125yL，收集停留时间为24.Imin的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本 发明所述的黄酮类化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶 柱层析纯化可得纯品。
[0026] 实施例2
[0027] 晾晒烟样品来源于云南楚雄，为大姚赵户冲烟，将烟草取样3. 5kg切碎，以95% 的乙醇提取3次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏140g。浸膏 用重量比2. 0倍量的纯甲醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，0. 9kg的200目硅胶装柱 进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8 :2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，将 其中用体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用15:1~2:1的一系列氯仿-丙 酮溶液进行梯度洗脱（例如15:1、10:1、8:1、5:1、4:1、2:1)，其中，上述4:1洗脱梯度洗脱 液继续用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以56%的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C18 (21. 2X250mm，5ym)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波 长为364nm，每次进样100yL，收集停留时间为24.Imin的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本 发明所述的黄酮类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用甲醇溶液溶解，再以甲醇 溶液为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该新化合物。
[0028] 实施例3
[0029] 取实施例1制备的化合物，为橘黄色粉末。
[0030] 本发明所制备的新型黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发 明化合物为橘黄色粉末；紫外光谱（溶剂为甲醇），Xmax(loge)210(4. 18)，254(3. 69)， 3364(3.58)_;红外光谱（溴化钾压片）丫 1^ 3454,2927，1710，165〇，1 610，1536，1455， 1376,1236,1176,1068,946,818CHT1;高分辨质谱（HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 391. 1166 [M+Na] + (计算值391. 1158)。结合1H和13CNMR谱给出分子式C21H2tlO6，不饱和度为 12。紫外、红外和核磁数据（表1)表明，该化合物可能是一个黄酮类化合物。1HNMR和13C NMR谱（表1)显不显不21个碳原子和20个质子信号（表-1)，包括：一个1，4-二取代的 苯环、一个1，2, 3, 4, 5-五取代的苯环、一个异丁酰基、二个甲氧基、一个酚羟基、一个羰基 和一组双键；其中两个苯（C-5~C-IO和C-I'~C-6')、羰基（C-4)和双键（C-2和C-3) 构成了黄酮的骨架。黄酮的母体骨架确定后，剩余的信号：一个异丁酰基、二个甲氧基、一个 酚羟基则为黄酮的取代基。根据两甲氧基氢信号与C-7和C-4'的HMBC相关（图-3)可证 实两甲氧基分别取代在黄酮骨架的C-7和C-4'位，根据H-2"和C-8的HMBC相关可证实异 丁酰基取代在C-8位；根据酚羟基信号与C-5,C-6和C-7的HMBC相关，可证实酚羟基信号 取代在C-6位。至此，本化合物的结构得以确定。
[0031] 实施例4
[0032] 取实施例2制备的化合物，为橘黄色粉末。测定方法与实施例3相同，确认实施例 2制备的化合物为所述的黄酮类化合物一一4'，7-二甲氧基-6-羟基-8-异丁酰基黄酮。
[0033] 实施例5
[0034] 取实施例1~2制备的任一黄酮类化合物进行抗轮状病毒活性试验，试验情况如 下：
[0035] 抗轮状病毒采用体外细胞测试法，即样品与病毒同时作用于猴胚胎肾细胞（缩写 为MA104细胞）后，通过Alarmablue法检测样品对病毒感染致细胞死亡的保护作用，从而 测定样品对HRV的活性作用。
[0036] (a)黄酮类化合物的细胞毒性检测
[0037]MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的黄酮类化合 物溶液，继续培养3天后，更换含Alamarblue的培养液，继续培养2~3小时后检测其 530/590nm处的荧光值，从而检测黄酮类化合物对MA104细胞的毒性，并计算半数细胞毒性 浓度（TC5tl)。
[0038] (b)黄酮类化合物抗轮状病毒作用检测
[0039]MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，将100倍的细胞半数感染量 (缩写为100TCID50)的病毒液和不超过20%细胞毒性的梯度浓度黄酮类化合物溶液同时 加到MA104细胞上，继续培养4-6天后，更换含Alamarblue的培养液继续培养2~3小时 后检测其530/590nm处的荧光值，并计算半数抑制浓度（IC5tl)。
[0040] (C)根基TC5Q/IC5Q计算化合物的治疗指数。
[0041] 结果表明，本发明化合物的其TC5tl值为176. 3yg/mL、IC5tl值为7.87yg/mL，治疗 指数TI为22. 4 ;其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数19. 16 ;化合物具有很好的抗轮状 病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。 本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状 病毒药物制剂研发。
【主权项】
1. 一种黄酬类化合物，该化合物命名为4'，7-二甲氧基-6-哲基-8-异了酷基黄酬，其 分子式为〔2化。〇6,且具有下述结构：2. -种权利要求1所述的黄酬类化合物的制备方法，其包括W下步骤： a. 制备烟草提取物浸膏；W烟草叶片为原料，将其粉碎并用第一溶剂浸泡并提取所述 烟草2~4次，每次1化~72h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其 中所述第一溶剂是选自甲醇、己醇或丙酬的有机溶剂与水的混合物，其中有机溶剂占该第 一溶剂的60wt%~lOOwt%，且第一溶剂；烟草=1.5~4:1，重量比； b. 硅胶柱层析；将上述烟草提取物浸膏用选自纯甲醇、纯己醇或纯丙酬的第二溶剂溶 解后与为烟草提取物浸膏的1~1. 6重量倍的60~120目硅胶拌样，将拌样后的混合物再 与为烟草提取物浸膏的2~5重量倍的160~300目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比 依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集其中用 体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液 用硅胶层析柱继续分离，用15:1、10:1、8:1、5:1、4:1、2:1的氯仿-丙酬溶液进行梯度洗脱， 将其中体积为4:1的氯仿-丙酬溶液洗脱时得到的洗脱液称为第二洗脱液。 C.高压液相色谱分离；将上述第二洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液 相色谱采用21. 2mmX250mm，5ym的色谱柱，流动相为56wt%的甲醇水溶液，流动相流 速为12mL/min，紫外检测器检测波长为364nm，第二洗脱液液每次进样60~150yL收集每 次进样后色谱峰保留时间为24.Imin时所对应的洗脱液，称为第=洗脱液，将该第=洗脱 液脱除溶剂后即得所述黄酬类化合物。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述高压是指使用时压力在5-15MPa的反相制备 色谱。4. 根据权利要求2所述的方法，其还包括W下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相 色谱分离之后得到的所述黄酬类化合物再次溶于甲醇溶液，并W甲醇溶液为流动相，通过 凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述黄酬类化合物。5. 根据权利要求1所述的黄酬类化合物在制备抗轮状病毒药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种结构新颖的黄酮类化合物，该化合物命名为4',7-二甲氧基-6-羟基-8-异丁酰基黄酮，其分子式为C21H20O6，且具有下述结构。本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对轮状病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构新颖，且具有较好的抗毒活性，可作为抗轮状病毒的先导化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
【IPC分类】C07D311/40, A61P31/14, C07D311/30
【公开号】CN104926772
【申请号】CN201510380946
【发明人】刘志华, 申钦鹏, 刘春波, 缪明明, 杨光宇, 张凤梅, 何沛, 司晓喜, 苏钟璧, 陈永宽, 朱瑞芝, 王昆淼
【申请人】云南中烟工业有限责任公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月2日