0.37g;甲醇：200ml。
[0093] 3)碱性磷酸酶缓冲液 100ml : IOOmM NaCl ;5mM MgCl2 ; IOOmM Tris-Cl ρΗ9· 5。
[0094] 4) PBS-TlL ρΗ7· 5 :1Μ 磷酸二氢钠 31. 6ml ;1Μ 磷酸氢二钠 68. 4mlTween 20 0· l%lml ;水 900ml ;调 pH 后定容 1L。
[0095] 5)TBS-T IL ρΗ7· 6 :Tris 2. 42g ;NaCl 8g ;Tween 20 Iml ;水 900ml ;调 pH后定容 IL0
[0096] 6)封闭液100ml :100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉。
[0097] 7)抗稀释液 100ml :100ml PBS-T 内加入 0· 25 克 BSA。
[0098] Western blot实验以tubulin蛋白为内参，其一抗为Tubulin单克隆抗体（鼠源， Sigma 公司，货号：T6793);二抗为鼠抗 anti-mouse (Promega 公司，货号：0000089661 )。
[0099] 实验结果如图2所示，0sAG018蛋白在对照组水稻（未被水稻条纹病毒侵染的野 生型水稻品种日本晴）中含量较低，但在被水稻条纹病毒（RSV)侵染发病的野生型水稻 (Oryza. sativa L.)品种日本晴中可以观察到0sAG018蛋白的含量较高，说明0sAG018蛋白 也能在水稻条纹病毒（RSV)侵染的条件下富集。
[0100] 实施例2、0SAG018基因参与水稻抗RSV防御反应
[0101] 一、ago 18水稻突变体纯合子的获得
[0102] agol8突变体种子（NF6013)在Tosl7数据库中购买
[0103] (https://tos. nias. affrc. go. jp/ ?miyao/pub/tosl7/)〇
[0104] T-DNA插入序列为：
[0105] tosl7_tail6(LB) :5, -AGGTTGCAAGTTAGTTAAGA-3，。
[0106] 插入位点如图3中B所示。
[0107] 利用数据库中提供的方法鉴定ag〇18突变体的纯合子
[0108] (https://pc7080. abr. affrc. go. jp/cgibin/tosl7/ricegenome. cgi?action=ge tTarget&chr=7&pos=16895280&primer=y&version=7)〇
[0109] 以上述鉴定得到的水稻agol8突变体（NF6013)纯合子的cDNA为模板，以6013_ LP/6013_RP 引物对、tosl7_tail6(LB)/6013_RP 引物对、0sAG018-F/0sAG018-R 引物对，分 别进行半定量RT-PCR反应。同时设置野生型水稻（Oryza.sativa L.)品种日本晴作为对 照。
[0110] 引物序列如下：
[0111] 6013_LP : 5，-GATCGAGGGAACTCGACAAG-3，；
[0112] 6013_RP : 5，-CAAGATCAACTCCACGCAAA-3，。
[0113] tosl7_tail6 (LB)、0sAG018_F 和 0sAG018_R 序列见上文。
[0114] 以Actin为内参，引物如下：
[0115] Actin-RT-F :5' -CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3' ；
[0116] Actin-RT-R : 5，-GAGAAACAAGCAGGAGGACGG-3，。
[0117] 结果如图3中A所示，由图可见水稻agol8突变体（NF6013)纯合子仅采用引物 对tos 17_tai 16 (LB) /6013_RP可以扩增相应的目的条带，而采用6013_LP/6013_RP引物对 和0sAG018-F/0sAG018-R引物对均未扩增出相应的目的条带。而作为对照的野生型水稻 (Oryza. sativa L.)品种日本晴采用 6013_LP/6013_RP 引物对和 0sAG018-F/0sAG018-R 引 物对均扩增出相应的目的条带，但采用tosl7_tail6(LB)/6013_RP引物对未扩增出相应的 目的条带。与预期结果一致。
[0118] 二、0sAG018基因参与水稻抗RSV防御反应
[0119] URSV侵染ag〇18突变体水稻后，水稻发病率提高，症状加重
[0120] 以带RSV病毒的灰飞風侵染同时期(分蘖期）的野生型水稻（Oryza. sativa L.)品 种日本晴、水稻（Oryza. sativa L.)品种武育粳3号、水稻（Oryza. sativa L.)品种镇稻88 和步骤一获得的ag〇18突变体纯合子(实验组)。以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。
[0121] 2周后检测水稻发病情况(水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控 制》一书中第一章)，分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病 后的表型在不同的实验组之间的区别。
[0122] 实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表1所示。可见，RSV病毒侵染ag〇18 突变体以及易感水稻品种武育粳3号后，水稻发病率较高；而RSV病毒侵染抗感水稻品种镇 稻88后，水稻发病率较低。与预期结果一致。进一步，各水稻品系接种RSV病毒后的病症 图如图4所示，RSV侵染ag 〇18突变体后，心叶退绿条带较野生型明显增多。
[0123] 表I RSV侵染各水稻品系后发病率统计
[0124]
【主权项】
1. 蛋白质在如下al)或a2)中的应用： al)调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性； a2)选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种； 所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的氨基 酸序列组成。
2. 蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下al)或a2)中的应用： al)调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性； a2)选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种； 所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的氨基 酸序列组成。
3. 培育对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤： a) 向目的植物中导入由序列表中序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编 码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； b) 从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻条纹叶枯病抗性增强 的转基因植物。
4. 根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白 质的编码基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子： 1) 序列表中序列1所不的DNA分子； 2) 序列表中序列3所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 4) 与1)-3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白 质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因 转录的启动子为Actin启动子。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物 或双子叶植物。
8. 根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。
9. 根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。
10. 根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述水稻条纹叶枯病的 病原菌为水稻条纹病毒。
【专利摘要】本发明公开了OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用。本发明提供了OsAGO18基因或其编码蛋白或含有所述编码基因的重组载体在调控植物抗水稻条纹叶枯病中的应用；所述基因OsAGO18蛋白的氨基酸序列具体为序列表中的序列2。实验证明，在OsAGO18基因过表达的水稻中植物抗病性增强，相反，ago18突变体的抗病性减弱，表明该基因编码的OsAGO18蛋白在水稻抗水稻条纹叶枯病反应中发挥着重要的作用。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-82
【公开号】CN104561085
【申请号】CN201410068747
【发明人】李毅, 戚益军, 吴建国, 杨志蕊, 郑立佳, 魏春红
【申请人】北京大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年2月27日