个培养皿(即每个重复3个观察值)，每个培养皿36个幼胚，幼胚大小控制在1.0-1.5cm。用含2mg/l2,4-d的n6诱导培养基，27℃暗培养30天后，调查胚性愈伤组织的诱导率(出现胚性愈伤组织幼胚数占接种幼胚数的百分率)。经统计后发现其中胚性愈伤组织诱导率在40％～80％的材料有3个，30％～40％的材料有3个，20％～30％的材料有12个，10％～20％的材料有25个，0％～10％的材料有69个，0％的材料有188个。方差分析表明，胚性愈伤组织诱导率在不同自交系间差异达极显著水平(表1)。

表1玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率的方差分析

表1中**表示在0.01水平下显著。

3)全基因组关联分析。结合步骤2中玉米自交系幼胚胚性愈伤组织诱导率的表型数据和高密度snp分子标记，分别利用tessel5.0的一般线性模型(glm)和混合线性模型(mlm)进行关联分析，等位基因频率阈值设为0.05，在p<0.0001水平上，判定snp标记与性状关联的显著性。结果检测到一个indel位点与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率显著相关，该indel标记位于玉米第6号染色体1647888954bp的位置，等位基因为7bp的插入/缺失，所述7bp的序列如seqidno.1所示，该等位基因的侧翼序列如seqidno.2所示。glm模型的检测p值分别为0.0273，可解释的表型变异分别为5.46％，mlm模型的检测p值分别为0.0534，可解释的表型变异分别为6.19％。两个不同模型的相互验证，避免了在0.01水平该位点关联结果的假阳性可能，进一步证实了结果的真实可靠性。

4)qtl定位验证。利用已构建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群体的239个家系为连锁群体，田间种植和表型鉴定方法同步骤2，再结合6618个binmarker基因型数据，进行qtl定位。在第6染色体上检测到9个与高胚性愈伤诱导率有关qtl位点，表型贡献率在6.1074～9.6101％之间，位于区段chr06.1641.5～chr06.1653.5，对应染色体上的物理位置是164.100mb～165.300mb(maizeb73refgen_v3)。步骤3中检测到的indel分子标记落在qtl定位的区段里，进一步验证了上述indel分子标记与玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率的重要性。

实施例2.本发明的indel标记在玉米幼胚胚性愈伤组织诱导率上的应用试验。

在关联群体和连锁群体里各挑选8份玉米自交系，测定其幼胚胚性愈伤组织诱导率(见图1)，并以基因组dna为模板，利用indel分子标记位点侧翼序列(seqidno.2)设计特异性引物，引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示，采用kodfxneo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行pcr扩增，程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35个循环；68℃再延伸10min。将特异性的目标条带用胶回收试剂盒(omegabio-tek)回收纯化，连接平末端克隆载体peasy-bluntcloningvector(北京全式金生物技术有限公司)测序。利用snapgene2.3.2软件对测序结果进行比对(见图2)。结果显示indel位点成功在16份玉米自交系进行长度多态性检测，其中8份高胚性愈伤组织诱导率自交系在上述indel位点基因型全为7bp插入，8份低胚性愈伤组织诱导率自交系位点基因型全为7bp缺失。本试验进一步证明本发明中全基因组关联分析和qtl定位检测结果的准确性。

因此，7bp插入的等位基因型被视作优异/增效等位基因。本发明进一步证实上述indel位点能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，提高玉米幼胚胚性愈伤组织诱导能力。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>四川农业大学

<120>玉米胚性愈伤组织诱导相关基因grmzm2g023133的indel分子标记及应用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7

<212>dna

<213>zeamaysl.

<400>1

gaggtaa7

<210>2

<211>65

<212>dna

<213>zeamaysl.

<220>

<221>indel分子标记位点侧翼序列

<222>(30)..(30)

<223>n=gaggtaa/缺失

<400>2

ctacaagatggctcggccattggaggtaancttccgtgccccgtacgtccaactttactg60

gaaca65

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

caagatggctcggccattgga21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agtaaagttggacgtacggggc22