本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记及其应用。
背景技术：
脂肪组织在机体能量储存、糖类代谢和脂肪酸代谢中扮演十分重要的角色。脂联素（adiponectin，adipoq）是一种脂肪细胞家族因子中的脂肪因子，其主要在白色脂肪组织表达，但在其它组织中也能检测到该脂肪因子，如：棕色脂肪组织、骨髓、肝脏和骨骼肌。脂联素主要通过与脂联素受体（adipor）协同调节其特殊的生理功能，对动物机体的脂肪酸氧化、糖类摄取及胰岛素的分泌调节具有重要的作用。
adipoq基因首先在人类3号染色体中发现，全长与17kbp，包含3个外显子和2个内含子，其中，第1外显子，部分第2外显子和第5外显子不参与编码氨基酸，属于utr区，adipoq基因cds区共编码247个氨基酸。
adipoq基因遗传变异具有独特的生物学功能。研究表明，adipoq基因遗传变异与猪背脂肪厚度、背最长肌脂肪酸链长度，胴体性状及肉质等性状相关；与牛的背膘厚、眼肌面积、大理石花纹和肉质等级具有一定关联性。
目前，adipoq基因作为一种与脂肪生长相关的候选基因在国内外广泛研究，并在动物分子遗传育种标记方面加以应用。绵羊胴体肌肉性状相关基因分子标记选种技术基于pcr-sscp技术对待测绵羊的adipoq基因启动子区进行多态性分析，然后根据检测结果判定携带不同等位基因的胴体肌肉性状的优良，从而有效提高绵羊胴体肌肉性能的评估，加快绵羊的改良进程、提高绵羊的个体经济效益。
技术实现要素：
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种绵羊胴体肌肉性状相关基因adipoq的pcr-sscp检测试剂盒。该试剂盒快速、特异性高、敏感性强、成本低廉，用于绵羊胴体肌肉性状相关基因分子选种技术。
本发明提供与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记，其位于adipoq基因上，具体的核苷酸序列为序列表中seqidno.1；
在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，当等位基因为a时，绵羊胴体肌肉性状差，当等位基因为b时，绵羊胴体肌肉性状优；
所述等位基因a为：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第82bp处的碱基为a，第122bp处的碱基为c，第123bp处的碱基为g，第269bp处的碱基为g，第273bp处的碱基为a，第281bp处的碱基为c，第282bp处的碱基为a；
所述等位基因b为：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第82bp处的碱基为g，第122bp处的碱基为c，第123bp处的碱基为t，第269bp处的碱基为g，第273bp处的碱基为g，第281bp处的碱基为t，第282bp处的碱基为g。
本发明还提供用于检测上述与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：
adipoq-f：5’-ttcctgcttctgatcttgacc-3’；
adipoq-r：5’-cagcctagaaattgaatcagtc-3’。
本发明还提供上述与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记在鉴定绵羊胴体肌肉性状中的应用，所述应用包括以下步骤：
（1）提取待测绵羊的基因组dna；
（2）以待测绵羊的基因组dna为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行pcr扩增；
（3）检测pcr扩增产物，如果扩增序列的开放阅读框区中，等位基因为a，绵羊胴体肌肉性状差；等位基因为b，绵羊胴体肌肉性状优。
作为优选，步骤（2）中，所述pcr反应使用的扩增体系以20μl计为：10×buffer缓冲液2μl，5×q溶液2μl，3μmmgcl21.2μl，150μmdntps1.2μl，0.25μm上下游混合引物1μl，0.5utaq聚合酶0.1μl，一个用于承载待测样本dna或阳性对照的的1.2mm滤纸小圆盘和12.5μl的ddh2o。
作为优选，步骤（2）中，所述pcr反应的条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30s，72℃延伸30秒，共37个循环，最后延伸5分钟。
作为优选，步骤（3）中，所述检测pcr扩增产物是采用sscp检测，同时设置等位基因标准dna样本，凝胶电泳后染色，得到sscp电泳带型图，根据图谱中条带的类型和等位基因标准dna样本结果对待测样本的绵羊胴体肌肉性状进行判断。
作为优选，所述等位基因标准dna样本的核苷酸序列为序列表中seqidno.1和序列表中seqidno.2。
本发明还提供含有上述引物对的用于检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒。
作为优选，所述试剂盒还包括等位基因标准dna样本，所述等位基因标准dna样本的核苷酸序列为序列表中seqidno.1和序列表中seqidno.2。
本发明还提供上述与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明通过pcr-sscp对绵羊adipoq基因启动子进行遗传信息分析，克隆、测定群体内个体基因序列变异产生的各等位基因序列，结合相关胴体肌肉生产性能，确定与之相关的等位基因，为有效提高绵羊胴体肌肉生产性能提供指导。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为4种标准等位基因dna样本sscp带型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1、试验材料
本发明绵羊样品459份，均采自新西兰罗姆尼羊群体，收集具有胴体肌肉性状指标（热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量、总瘦肉量、后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比例）的dna血样，采用naoh两步法提取绵羊基因组dna。
2、引物设计和pcr扩增
根据genbank公布的adipoq基因参考序列（登录号nc—019458.1），应用primer5.0在线设计特异性引物，对绵羊adipoq基因启动子区进行扩增。引物序列为：
adipoq-f：5’-ttcctgcttctgatcttgacc-3’；
adipoq-r：5’-cagcctagaaattgaatcagtc-3’。
pcr反应体系为：
总体积20μl，10×buffer缓冲液2μl，5×q溶液2μl，3μmmgcl21.2μl，150μmdntps1.2μl，0.25μm上下游混合引物1μl，0.5utaq聚合酶0.1μl，一个用于承载待测样本dna或阳性对照的的1.2mm滤纸小圆盘和12.5μl的ddh2o。
pcr扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30s，72℃延伸30秒，共37个循环，最后延伸5分钟，得到约372bp大小的pcr产物。
3、pcr产物的sscp检测
为保证检测样本等位基因结果的准确性，将等位基因标准dna样本与待测样本同时进行sscp电泳，参照标准等位基因dna样本（adipoq*a、adipoq*b、adipoq*c和adipoq*d）判定待测样本等位基因类型，4种标准等位基因dna样本sscp带型如图1所示。4种标准等位基因的核苷酸序列分别为：
adipoq*a的标准dna样的核苷酸序列为：
adipoq*b的标准dna样的核苷酸序列为：
对绵羊胴体肌肉生产性能无影响的adipoq*c核苷酸序列为：
对绵羊胴体肌肉生产性能无影响的adipoq*d核苷酸序列为：
其中，等位基因见表1。
表1罗姆尼羊adipoq等位基因碱基突变
sscp电泳方法为：
在20μl的pcr工作产物中加入100μlsscp上样变性缓冲液（98%去离子甲酰胺、10mmedta、0.025%溴酚蓝和0.025%二甲苯青）。105℃热变性5分钟后立即置于冰水混合物中，然后将10μl变性产物上样于16×18cm的14%非变性聚丙烯酰胺凝胶（arc：bis=37.5:1）中，在300v电压，0.5倍tbe，17℃电泳槽中电泳19h。银染显色后判型、拍照并干燥保存。
4、克隆、测序判定等位基因序列
根据sscp检测结果，选取不同基因型的个体利用纯化试剂盒纯化后测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子中的pcr产物，进行克隆纯化后送华大生物公司进行测序。测定结果通过megalign软件与等位基因标准dna核苷酸序列（adipoq*a、adipoq*b、adipoq*c和adipoq*d）进行比对。
5、数据分析
应用mintab（version16）一般线性混合效应模型（generallinermixed-effectmodels，glmms）评估特定等位基因的存在/缺失胴体肉质性状存在影响。
对某一特定基因性状进行存在（1）缺失（0）分析模型中，等位基因、家系影响、性别、出生等级为固定因素，遵从下列模型进行最小二乘方差分析：
yijknm=μ+gi+cj+mk+fm+xn+eijknm
其中，y为相应性状，μ为群体均值，gi为家系效应，cj为性别效应，mk为出生等级效应，fm等位基因效应，xn为因素间互作效应，eijknm为随机误差。
6、罗姆尼羊adipoq基因启动子区各等位基因与胴体肌肉性状相关性分析
在adipoq基因启动子区上鉴定出4条等位基因链（a、b、c和d），但是等位基因c和d在新西兰罗姆尼羊中的被检出率很小，频率小于5%，建议淘汰。因此，只对等位基因a和b对绵羊胴体肌肉性状进行了分析。
结果表明，对屠宰的459个绵羊样本进行变异与胴体性状分析表明，等位基因a与热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量均有一定的相关性（p值分别为：0.036、0.001、0.006和0.001；见表2）；等位基因b与后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比有一定相关性（p值分别为：0.039、0.017和0.020；见表2）；多因素矫正以上结果亦均有显著相关性（p<0.05）。其它胴体肌肉性状与这2个等位基因均没有显著相关性。
等位基因存在与缺失结果表明，存在等位基因a的群体具有较低的热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量；存在等位基因b的群体具有较高的后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和较低的肩部瘦肉比例（见表2）。
根据上述分析鉴定结果，实际生产中若需要较高的热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量生产性能，建议淘汰含有等位基因a的个体；同时存在等位基因b的个体具有较高的后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和较低的肩部瘦肉比例，所以，等位基因b同样可参考作为绵羊胴体肌肉性能的基因标记。因此认为淘汰只携带等位基因a的个体可改善绵羊后代群体的胴体肌肉生产性能。
表2adipoq基因启动子变异体对罗姆尼绵羊胴体肌肉性状的影响
注：粗体表示相关性显著（p<0.05），斜体表示有影响趋势（0.05<p<0.2）；
实施例2
本发明的与绵羊胴体肌肉性状相关的pcr-sscr试剂盒包括：
1、引物对
adipoq-f：5’-ttcctgcttctgatcttgacc-3’；
adipoq-r：5’-cagcctagaaattgaatcagtc-3’。
2、pcr反应体系
20μlpcr反应体系为：10×buffer缓冲液2μl，5×q溶液2μl，3μmmgcl21.2μl，150μmdntps1.2μl，0.25μm上下游混合引物1μl，0.5utaq聚合酶0.1μl，一个用于承载待测样本dna或阳性对照的的1.2mm滤纸小圆盘和12.5μl的ddh2o。
3、阳性对照
标准等位基因dna样本：adipoq*a、adipoq*b、adipoq*c和adipoq*d。
4、sscp上样变性缓冲液
该试剂盒的使用方法参照实施例1。
将待测样本的sscp电泳带型图与阳性对照进行对比，对待测样本的绵羊胴体肌肉性状进行判断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>铜仁学院
<120>与绵羊胴体肌肉性状相关的遗传标记及其应用
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>372
<212>dna
<213>绵羊adipoq的等位基因a
<400>1
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ccacactgaccgaagtctgtggctctgattccacacctgagggtaaggatgactgattca360
atttctaggctg372
<210>2
<211>372
<212>dna
<213>绵羊adipoq的等位基因b
<400>2
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<210>3
<211>372
<212>dna
<213>绵羊adipoq的等位基因c
<400>3
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<210>4
<211>372
<212>dna
<213>绵羊adipoq的等位基因d
<400>4
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