一种监控荧光定量PCR反应污染的方法与流程

本发明涉及荧光定量PCR反应的领域。具体地，本发明涉及一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，本发明也涉及一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用。

背景技术：

荧光定量PCR作为一种常用的技术手段，已经广泛应用到各种检测领域。但是在进行荧光定量PCR反应时，常常出现PCR污染，尤其是PCR气溶胶污染，并且往往难以判断污染源，给科研工作带来了相当大的困扰。

特别地，基于荧光定量PCR的基因分型是现代个体化用药常用的技术手段，与传染病病原体检测不同的是，病原体检测往往关注的是待检标本里面是否存在某种病原体以及存在数量的差异，而个体基因分型不同，待检标本里面已经非常明确基因组DNA的存在，检测结果不是这个基因型就是那个基因型的问题，即非“左”即“右”的问题，这种情况下，一旦出现扩增产物气溶胶污染往往很难鉴别，导致在检测结果上出现误判。而目前作为一种成熟的检测方法，往往需要设立比较好的阳性对照和阴性对照来确认检测结果的可靠性，基因分型方法目前常用的阳性对照包括基因组DNA和质粒，其中基因组DNA来源以及规模化生产比较困难，而质粒因为制备简单而广泛使用，但带来的问题是不可避免的出现气溶胶污染的问题。

综上所述，如何监控PCR气溶胶污染，特别地在基因分型方法中如何监控PCR气溶胶污染，是一个非常重要的环节。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，以及提供一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用，以准确地确定污染的来源。

为此，本发明提供了一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，其包括下列步骤：

a.制备阳性对照质粒，该阳性对照质粒上包含待检目的基因和外参基因，该待检目的基因和外参基因不同源或同源性低至两者的相应引物不会错配；

b.制备PCR反应混合物，其包含：目的基因的引物和荧光探针；内参基因的引物和荧光探针；外参基因的引物和荧光探针；所述各个荧光探针具有不同的荧光基团；

c.在待检样品管的PCR反应混合物中加入待检样品DNA模板，在阳性对照管的PCR反应混合物中加入阳性对照质粒DNA模板，进行PCR扩增；

d.所有检测管中扩增的目的基因应全部为阳性，否则确定扩增失败；

e.待检样品管中扩增的内参基因应全部为阳性，否则确定扩增失败；

f.待检样品管中扩增的外参基因应全部为阴性，否则确定待检样品被阳性对照质粒气溶胶污染；

g.阳性对照管中扩增的内参基因应全部为阴性，否则确定被PCR产物气溶胶污染；

h.阳性对照管中扩增的外参基因应全部为阳性，否则确定扩增失败。

进一步地，本发明的监控荧光定量PCR反应污染的方法，还包括步骤i.在阴性对照管中加入PCR反应混合物和无菌纯净水，阴性对照管中扩增的全部基因应全部为阴性,如果阴性对照管中出现外参基因阳性信号，确定为阳性对照质粒气溶胶污染；在外参基因是阴性条件下其它通道出现阳性信号，则确定为PCR产物气溶胶污染。

进一步地，本发明提供了一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用，该阳性对照质粒包含待检目的基因和外参基因，该待检目的基因和外参基因不同源或同源性低至两者的相应引物不会错配。

优选地，本发明中待检目的基因是人源的，该外参基因是植物来源的，例如，玉米16S RNA基因。该待检目的基因是同一SNP位点的不同基因型，例如，人线粒体乙醛脱氢酶ALDH2基因。

本发明中所述的荧光探针可以是本领域可以商购合成的任何荧光探针，例如MGB探针、BHQ2、TaqMan、AllGlo和LNA荧光探针，并且不限于此。

本发明采用双参照质控体系，内参基因用于监测反应体系可能存在的抑制因素，包括PCR产物气溶胶污染，外参基因用于监控阳性对照质粒的气溶胶污染。

通过本发明的上述技术方案，可以得知每一个待检样品是否被阳性对照质粒污染，同时因为阳性对照质粒的对照孔没有内参品序列，因此通过对于阳性对照质粒样品的检测，可以判定是否被PCR产物气溶胶污染。

此方案与传统方案的优势在于，以往传统方案通过设立阴性对照孔监控污染，只能通过阴性对照孔是否出现信号判断是否出现污染，至于这种污染的来源是PCR产物气溶胶还是阳性对照质粒则无法判明，而本方案不仅可以区分是PCR产物气溶胶污染还是阳性对照质粒污染，而且如果是阳性对照质粒出现污染，还能判定具体是哪个样品出现污染，这种优势是通过传统的阴性对照方法无法实现的。

下面将结合附图和具体实施方式对发明进行详细说明，如无特别说明，本发明中所涉及的实验方法和步骤均为常规实验方法和步骤，所涉及的试剂均为可以商购得到。

附图说明

图1是一个待检样品的ALDH2 1510GG型样本扩增结果图。

图2是另一个待检样品的ALDH2 1510GA型样本扩增结果图。

图3是另一个待检样品的ALDH2 1510AA型样本扩增结果图。

图4是图1至图3待检样品的阳性对照质粒的扩增结果图。

图5是另一个待检样品的ALDH2 1510GG型样本扩增结果图，表明被阳性对照质粒气溶胶污染。

具体实施方式

硝酸甘油是心绞痛发作的首选治疗药物，但其临床有效性因人而异。大量的精准医学数据证明，人线粒体乙醛脱氢酶的活性高低与硝酸甘油在体内的疗效密切相关。人线粒体乙醛脱氢酶ALDH2基因具有遗传多态性，其中与亚洲人群最为密切的是ALDH2基因的c.1510位核苷酸存在G/A多态性，多态性位点为A时(被称为ALDH2*2型)，其编码的多肽链第504位氨基酸Glu被Lys取代，引起酶失活。ALDH2*2型基因携带者硝酸甘油代谢速率大大降低，从而无法产生一氧化氮，难以发挥药效。通过检测人ALDH2基因多态性可指导硝酸甘油合理用药。研究发现，突变型基因ALDH2*2的存在能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌症等疾病之间存在密切联系。

实施例1：构建阳性对照质粒和提取质粒：

通过PCR引物和定点突变方法，将ALDH2基因1510G>A位点附近上下游232bp和玉米16S RNA基因上的核苷酸片段插入到pMD18T载体中，这些片段在载体上的排列顺序如下：

含ALDH2基因型AA序列(长度232bp)----玉米16S RNA基因(长度173bp)----含ALDH2基因型GG序列(长度232bp)。

按照分子克隆的常规技术，将该阳性对照质粒转化到DH5α的大肠杆菌，用LB培养基培养大肠杆菌，用商购试剂盒进行该质粒的提取，作为阳性对照质粒的DNA模板。

实施例2：合成引物：

阳性对照质粒上的ALDH2基因如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。阳性对照质粒上的玉米16S RNA基因如SEQ ID NO.3所示。

用于ALDH2SNP位点基因分型的引物和探针ALDH2-F(SEQ ID NO.4)、ALDH2-R(SEQ ID NO.5)、ALDH2-P1(SEQ ID NO.6，荧光基团FAM-MGB)、ALDH2-P2(SEQ ID NO.7，荧光基团HEX-MGB)。

用于内参基因RNase P基因的引物和探针RnaseP-F(SEQ ID NO.8)、RnaseP-R(SEQ ID NO.9)、RnaseP-P(SEQ ID NO.10，荧光基团ROX-BHQ2)。

用于外参基因16S RNA基因的引物和探针16S-F(SEQ ID NO.11)、16S-R(SEQ ID NO.12)、16S-P(SEQ ID NO.13，荧光基团：TAMRA-BHQ2)。

上述质粒构建及引物合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。DNA提取试剂盒也购自该公司。

实施例3：反应体系的建立：

本发明采用双参照质控体系，内参基因用于监测反应体系可能存在的抑制因素，包括PCR产物气溶胶污染，外参基因用于监控阳性对照质粒造成的PCR气溶胶污染。外参基因与目的基因无同源性，双参照探针选择的是与目的基因探针没有冲突的另两个检测通道。

另外，本实施例也设了阴性对照，也可以不设阴性对照，此为可选步骤。

待测样本核酸提取采用本公司基于离心柱方法的核酸提取试剂，从全血标本中进行DNA提取，具体操作步骤如下。

1、取200μl全血标本，加入到一1.5ml离心管中。

2、加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

3、加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。(如溶液未彻底清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般56℃放置时会消失，不会影响后续实验。如果溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。当血液体积小于200μl且没有采取红细胞裂解处理，或是样本储存条件不佳，水浴后颜色可能变为深褐色，注意溶液中不应该有团块沉淀。

4、加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5、将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中废液。

9、向吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10、将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2—5min，12000rpm(13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括：UDG酶及dUTP，用于消除PCR产物造成的污染。

本扩增体系如下：

其中2×PCR反应液采用商业化DNA Mix，包含UNG防污染体系。

阴性对照管，也加入上述PCR反应混合物，但是以无菌水替代模板DNA。

体系配置完成后在ABI 7500上进行PCR扩增，PCR反应的反应条件设置为：37℃，5min；95℃，5min；然后，95℃，1,5s，60℃，35s(荧光收集)，40个循环；25℃，1min。

反应结束后，根据荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值，手动调整基线(Non-adaptive baseline)的起始点(Start)一般设定为5～8，终止点(Stop)一般设定为12～15，阈值线通常刚好高过阴性扩增曲线。设定之后，可以得到各待检样品的Ct值。

检测结果的判断

依据下列判断检测结果：

实验结果如图1至图5所示。其中图1至图4表示3个待检样品无气溶胶污染的扩增结果。而图5则表示1个待检样品受到了阳性对照质粒气溶胶污染。

上述仅仅是示例性的说明，本发明不限于基因分型的PCR污染监控，可以用于任何多重PCR检测的污染监控。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京海斯凯生物科技有限公司

<120> 一种监控荧光定量PCR反应污染的方法

<130> CNC1F170037443

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 阳性对照质粒上待检目的基因

<400> 1

atctcgtttc aaattacagg gtcaactgct atgatgtgtt tggagcccag tcaccctttg 60

gtggctacaa gatgtcgggg agtggccggg agttgggcga gtacgggctg caggcataca 120

ctaaagtgaa aactgtgagt gtgggacctg ctgggggctc agggcctgtt ggggcttgag 180

ggtctgctgg tggctcggag cctgctgggg gattggggtc tgttgggggc tc 232

<210> 2

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 阳性对照质粒上待检目的基因

<400> 2

atctcgtttc aaattacagg gtcaactgct atgatgtgtt tggagcccag tcaccctttg 60

gtggctacaa gatgtcgggg agtggccggg agttgggcga gtacgggctg caggcataca 120

ctgaagtgaa aactgtgagt gtgggacctg ctgggggctc agggcctgtt ggggcttgag 180

ggtctgctgg tggctcggag cctgctgggg gattggggtc tgttgggggc tc 232

<210> 3

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 阳性对照质粒上外参基因

<400> 3

ttggcggcgg aggaagactc ggcatgaagg ccagccgccc ggtggtgtgg tacgtagtgg 60

taatagtacg cgccccgctc cgaaacaaag aaaaaggtgc gtgccgcact cacgagggac 120

tgccagtgag atactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tccgcatggc cct 173

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因正向引物

<400> 4

ggagtggccg ggagttg 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因反向引物

<400> 5

gcaggtccca cactcacagt t 21

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因探针

<400> 6

aggcatacac tgaagt 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因探针

<400> 7

aggcatacac taaagtg 17

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 内参基因正向引物

<400> 8

gaggcaggag aatggtgtga a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 内参基因反向引物

<400> 9

gctctgtcat ccaggttgca 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 内参基因探针

<400> 10

cttgcagtga gccaagattg cacca 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外参基因正向引物

<400> 11

ccggtggtgt ggtacgtagt g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外参基因反向引物

<400> 12

ggcacgcacc tttttctttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外参基因探针

<400> 13

tagtacgcgc cccgctccga 20