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[0019] 本发明基于PCR的方法分离克隆了 β-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C，DNA全序列分析 结果表明，去除内含子后的β-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C cDNA全长2202bp〇其中，信号肽 的喊基序列为：
[0020] atgggtatcttcggtctcgcattgctggccgccgcggccattgcccgggcc(SEQ ID NO. 6)〇
[0021] 成熟的β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3C的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0022] SEQ ID NO. 5
[0023] gcgcctaactgccctgtggtgccccgccaggcatcgggcaccgctgcttgggatacggcgtacgcctcg gccagagccgccgtggcccggctttcccagcaggacaagatcaacattgtcaccggtatcggttgggagaggggccc ttgcgtcggcaacacggcgcccgtcaactccatcggctatcctcagctctgcctccaggacggtcccttgggtattc gcttcgccacgggcacgaccgcttttacccccggtgttcaggcggcgtccacctgggatgttgacctgatccgccag cgtggtgagtacctgggcgcagaggctcgtgctgtcggtgttcacgtgctgctgggtcctgtggccggcgccctcgg caagattcctcatggtggacgcaactgggagggtttcggctcggacccgtacctcgcgggtatctgcatggctgaga ccatcgaggccattcagtcccagggtgtccaggcctgcgccaagcactacattgtcaacgagcaggagtggatgcgt gagacgatgagcagcaatgtcgacgaccgcaccatgcacgagatttacctgtggcccttcgccgatgccgctcactc caacgtggccagcttcatgtgcagctacaacaagatcaacggcacctgggcctgcgagagcgacagcgtccagaaca agcttcttaagcaggagctcggcttccgcggctacatcatgagcgactggaacgcccagcacaccaccgtcggctcc gccaacagcggcatggacatgaccatgcccggcaccgacttcagcggcggcaacgtgctctggggcccgcagctcaa caatgccgtcaactcgggccaggtttcgcgcgcccgtctcgacgacatggccacccgcatcctcgccgcctggtacc tggtcggccaggacaagggctacccgcaggtcaacctccgcctcaacgtccagggcaaccataaggagaacgtgcgc gctgtggctcgcgacggcatcgttctgctccgcaacgagggcaacatcctcccgctcggccgcccgtctcgcatcgc agtcgtcggctctggtgccgtcatcggccgccacgcccagaacggctgccaggacaagggctgcaacgacggtgccc tcggcatgggctggggctccggttccgtcaactacccctacttcgtcgccccctatgacgccatccgcgagcgcgcc agccgcgatggcacccaggtttctctccacagctccgacaacaccaacggcgtccagaacgttgtccagggcgccga cgtcgccatcgtcttcatcacggccgactcgggcgagggttacatcaccgtcgagggccaccccggcgaccgcaacc acctcgacccctggcacaacggcaaccagctcgtgcaggcggtggccgcggccaacaagaacaccatcgtcgtggtg cacagcacgggccccatcatcctcgagaccatcctcaacacgcccggcgtccgcgctgtcgtctgggccggtctgcc cagccaggagaacggcaacgccattgtggatatcctctacggctcgacctcgccgtcgggtaagctcgtgtacacca tcgccaagcgccctgaggattacggcgtcagcatcgttcgcggcgatgacaacttccgtgagggcgtgtttgtggac taccgctggttcgaccagaacaacatcgagccgcgcttcgagttcggcttcggcttgtcctacaccaacttcageta ctccggcctctccatcacctccaacgcgcgcgccggcccggccacgggcccaaccatccccggcggccccgccgacc tgtgggagacggtcgccaccgtcaccgcccagatcaccaacacgggcggcgtcgccggcgccgaggtcgcccagctc tacctcaccctgccgccgactgccccgcccgccggcccgcgtcagetccgcggcttcaccaagctcaagctccagcc cggccagaccggcacggccacgttcaagctccgcaagagggatctcagctactgggatgtcggccggcagcagtggg ttgtcccttcgggcaggtttacgattagtgtcggtgctagctcgagggatattcggttgacgggcagcattgatgtt tga
[0024] 成熟蛋白理论分子量为78. 4kDa，将β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C成熟编码序列及 推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定HiBgl3C是一种新的β -葡萄糖 苷酶。
[0025] 本发明提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C的重组载体，选为 pPIC-Hibgl3C。将本发明的β -葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将本发明的β -葡萄糖苷酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性 酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质 粒pPIC9-Hibgl3C。
[0026] 本发明还提供了包含上述β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C的重组菌株，优选所述菌 株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株Hibgl3C。
[0027] 本发明还提供了一种制备β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3C的方法，包括以下步骤：
[0028] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0029] 2)培养重组菌株，诱导重组β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3C表达；
[0030] 3)回收并纯化所表达的β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3C。
[0031] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选 将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichia pastoris)GS115,得到重组菌株GS115/ Hibgl3C。
[0032] 本发明还提供了上述β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的应用。
【附图说明】
[0033] 图1 β -葡萄糖苷酶的最适pH。
[0034] 图2重组β -葡萄糖苷酶的pH稳定性。
[0035] 图3重组β -葡萄糖苷酶的最适温度。
[0036] 图4重组β _葡萄糖苷酶的热稳定性。
【具体实施方式】
[0037] 试验材料