用Kpnl和Hindlll双酶切 pMD18-T_Double- a -actinl70_ a -actin_262bp和pGL3_Basic，回收大小约为602bp的 Double- a -actinl70序列和pGL3_Basic载体大片段，并将二者连接，构建pGL3_Double- a -actinl70-a -actin262重组质粒，Kpnl和Hindlll双酶切鉴定阳性重组质粒。
[0010] 5. pGL3-Double-a -actinl70-a -actin262表达载体进行牛骨胳肌卫星 细胞和牛成纤维细胞的转染实验和双荧光素酶报告系统的检测，以测定改造后的 Double- a -actinl70_ a -actin262启动子片段的启动子活性及其肌肉特异性。牛骨胳肌卫 星细胞和牛成纤维细胞培养。当培养细胞的生长密度到达80% -90%左右时，弃去培养液， 用无钙镁离子的PBS冲洗三遍，加入0. 5mL的0. 25%胰蛋白酶消化，37C放置l-2min。显 微镜下80%细胞变圆时，加入5. 5mL含DMEM细胞培养液+15%标准胎牛血清的细胞生长培 养液终止消化，按1 : 2比例进行传代。细胞转染：转染质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提 取。质粒转染试剂为聚乙烯亚胺（PEI)。转染前24h将细胞以4-8X105cells/well的密度 铺与12孔板内。待细胞完全贴壁生长至80%~90%融合时，按照PEI转染操作步骤将不 同表达载体和海肾基因内参质粒phRL-TK以50 : 1(质量比）的比例分别共转染牛骨胳肌 卫星细胞和牛成纤维细胞，pGL3-Basic空载体和phRL-TK以同样的条件作为阴性对照组共 转染细胞，转染4h后，换成分化培养液（2 %马血清+98 % DMEM细胞培养液），转染72h后收 集细胞。双荧光素酶报告基因检测，是采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega)来 测定报告基因的表达水平。实验步骤如下：弃去12孔板中的细胞培养液，用PBS洗涤细胞 2次，加入200ul细胞裂解液（1 XPLB)，室温放置15min后，收集细胞裂解液。取20ul细胞 裂解液至荧光测定管中，加入l〇〇ul检测试剂（firefly luciferase，LARII)，混匀后用化 学发光仪（FB 12Luminometer)测定发光值，记录10s时的值，最后加入100ul的Stop&GLO 试剂，测定作为内标的Renilla荧光素酶发光值，同时检测10s时的值，两者比值即为荧光 素酶的相对活性RLA (Relative Luciferase Activity)。RLA的数值为3次重复实验结果 平均值土标准差。具体操作步骤参见Promega检测试剂盒说明书。
[0011] 6.Double_a -actinl70_a -actin262启动子片段的启动子活性及其肌肉特异性 检测：采用pGL3-basic，pGL3-a -actin262，pGL3-CMV作为对照，对pGL3-Double-a -actin 170-a -actin262表达载体中Double-a -actinl70_ a -actin262的启动子活性进行检测。 pGL3_basic，pGL3_a -actin262，pGL3_CMV和pGL3_Double-a -actinl70_a -actin262这 4种表达载体分别进行牛骨胳肌卫星细胞和牛成纤维细胞的转染，72小时后收集细胞并检 测各自的启动子活性并经内对照海肾荧光素酶校正。检测结果表明pGL3-D〇uble-a-actin 170- a -actin262在牛骨胳肌卫星细胞中具有较高的启动活性，能够超过pGL3-CMV的启动 活性，且pGL3_Double_ a -actinl70_ a -actin262在成纤维细胞中的活性较低，证明其较 好的骨胳肌特异性。
[0012] 本发明的有益效果为：本发明构建了一个新的a-actin基因的启动子片段，即 170bp-170bp_262bp，所得到的a -actin基因的启动子片段具有较强的启动活性和骨胳肌 特异性，同时，该启动子片段在牛骨胳肌卫星细胞中能够显著提高a -actin基因的表达活 性，能够应用于提高肌肉产量的转基因肉牛生产。
【附图说明】
[0013]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0014]图1为一个牛a -actin基因的启动子的启动子核酸序列（Seq IDNo:1)。
[0015]图2为一个牛a-actin基因的启动子的Double-a-actinl70_ a-actin_262bp 启动子片段的启动子活性及其肌肉特异性检测结果图。图中1.牛骨骼肌卫星细胞，2.牛成 纤维细胞，3.荧光素酶的相对活性，4. pGL3-basic，5. pGL3- a -actin262,6. pGL3-CMV，7. pG L3-Double_a -actinl70_a -actin262.
[0016] 图3为一个牛a -actin基因的启动子的表达载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0017]在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域 技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法 或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
[0018]实施例一
[0019] 1.牛a -actin基因262启动子片段内部170bp①核酸片段的克隆
[0020] 以本实验室已经构建好的阳性重组质粒pGL3_a -actin262为模板，利用设计好 的引物（表1)对牛a-actin基因262启动子片段中转录位点上游-224bp至-55bp之间含 有多个SRE调控元件的序列进行PCR扩增，获得了170bp的核酸序列，并将此序列命名为： a -actinl70①。其中a -actinl70①中含有Kpnl、BamHI双酶切位点。PCR反应程序为： 94°C预变性5min，94°C变性30s，退火30s，72°C延伸，共35个循环；72°C终延伸lOmin，降温 至4°C保存。
[0021]表1 PCR扩增a-actinl70①的引物
[0022]
【主权项】
1. 一个牛α-actin基因的启动子及其应用，其特征在于牛α-actin基因262bp启动 子片段内部一段含有3个SRE正调控元件的170bp的核酸序列，将其使用不同引物进行PCR 扩增，得到2个170bp的核酸序列，将2个170bp的核酸序列串联于262bp启动子片段的上 游，g卩170bp-170bp_262bp，构建成一个a- actin基因的启动子片段，其核苷酸序列如Seq ID No :1 所示。
【专利摘要】一个牛α-actin基因的启动子及其应用，属于遗传工程技术领域，其特征在于牛α-actin基因262bp启动子片段内部一段含有3个SRE正调控元件的170bp的核酸序列，将其使用不同引物进行PCR扩增，得到2个170bp的核酸序列，将2个170bp的核酸序列串联于262bp启动子片段的上游，即170bp-170bp-262bp，构建成一个α-actin基因的启动子片段，其核苷酸序列如Seq ID No：1所示。该启动子具有较强的启动活性和骨胳肌特异性，同时，在牛骨胳肌卫星细胞中能够显著提高α-actin基因的表达活性，可以作为高效特异性的骨骼肌启动子应用于提高肌肉产量的转基因肉牛生产。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-85
【公开号】CN104651365
【申请号】CN201510063159
【发明人】严云勤, 佟慧丽, 李树峰, 胡倩, 赵丹丹, 李光鹏, 张伟伟
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月29日